Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

Influence abiotic factors on transfor Vibrio cholerae to nonculturable form

Николеишвили Л.Р., Подосинникова Л.С.
It was shown that complex abiotic factors increase transfer Vibrio cholerae to nonculturable form.
По мнению многих исследователей (1, 2), для холерных вибрионов, как возбудителей кишечной инфекции, пребывание во внешней среде является неизбежным и «носит не случайный характер», а обусловлено взаимоотношениями микро - и макроорганизма.

Обнаружение некультивируемого состояния (НС) у бактерий обусловило необходимость нового подхода к анализу экологических и молекулярно-генетических механизмов существования возбудителей инфекций в природе.

Знание этих механизмов необходимо для оценки факторов, обеспечивающих микроорганизмам существование в качестве естественных компонентов природных биоценозов, что, в свою очередь, будет способствовать пониманию природы эндемичности и резервации патогенных бактерий в межэпизоотические (межэпидемические) периоды.

Считается, что переход бактерий в НС является ответом на ухудшение условий обитания. К основным факторам индуцирующим переход в НС бактерий исследователи относят понижение температуры в среде обитания и условия голодания (4, 7, 9).

В связи с важностью изучения экологических аспектов перехода холерных вибрионов в некультивируемое состояние особого внимания заслуживают работы, посвященные роли биотических и абиотических факторов водоёмов в этом процессе. Имеются сведения о переходе вибрионов, в том числе холерных, в некультивируемую форму (НФ) в условиях пониженной (+4 ºС) и повышенной (37 ºС) температуры (3,8), получены НФ холерных вибрионов в голодной среде, морской, речной воде и некоторых других модельных системах (5,6).

Цель настоящей работы - изучение раздельного и комплексного влияния некоторых абиотических экологических факторов: температуры, освещенности и различной солености среды на переход в некультивируемое состояние токсигенных и нетоксигенных холерных вибрионов.

Материалы и методы. В работе было использовано 9 типичных по родовым и видовым свойствам ctx+ и ctx- штаммов V. cholerae О1 и О139 серогруппы. Для получения НФ конструировали микрокосмы на основе автоклавированной речной, морской (Азовского и Черного моря) воды. В качестве контроля использовали дистиллированную воду и 0,85% NaCl. Для облегчения визуального контроля морфологии и подсчета клеток под микроскопом концентрацию холерных вибрионов доводили средой культивирования до 109 кл/мл. Пробы содержали при температуре 4-6 и 8-10 0 С без освещения и в условиях постоянной искусственной освещенности в 300 люкс.

Высевы на агаровые среды производили ежедневно в течение 30 дней, затем раз в неделю и в месяц. Некультивируемыми считали вибрионы в пробе, в высевах из которой на агаровых средах не обнаружено выросших колоний, но витальными методами окрашивания выявлены живые бактериальные клетки или ПЦР методом - ДНК ctx гена при культивировании токсигенных штаммов.

Полученные материалы проанализированы с учетом влияния на скорость перехода холерных вибрионов в НС раздельного и сочетанного действия двух и более факторов.

Результаты и обсуждение

Использование в экспериментах разного температурного режима содержания микрокосм показало, что наиболее быстрый переход холерных вибрионов в НС происходил при температуре 4-6 0С, как при постоянном искусственном освещении, так и без него.

В микрокосмах с речной водой при температуре 4-6 0С без искусственного освещения штаммы V. cholerae О1 переходили в НС через 12 - 15 суток, V. cholerae О139 - в период от 30 до 50-60 суток. В микрокосмах с водой Азовского моря НФ холерных вибрионов О1 серогруппы получены в течение 60 суток, а О 139 серогруппы - 75-90. В воде из Черного моря в тех - же условиях штаммы V. cholerae О1 переходили в НС в более поздние сроки (90 - 150 суток), а холерные вибрионы О139 серогруппы в течении 180 суток сохраняли жизнеспособность (срок наблюдения). В 0,85% растворе NaCl время перехода в НС колебалось у V. cholerae О1 от 30 до 40, а у холерных вибрионов О139 серогруппы - от 40 до 75 суток. В дистиллированной воде штаммы V. cholerae О1 переходили в НС через 30 - 40 суток, а холерные вибрионы О139 серогруппы в среднем через 45 суток, однако имели место и более поздние (до 120 суток) сроки.

В условиях постоянного искусственного освещения в микрокосмах с речной водой при температуре 4-6 0С время перехода в НС, в отличие от аналогичных микрокосм без освещённости, было значительно более продолжительным и составило для V. cholerae О1 90 суток, а для холерных вибрионов О139 серогруппы - 120-180 суток. В микрокосмах с водой Азовского моря V. cholerae О1 переходили в НС через 120 суток, а холерные вибрионы О139 серогруппы - в течение 100-150. В воде Чёрного моря V. cholerae О1 в течение 190-210 суток сохраняли жизнеспособность, а холерные вибрионы О139 серогруппы переходили в НС через 120 - 270 суток. Аналогичная тенденция отмечена и для проб с 0,85% раствором NaCl, где при постоянном искусственном освещении V. cholerae О1 переходили в НФ через 120-130 суток, а холерные вибрионы О139 серогруппы - 120 - 150 суток. В дистиллированной воде время перехода в НС V. cholerae О1, так же, как и без освещения, колебалось в пределах 30 - 45 суток, а холерных вибрионов О139 серогруппы - 60 суток.

Повышение температуры культивирования до 8-10 0С также выявило увеличение сроков перехода в НС холерных вибрионов во всех микрокосмах кроме дистиллированной воды.

Культивирование холерных вибрионов при 8-10 0С без искусственного освещения в микрокосмах с речной водой показало, что штаммы V. cholerae О1 переходили в НС через 150 - 180 суток, а холерные вибрионы О139 серогруппы - 240 - 300 суток. В микрокосмах с водой из Черного моря V. cholerae О1 и холерные вибрионы О139 серогруппы образовывали в НФ через 210 - 230 суток, в 0,85% растворе NaCl V. cholerae О1 - через 75 - 80 суток, а холерные вибрионы О139 серогруппы -114 - 120 суток. В дистиллированной воде V. cholerae О1 и V. cholerae О139 переходили в НС через 30 - 40 суток.

Освещение микрокосм и при 8-10 0С значительно увеличило время перехода холерных вибрионов в НС во всех средах за исключением дистиллированной воды. Так, при культивировании микрокосм с речной водой в условиях освещения при температуре 8-10 0С V. cholerae О1 переходили в НС через 240 - 260 суток, а холерные вибрионы О139 серогруппы - 290 - 360 суток. В микрокосмах с водой из Черного моря V. cholerae О1 переходили в НС через 275-280, а О139 серогруппы - через 280 - 340 суток. В 0,85% растворе NaCl время перехода V. cholerae О1 занимало 240 - 260 суток, а для холерных вибрионов О139 серогруппы составило 250 - 270 суток. Скорость перехода холерных вибрионов в НС при 8-10 0С в дистиллированной воде практически не изменилась: V. cholerae О1 переходили в НС через 28 - 45 суток, а холерные вибрионы О139 серогруппы - через 30 суток.

Таким образом, несмотря на наиболее короткие сроки перехода при температуре 4-6 0С холерных вибрионов в НС выявлено влияние на их продолжительность освещенности и состава среды. Например, в микрокосмах речной воды, соленость которой гораздо ниже, чем из Черного моря, при постоянном искусственном освещении время перехода V. cholerae О1 в НС оказывается в 6,8, а V. cholerae О139 - в 3,7 раза больше, чем без неё. В микрокосмах с водой Азовского моря освещённость в среднем в 1,7 раза увеличивала эти сроки, а в воде из Черного моря - в 1,2 раза. При культивировании холерных вибрионов в 0,85% растворе NaCl, сроки перехода в НС в условиях освещенности увеличивались в 2,3 раза. В дистиллированной воде влияния освещённости на переход холерных вибрионов в НС не выявлено, ни при 4-6, ни при 8-10 0С.

В условиях микрокосм с различной соленостью среды, температурой содержания и освещенностью не выявлено зависимости перехода в НС холерных вибрионов от их токсигенности. Обнаружено лишь различие в скорости образования НФ холерными вибрионами разных серогрупп. Различия в скорости перехода в НС V.cholerae О1 и О139 особенно выражены в микрокосмах с морской и речной водой. Так например, V. cholerae О1 в микрокосмах с речной водой без освещения в 3,1 раза быстрее переходили в НС, чем V. cholerae О139, в условиях освещенности сроки перехода в НС у V. cholerae О139 увеличились в 1,2 - 1,7 раза (Рисунок).

В микрокосмах с водой из Чёрного моря продолжительность сохранения в культивируемом состояний V. cholerae О139 серогруппы была в 1,7 раза больше, чем у V. cholerae О1. При искусственном освещении у V. cholerae О1 переход в НФ в воде из Черного моря не зарегистрирован, а сроки образования НФ у V. cholerae О139 были более продолжительными чем без освещения.

Получение в экспериментальных экосистемах НФ холерных вибрионов под действием нескольких факторов, характеризующих природные экосистемы, выявило достоверно значимое влияние на скорость процесса как каждого из изученных факторов, так и совместного их действия в различных сочетаниях.

Из четырех изученных микрокосм с различным солевым составом среды в условиях без искусственной освещенности при 4-6 ºС в трех (кроме морской воды, характеризующейся более высоким, чем в остальных микрокосмах, содержанием солей) холерные вибрионы переходили в НС в одинаковые сроки. Освещенность этих же микрокосм увеличивала сроки перехода в НС холерных вибрионов во всех четырех микрокосмах: в 0,85% растворе NaCl в - 2,3 раза, в речной воде в 4,1 раза и в воде Азовского моря - в 1,7 раза. В морской воде, при искусственном освещении НФ V. cholerae О1 не были получены, в отличие от аналогичных микрокосм без освещения, где холерные вибрионы перешли в НС в течение 190-210 суток.

При температуре 8-10 0С в тех же микрокосмах без искусственного освещения сроки перехода в НС удлинялись: в речной воде - в 7,4 раза, в 0,85% растворе NaCl - в 1,8 раза и в морской воде в - 1,6 раза. Искусственное освещение в условиях этой температуры еще более увеличило сроки перехода в НС холерных вибрионов: в 0,85% растворе NaCl в 2,8 раза, в речной воде в 1,3 раза и в воде Черного моря - 1,3 раза.

Таким образом, сроки перехода в НС холерных вибрионов увеличивало как повышение температуры содержания микрокосм (1,6 -7,4 раза), так и искусственная их освещенность (1,3- 2,8 раза), что в сочетанном их влиянии оказывалось еще более выраженным (2,0 - 9,8 раза).

Зависимость образования НФ холерных вибрионов от солености сред, выразилась в более продолжительных (1,8 - 3,7 раза) сроках формирования НФ холерных вибрионов как при 4-6 0С без освещения во всех средах, содержащих микроэлементы, так и при 8-10 0С (2,8 - 6,4 раза). Сочетанное влияние среды микрокосм с повышением температуры их содержания и с искусственной освещенностью еще более (7,7 раза) увеличило сроки формирования НФ холерных вибрионов.

Наиболее продолжительным оказался период перехода в НС в микрокосмах с водой из Черного моря, характеризующейся наибольшим по сравнению со средами других микрокосм, даже водой Азовского моря, содержанием солей. Очевидно, сложный или более разнообразный минеральный состав воды Черного моря по сравнению с другими экспериментальными экосистемами способствует более продолжительному сохранению холерных вибрионов в культивируемом состоянии, имеющих в основном прототрофный тип питания, что может косвенно свидетельствовать о значении минерализации среды в поддержании культивируемого состояния вибрионов.

На скорость образования НФ холерных вибрионов в дистиллированной воде не влияли ни освещенность, ни температура содержания, что, очевидно, связано с минимальным содержанием в этой среде солей и увеличении питательного субстрата только в результате гибели и распада вибрионов.

Таким образом, низкие температуры, являющиеся основным фактором, запускающим переход холерных вибрионов в НС, в зависимости от состава экосистем реализуют индуцирующее действие в различные сроки. В дистиллированной воде, не содержащей солей и других факторов, влияющих на продолжительность сохранения холерных вибрионов в культивируемом состоянии, повышение температуры содержания микрокосм с 4-6 0С до 8-10 0С не удлиняло сроки перехода их в НС. Оценивая значимость экспериментальных данных о влиянии температуры на переход холерных вибрионов в НС, следует учитывать, что зимой с понижением температуры поверхностные холодные воды с температурой ниже 4 oС располагаются над сравнительно теплыми. По всей вероятности среда с температурой 4-5 oС является пограничной зоной в формировании некультивируемых форм у микроорганизмов, что коррелирует с получением экспериментальных НФ именно при этой температуре (5,6).

Список литературы

  1. Бароян О.В., Бургасов П.Н., Гайлонская И.Н., Мединский Г.М. Экология холерных вибрионов. //Вест. - АМН. - 1975, - №2, - С.45-53.
  2. Литвин В.Ю. Холера как природно-очаговая сапронозная инфекция //Журн. микробиол, эпидемиол. и иммунобиол. - 1995. - №6 - С. 30-31.
  3. Подосинникова Л.С., Соколенко А.В., Чепкова Е.А. и др. Экспериментальное получение и характеристика некультивируемых форм холерных вибрионов //Пробл. Комиссия «Холера и патоген. для человека вибрионы. Ростов н/Д, 1999. Вып. 12. - С. 13-14.
  4. Романова Ю.М., Чегаева Е.В., Гинцбург А.Л. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий: известные и возможные факторы индукции обратимого процесса. //Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 1998. - №3. - С.3-8.
  5. Савельев В.Н., Грижебовский Г.Н., Брюханов А.Ф. Некультивируемые формы холерного вибриона и их эпидемиологическое значение //Пробл. комиссия «Холера и патоген. для человека вибрионы». Ростов н/Д, 2001.- №14. - С.24-26.
  6. Соколенко А.В. Морфология, ультраструктура, метоболизм некультивируемых форм холерных вибрионов.: Автореф. дис....канд. биол. наук. -Ростов н/Д., 2000.- 18с.
  7. Colwell R.R., Brayton P.R., Grimes D. I. et al. Viable but non-culturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment: implication for release of genetically engineered microorganisms //BioTechnology.- 1985. - Vol.3. - P.817-820.
  8. Oliver J.D., Bockian R. In vivio resuscitation and virulence towerdes mice, of viable but nonculturable cells of Vibrio vulnificus //Appl. Envirion. Microbiol. - 1995. - Vol.61. - №7. - P. 2620-2627.
  9. Roszak D.B., Colwell R.B. Survival strategies of bacteria in the natural environment //Microbiol. Rev.-1987.-Vol.51.№3. - P.365-379.