Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

INFLUENCE OF PHYSICAL AND CHEMICAL PARAMETERS ON PROCESS OF THE IMMOBILIZATION OF BACTERIAL CELLS ERWINIA RHAPONTICI

Божко О.Ю., Корнеева О.С.
The immobilization of the Erwinia rhapontici bacterial cells producents isomaltulosesyntase pherments, which catalised the biotransformation sucrose to isomaltulose process into structure of the poly-N-vinylpyrrolidone. It is established that activity of immobilizational cells is comparable to value that native cells. Optimum conditions of immobilization was determine. Keywords: immobilization, bacteria Erwinia rhapontici isomaltulose, isomaltulosesynthase, poly-N-vinylpyrrolidone

Факультативно-анаэробные бактерии Erwinia rhapontici являются продуцентами высокоактивного фермента изомальтулозосинтазы, катализирующего реакцию изомеризации сахарозы в изомальтулозу ‒ природный заменитель сахара [1, 2]. Изомальтулоза отличается рядом преимуществ по сравнению с известными сахарозаменителями, а именно: имеет чистый сладкий вкус, низкую калорийность
(2,0 ккал/г), низкий гликемический индекс (32 единицы), некариогенна, обладает пребиотическим действием, устойчива к изменениям температуры и рН. За рубежом изомальтулоза широко применяется в пищевой и фармацевтической промышленности как заменитель сахарозы. В России разработаны концептуальные аспекты биотехнологии изомальтулозы с помощью фермента бактериального происхождения [3, 4].

С целью разработки конкурентоспособной технологии натурального сахарозаменителя целесообразным является исследование процесса иммобилизации бактериальных клеток Erwinia rhapontici. Известно, что использование иммобилизованных клеток в биокаталитических системах имеет много преимуществ, которые обеспечивают высокую экономичность и эффективность применяемых технологий. Так, разработка метода иммобилизации клеток с целью получения изомальтулозы позволит интенсифицировать процесс трансформации сахарозы, использовать фермент многократно, увеличить его исходную активность, увеличить выход изомальтулозы, а также снизить энергетические затраты процесса.

В настоящей работе представлены результаты исследования условий иммобилизации бактериальных клеток Erwinia rhapontici в структуру поли-N-винилпирролидона. Интерес к данному полимеру вызван тем, что поли-N-винилпирролидон способен осаждаться из водных растворов в физиологическом интервале температур (32-37°С). Также следует отметить его биосовместимость, нетоксичность, способность растворяться в воде и большинстве органических растворителей, способность к комплексообразованию. Указанные свойства позволяют применять поли-N-винилпирролидон для иммобилизации ферментов и живых клеток.

Цель исследования ‒ изучение процесса иммобилизации бактериальных клеток Erwinia rhapontici ‒ продуцентов фермента изомальтулозосинтазы в структуру поли-N-винилпирролидона.

Материал и методы исследования

Объектом для иммобилизации служили факультативно-анаэробные бактерии Erwinia rhapontici штамм В-9292 (ВКПМ, г. Москва). Для поддержания и выращивания E. rhapontici использовали мясо-пептонный агар. Культивирование бактерий проводили на среде следующего состава (г/ дм3): пептон ‒ 10; дрожжевой экстракт ‒ 5; NaCl ‒ 10; сахароза ‒ 40. Культуру выращивали в периодических условиях в течение 3 суток при температуре 28-30°С при рНисх 7,0±0,1. Клетки осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 15 минут, промывали трис-HCl буфером 0,05 М, рН 6,0. Об активности фермента судили по изменению концентрации изомальтулозы, полученной в результате трансформации сахарозы, и выражали в ед/см3. Количество изомальтулозы определяли по методу Сомоджи-Нельсона [5]. За единицу активности принимали количество фермента, которое образует 1 мкМ изомальтулозы за 1 минуту. Для иммобилизации использовали живые клетки бактерий. Процесс иммобилизации проводили следующим образом: в двухгорлую колбу, снабженную механической мешалкой, помещали 50 см3 раствора поли-N-винилпирролидона (0,5 %) в ацетатном буфере и медленно при интенсивном перемешивании и комнатной температуре с помощью перистальтического насоса прибавляли дисперсию бактериальных клеток в количестве 0,05 г. После этого смесь выдерживали при интенсивном перемешивании в течение 3 ч при комнатной температуре. Полученную дисперсию использовали в процессе трансформации сахарозы в изомальтулозу.

Динамику биотрансформации сахарозы изучали при оптимальных условиях для работы фермента изомальтулозосинтазы ‒ рН 6,0, температура 30°С в течение 3-4 ч.

Для изучения влияния рН и температуры на активность изомальтулозосинтазы иммобилизованных клеток трансформацию сахарозы осуществляли в интервале рН 4,0-8,0 и температуры 20-40°С соответственно. Заданное значение рН субстрата поддерживали с помощью ацетатного буфера в зоне рН 4,0-5,0 и фосфатного в зоне рН 6,0-8,0.

Поли-N-винилпирролидон использовали производства ОАО «Оргполимерсинтез СПб» (г. Санкт-Петербург). Для проведения иммобилизации клеток были синтезированы полимеры N-винилпирролидона с различной молекулярной массой (500-3000 кДа). Оценку эффективности процесса иммобилизации бактериальных клеток проводили с использованием метода ИК-спектроскопии.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенных исследований разработан метод иммобилизации бактериальных клеток Erwinia rhapontici в структуру поли-N-винилпирролидона. Метод основан на взаимодействии раствора полимера в ацетатном буфере (рН 6,0) с водной дисперсией живых клеток.

Из литературных данных следует, что иммобилизацию живых клеток и ферментов на полимерные носители следует проводить при низких концентрациях полимера [6]. Использование концентрированных растворов приводит к блокированию активных центров ферментов и, следовательно, к утрате их активности. Нами проводилось исследование процесса иммобилизации бактериальных клеток в полимерный носитель при концентрациях последнего в области 0,025-0,35 мас. %.

 p

Рис. 1. Эффективность процесса иммобилизации бактериальных клеток в зависимости от концентрации полимера. СТ ‒ степень трансформации сахарозы

Как видно из рис. 1, увеличение концентрации полимера приводило к заметному снижению активности иммобилизованных клеток. Оптимальной концентрацией является 0,1 мас. %. При этой концентрации полимерные клубки находятся в индивидуальном состоянии, что способствует лучшему их взаимодействию с бактериальными клетками. В случае исследования более концентрированных растворов полимера последние находятся в виде агрегатов клубков, и клетка помещается в агрегат. Это приводит к снижению активности фермента изомальтулозосинтазы. Концентрация клеток по отношению к концентрации полимера составляла 1:1 по массе.

С целью определения продолжительности процесса иммобилизации клеток смесь выдерживали в течение 4-5 ч и контролировали активность фермента изомальтулозосинтазы через определенные промежутки времени. Установлено, что максимальный выход изомальтулозы (92-95 %) наблюдался при условии продолжительности контакта бактериальных клеток с носителем в течение 3 ч. Кроме этого, изучено влияние температуры и рН на процесс иммобилизации (рис. 2 а, б).

 p

Рис. 2 а. Зависимость эффективности процесса иммобилизации от температуры

 p

Рис. 2 б. Влияние кислотности среды на процесс иммобилизации бактериальных клеток

Как видно из рисунков, оптимальными условиями являются температура 22°С и рН 6,0 соответственно. Исследование активности фермента показало, что при данных значениях температуры и рН выход изомальтулозы был максимальным.

Следующим этапом работы явилось изучение влияния молекулярной массы поли-N-винилпирролидона на процесс иммобилизации бактериальных клеток. Исследования показали, что оптимально иммобилизация протекает при молекулярном весе полимера 500 кДа (рис. 3). Предположительно, именно при данном значении молекулярной массы поли-N-винилпирролидона происходит взаимодействие отрицательно заряженной мембраны клетки и положительно заряженных протонов в гидратной оболочке макромолекулы полимера.

 p

Рис. 3. Влияние молекулярной массы поли-N-винилпирролидона на процесс биотрансформации. СТ ‒ степень трансформации сахарозы

Выводы и заключение

В результате проведенных исследований изучено влияние физико-химических параметров на процесс иммобилизации бактериальных клеток Erwinia rhapontici с целью получения природного сахарозаменителя. Установлено, что выход изомальтулозы достигает максимального значения при концентрации полимера 1 мг/см3, молекулярном весе 500 кДа, температуре 22 °С, рН 6,0, продолжительности 3,0 ч.

Полученные данные в дальнейшем будут положены в основу биотехнологии изомальтулозы в промышленных масштабах.

Работа выполнялась в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы, государственный контракт № П1333 от 11.06.2010 г.

Список литературы

  1. Kawaguti H.Y. Application of response surface methodology for glucosyltrasferase production and conversion of sucrose into isomaltulose using free Erwinia sp. cells / H.Y. Kawaguti, E. Manrich, H.H. Sato // Electronic J. Biotechnology. ‒ 2006. ‒ V. 9, №5. ‒ P. 482-493.
  2. Klebsiella singaporensis sp. a novel isomaltulose-producing bacterium / X. Li [et al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. ‒ 2004. ‒ V. 54. ‒ P. 2131-2136.
  3. Корнеева О.С. Биотехнология изомальтулозы ‒ природного заменителя сахара с пребиотическими свойствами / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко, Г.П. Шуваева // Биотехнология. ‒ 2008. ‒ № 2. ‒ С. 46-50.
  4. Корнеева О.С. Физиолого-биохимические свойства бактерий Erwinia rhapontici ‒ продуцентов изомальтулозосинтазы / О.С. Корнеева, О.Ю. Божко, З.М. Мангуева // Прикладная биохимия и микробиология. ‒ 2008. ‒ Т. 44, № 6. ‒ С. 626-631.
  5. Somogyi M.J. Determination of reducing sugar // J. Biol. Chem. ‒ 1952. ‒ V. 195. ‒ P. 19-23.
  6. Кирш Э.Ю. Поли-N-винилпирролидон и другие поли-N-виниламиды. Синтез и физико-химические свойства. ‒ М.: Наука, 1998. ‒ 252 с.

Рецензенты:

Грабович Маргарита Юрьевна, д.б.н., доцент, профессор кафедры биохимии и физиологии клетки ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет» Минобразования и науки РФ;

Полянский Константин Константинович, д.т.н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, профессор кафедры технологии производства и переработки продукции животноводства ФГОУ ВПО «Воронежский аграрный университет имени К.Д. Глинки» Минсельхоза РФ.