Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Высокая токсичность тяжелых металлов (ТМ) обусловливает внимание исследователей к загрязнению ими компонентов окружающей среды. Известно, что значительную роль в процессах миграции ТМ играют растения. Аккумуляция ТМ может приводить к развитию в их клетках окислительного стресса, сопряженного с избыточной генерацией активных форм кислорода (АФК). К числу последних относят производные кислорода радикальной природы (супероксид-радикал (анион-радикал) О₂^•-, гидроперекисный радикал НО₂^•, гидроксил-радикал НО^•), а также его реактивные производные (перекись водорода Н₂О₂, синглетный кислород ¹О₂ и пероксинитрит) [10].

В последнее время большое количество исследований посвящено изучению влияния ТМ на продукцию АФК. Доказано, что активная генерация АФК наблюдается при действии ионов железа, меди, цинка, никеля, алюминия, кадмия, свинца и др. [9]. В результате повышенной генерации АФК в клетках может произойти окисление липидов, углеводов, белков, повреждение ДНК и РНК, дезорганизация цитоскелета [5].

Важнейшим механизмом устойчивости растений в условиях загрязнения среды ТМ является активизация системы антиоксидантной защиты (АОС). Наибольшее значение придается роли, выполняемой низкомолекулярными метаболитами (аскорбиновая кислота, глутатион, пролин, каротиноиды, флавоноиды и др.) и антиоксидантными ферментами (СОД, каталаза, пероксидазы) [10]. Исследований, в которых были бы одновременно представлены отмеченные реакции антиоксидантной системы в пределах одного биологического объекта, мало. Древесные растения представляют в этом аспекте особый интерес, поскольку обладают высоким биологическим потенциалом при способности длительно депонировать токсичные соединения в многолетних органах.

В связи с этим было проведено исследование, целью которого являлось изучение физиологических реакций Acer platanoides L. на стресс, инициируемый загрязнением среды тяжелыми металлами.

Материал и методы исследования

Для исследования были выбраны 3 постоянные модельные площадки, 2 из которых располагаются в пределах санитарно-защитных насаждений (СЗН) крупнейших металлургических предприятий г. Тулы: I точка пробоотбора - ОАО «Косогорский металлургический завод»; II точка пробоотбора - комплекс предприятий ОАО СП АК «Тулачермет», ОАО «Ванадий-Тулачермет», ОАО «Палема». Ранее проведенное исследование позволило установить в почвах санитарно-защитных насаждений превышение ПДК (или ОДК) по Mn (в 4,7 раза), Pb (в 1,5 раза) и Zn (в 2 раза) и фонового уровня по Fe, Mn, Ti, Sc, V, Cr, Co, Ni, Cu, Zn, Cd, Rb, Sr, Zr, Ba и Pb [2]. За условно контрольную (чистую или фоновую) зону была принята территория Центрального парка культуры и отдыха (ЦПКиО) им. П.П. Белоусова (контроль).

Листья Acer platanoides L. отбирали с ветвей 1-2 года жизни на расстоянии 2-3 м от поверхности грунта по периметру кроны деревьев типичного габитуса одного возраста. Содержание перекиси водорода оценивали по количеству образующегося окрашенного комплекса пероксида титана [7]. Степень перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по методу, основанному на определении количества соединений, взаимодействующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-реагирующих соединений), в пересчете на малоновый диальдегид (МДА) [6]. Содержание фотосинтетических пигментов (хлорофиллов a, b и каротиноидов) определяли спектрофотометрически в этанольных экстрактах [8]. Определение содержания аскорбиновой кислоты и восстановленного глутатиона проводили титриметрическим методом с 0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола (аскорбиновая кислота) и йодата калия (восстановленный глутатион) [3]. Содержание фенольных соединений оценивали спектрофотометрически в этанольных экстрактах: с реактивом Фолина-Дениса (сумма водорастворимых фенольных соединений) и 2 %-м спиртовым раствором хлорида алюминия (флавоноиды) [4]. Определение активности ферментов проводили в фосфатно-буферных экстрактах, как описывали ранее [1]:каталазы - манометрическим методом с использованием модифицированного аппарата Варбурга, гваяколовой пероксидазы - спектрофотометрическим методом с пирогаллолом.

Каждый опыт проводили в трех биологических и трех аналитических повторностях. Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета прикладных компьютерных программ MS Excel 2003 и SigmaStat 3.1. В таблицах и на рисунках представлены средние арифметические значения определяемых величин и их стандартные ошибки (Р > 0,95). К полученным данным применен стандартный однофакторный дисперсионный анализ с использованием для оценки достоверности при множественном сравнении фактического значения q-критерия Ньюмена-Кейлся (критическое значение критерия при уровне значимости 0,05 в нашем исследовании равнялось 3,461).

Результаты исследований и их обсуждение

Произрастание A. platanoides на загрязненной тяжелыми металлами территории СЗН обусловливает процессы сорбции, перераспределения и аккумуляции ТМ в различных тканях и органах. Ранее проведенное исследование показало, что в листьях A. platanoides в значительном количестве аккумулируются Mn (180-260 мг/кг сухого вещества), Zn (20-40 мг/кг) и Cd (0,11-0,16 мг/кг) [2]. При этом аккумуляция ТМ из окружающей среды сопряжена с развитием окислительного стресса, обязательным условием которого является генерация избыточных количеств АФК. Поскольку перекись водорода является относительно стабильной АФК (время жизни около 1 мс), способной диффундировать от места образования [10], то изучение ее генерации в стрессовых условиях особенно актуально.

Проведенное исследование показало, что при произрастании A. platanoides в составе СЗН, содержание H₂O₂ в листьях было на уровне контрольного значения (0,104 ± 0,010 ммоль/г). При этом анализ результатов количественного определения МДА, являющегося продуктом перекисного окисления фосфолипидов мембран, подтвердил низкую интенсивность окислительных процессов. Количество МДА в листьях A. platanoides было в пределах 0,88 ± 0,14 нмоль/г свежей массы и не превосходило таковой показатель для растений в контроле.

Известно, что одним из наиболее чувствительных аппаратов растений к индуцированному ТМ окислительному стрессу является фотосинтетический. Важное условие его эффективной работы - поддержание стабильного количества и соотношения разных групп пигментов. Проведенное исследование показало, что в условиях промышленного загрязнения содержание пигментов в листьях A. platanoides было ниже, чем в контроле. В частности, количество хлорофилла а оказалось меньше в 3,4-3,8 раз, хлорофилла b - в 3,5 раза, каротиноидов - в 3,6 раз (рисунок).

Содержание фотосинтетических пигментов в листьях A. platanoides при стрессе

По своим функциональным свойствам молекулы пигментов различаются, поэтому критичным для поддержания нормального уровня фотосинтеза и сопряженных энергетических процессов является соотношение разных фотосинтетических пигментов. Соотношение пигментов меняется в течение онтогенеза пластид, листа и всего организма, но оно относительно определенно и генетически детерминировано. Проведенное исследование показало, что отношение количества двух форм хлорофилла («Хл a/Хл b») в листьях A. platanoides, а также количества общего хлорофилла (a + b) к содержанию каротиноидов в контроле было в пределах 2,6 и 6,44 соответственно (см. рисунок). Такое соотношение фотосинтетических пигментов является типичным для здоровых, хорошо функционирующих зеленых растений. В условиях техногенного загрязнения соотношение пигментов не изменялось.

Поскольку в листьях A. platanoides соотношение фотосинтетических пигментов оставалось на уровне контрольного значения, то общее снижение их содержания, по-видимому, отражает не столько характер поврежденности аппарата фотосинтеза, сколько переход его на новый физиологический уровень функционирования, что позволяет ему относительно стабильно работать, но, возможно, с меньшей эффективностью.

Таким образом, можно заключить, что в листьях A. platanoides под действием ТМ не происходило развитие окислительного стресса. Это подтверждается анализом результатов по накоплению H2O2 и МДА, а также поддержанием стабильного соотношения разных групп фотосинтетических пигментов. Невыраженность окислительных процессов может свидетельствовать о функционировании в листьях A. platanoides мощной антиоксидантной системы.

Специфической группой антиоксидантов являются специализированные ферменты (СОД, пероксидазы, каталаза и др.). Проведенное исследование показало, что в листьях A. platanoides, произрастающего в условиях повышенного содержания ТМ в окружающей среде, активность гваяколовой пероксидазы была выше, чем в контроле, в 11-14 раз, достигая максимальной величины (0,336 ± 0,053 мкмоль/мин⋅г) во II точке пробоотбора (таблица). Анализ результатов определения активности каталазы не позволил установить однозначной реакции данного компонента АОС на загрязнение среды ТМ. В частности, активность фермента в листьях A. platanoides I точки пробоотбора (140 ± 5 мкмоль/мин⋅г) была выше контрольной величины на 14 %. Отсутствие достоверного повышения активности каталазы по II точке пробоотбора может быть следствием ее ингибирования перекисью. В этом случае пероксидазы становятся главными ферментами, катализирующими разложение H2O2. Это утверждение согласуется с результатами по определению активности гваяколовой пероксидазы, активность которой была максимальной во
II точке пробоотбора.

Компоненты антиоксидантной системы A. platanoides при стрессе

Ферменты расположены в различных тканевых структурах и клеточных компонентах, имеют разную субстратную специфичность и сродство к АФК. При действии стрессоров наблюдается быстрая инактивация конститутивного пула антиоксидантных ферментов. Эти данные обусловили появление точки зрения о том, что низкомолекулярные органические антиоксиданты в ряде случаев способны более эффективно осуществлять защиту метаболизма от АФК [5]. Проведенное исследование показало, что произрастание A. platanoides в среде с повышенным содержанием ТМ в почве приводит к изменению количества накопленных в листьях низкомолекулярных соединений, проявляющих антиоксидантные свойства (см. таблицу). В частности показано, что в листьях A. platanoides содержание глутатиона в 2 раза, а суммы водорастворимых фенольных соединений на 12-26 % было выше, чем в контроле.

Для листьев A. platanoides II точки пробоотбора было отмечено также накопление флавоноидов, превышающее таковой уровень в контроле в 1,3 раза, но 10-кратное понижение его в I точке. Подобная особенность может определяться расходованием флавоноидов, как компонентов АОС, для поддержания на низком уровне концентрации АФК. Достоверных изменений в содержании аскорбиновой кислоты в листьях A. platanoides СЗН не происходило (см. таблицу).

Выводы

Таким образом, можно заключить, что, аккумуляция Mn, Zn и Cd в листьях A. platanoides не сопровождалась развитием в клетках окислительного стресса: уровень перекиси водорода, интенсивность ПОЛ и соотношение разных групп фотосинтетических пигментов оставалось на уровне контроля. Это становилось возможным благодаря функционированию в листьях данного вида мощной антиоксидантной системы. Было отмечено, что при произрастании A. platanoides в составе СЗН в его листьях происходило накопление глутатиона и фенольных соединений, а также увеличение активности гваяколовой пероксидазы и каталазы.

Список литературы

1. Сравнительный анализ активности компонентов антиоксидантной системы древесных растений в условиях техногенного стресса / А.Р. Гарифзянов, С.В. Горелова, В.В. Иванищев, Е.Н. Музафаров // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. - 2009. - С. 45-48.
2. Оценка возможности использования древесных растений для биоиндикации и биомониторинга выбросов предприятий металлургической промышленности / С.В. Горелова, А.Р. Гарифзянов, С.М. Ляпунов, А.В. Горбунов, О.И. Окина, М.В. Фронтасьева // Проблемы биогеохимии и геохимической экологии. - 2010. - № 1(12). - С. 155-163.
3. Грязнов В.П. Руководство к лабораторным и экспериментальным работам по физиологии растений. - Белгород: БелГУ, 2006. - 120 с.
4. Запрометов М.Н. Фенольные соединения и методы их исследования // Биохимические методы в физиологии растений. - М.: Наука, 1971. - С. 185-197.
5. Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K.V. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivative stress: a review // Annals of Botany. - 2003. - Vol. 91. - P. 179-194.
6. Heath R.L., Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation // Arch. Biochem. Biophys. - 1968. - Vol. 125(1). - P. 189-198.
7. Kumar G.N., Knowles N.R. Changes in Lipid Peroxidation and Lipolytic and Free-Radical Scavenging Enzyme during Aging and Sprouting of Potato (Solanum tuberosum L.) Seed-Tubers // Plant Physiol. - 1993. - Vol. 102. - P. 115-124.
8. Lichtentaller H.K., Welburn A.R. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents // Biochem. Soc. Trans. - 1983. - Vol. 11, № 6. - P. 591-592.
9. Prasad К.V.S.К., Saradhi P. P., Sharmila P. Concerted action of antioxidant enzymes and curtailed growth under zinc toxicity in Brassica juncea // Environmen. and Experimen. Botany. - 1999. - Vol. 42. - P. 1-10.
10. Scandalios J.G. The rise of ROS // Trends Biochem. Sci. - 2002. - Vol. 27. - P. 483-486.

Рецензенты:

Кособрюхов А.А., д.б.н., с.н.с., руководитель группы экологии и физиологии фототрофных организмов, г. Пущино;

Субботина Т.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой медико-биологических дисциплин ТулГу медицинского института, г. Тула.

Работа поступила в редакцию 04.05.2011.