Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

DYSREGULATION MECHANISMS OF THE RECEPTOR MEDIATED TRANSMISSION OF SIGNALS IN THE T-LYMPHOCYTES OF BLOOD IN PULMONARY TUBERCULOSIS

Koshkina A.A. 1
1 Siberian State Medical University, Tomsk
Проанализированы механизмы нарушения рецепторопосредованной передачи сигналов в лимфоцитах при различных клинико-патогенетических вариантах туберкулеза легких (ТЛ). Выявлено, что при ТЛ нарушение взаимодействия антигенпрезентирующих клеток (АПК) и Т-лимфоцитов, приводящее к гипо- и анергии Т-клеток, обусловливается не только влиянием супрессорных Т-регуляторных клеток (в том числе посредством CTLA-4), дефицитом молекул костимуляции CD80/CD86 на АПК и гипоэкспрессией на Т-клетках CD28, а также нарушением процессов сигнальной трансдукции в лимфоцитах крови, в основе которых лежит снижение числа клеток, содержащих активные формы транскрипционных факторов (ТФ) NF-kB, NFATс1, AP-1, при специфической индукции (CD3/CD28) лимфоцитов in vitro. При этом выраженность указанных изменений зависела от клинической формы и варианта (лекарственно-чувствительный, лекарственно-устойчивый) туберкулезной инфекции. По данным непараметрического корреляционного анализа выявленные Т-лимфоцитопения и гипопродукция IL-2 при ТЛ ассоциированы с изменениями субпопуляционного состава Т-клеток, которые проявляются уменьшением количества CD3+CD28+IL2+, CD3+CD28+IL2- и CD3+CD28-IL2+ лимфоцитов на фоне увеличения численности клеток с фенотипом CD3+CD28+IL2+. По результатам исследования оценена роль этиопатогенетических факторов в формировании вторичной иммунологической недостаточности при ТЛ.
The disorders of the receptor mediated transmission of signals in the lymphocytes of the various clinic-pathogenetic variants of the pulmonary tuberculosis (PT) have been examined. It was revealed that in case of PT the disorder of interaction between antigene presenting cells (APC) and T-lymphocytes, which leads to a hypo - and anergy of T-cells, is caused not only by the influence of suppressor T-regulatory cells (including by means of CTLA-4), deficiency of the molecules of costimulation CD80/CD86 on APC and the hypoexpression on the T-cells of CD28, as well as a disorder of the processes of signal transduction in blood lymphocytes, which are based on a reduction in the number of cells containing active forms of transcription factors (TF) of NF-kB, NFATс1, AP-1, at the specific induction (CD3/CD28) of lymphocytes in vitro. The severity of these changes depended on a clinical form and a variant of (drug-sensitive and drug-resistant) TB infection. According to the nonparametric correlation analysis, the revealed T- lymphocytopenia and hypoproduction of IL-2 in case of PT are associated with changes of subpopulation composition of T-cells, which show a decrease in the number of CD3+CD28+IL2+, CD3+CD28+IL2 - and CD3+CD28-IL2+ of lymphocytes, while the number of cells with the phenotype of CD3+CD28+IL2+ increases. According to the results of the study evaluates the role of etiopathogenesis factors in formation of the secondary immune insufficiency in case of PT.
pulmonary tuberculosis
signal transduction
T cells
secondary immune deficiency
transcription factors
intercellular cooperation.
1. Zenin V.V., Aksemov N.D., Shatrova L.N., Marachova I.I. Tsytologiya, 2009, vol. 51, no. 6, pp. 506-510.
2. Ivashkin V.T. RZHGGK, 2008, no. 4, pp. 4-13.
3. Novitskiy V.V., Urazova O.I., Strelis A.K., Voronkova O.V., Filinyu O.V., Shilko T.A. Byulleten sibirskoy meditsyny, 2006, vol. 5, no. 2, pp. 70-74.
4. Sakhno L.V., Tichonova M.A., Kurganova E.V., Chernykh E.R., Shevela E.R., Ostanin A.A., Nikonov S.D., Zhdanov O.A., Mostovaya G.V. Problemy tuberkuleza i bolezney legkikh, 2004, no. 5, pp. 23-28.
5. Urazova O.I. Byulleten sibirskoy meditsyny, 2010, no. 5, pp. 5-13.
6. Churina E.G., Novitskiy V.V., Urazova O.I. Byulleten sibirskoy meditsyny, 2011, no. 4, pp. 103-111.
7. Yarilin A.A. Immunologiya, 2010, no. 3, pp. 153-168.

Приоритетными на сегодняшний день являются исследования, базирующиеся на положении о том, что в основе туберкулезного процесса лежит дизрегуляция иммунной системы [5]. При этом важную роль отводят межклеточной кооперации, ключевым моментом которой является активация наивных T-клеток (Th0) в направлении Т-хелперов 1 типа (Th1), необходимых для формирования эффективной противотуберкулезной защиты.

Причины снижения Th1-активности при ТЛ могут лежать в нарушении взаимодействия между T-лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками (АПК). Вместе с тем сведения, касающиеся механизмов нарушений TCR-CD28-опосредованной передачи сигнала при туберкулезе, носят фрагментарный, несистематизированный характер и не позволяют однозначно оценить наличие и направленность патологических изменений, приводящих к снижению Th1-активности.

Цель исследования. Выявить особенности и вскрыть механизмы нарушения рецепторопосредованной передачи сигналов в лимфоцитах при различных клинико-патогенетических вариантах туберкулеза легких.

Материал и методы исследования

В программу исследования вошли 65 пациентов (51 мужчина и 14 женщин) с впервые выявленными распространенными формами туберкулеза легких (ТЛ) в возрасте 20-55 лет. Все пациенты в зависимости от устойчивости M. tuberculosis к основным противотуберкулезным препаратам (ПТП) были разделены на две группы - больные с лекарственно-чувствительным (ЛЧТЛ) и лекарственно-устойчивым ТЛ (ЛУТЛ), каждая группа в свою очередь была разбита на подгруппы в зависимости от формы заболевания (инфильтративный, диссеминированный ТЛ).

Контрольную группу составили 21 практически здоровый донор с сопоставимыми характеристиками по возрасту и полу.

Материалом для исследования служила гепаринизированная (25 ед./мл) кровь больных ТЛ и здоровых добровольцев, взятая утром натощак из локтевой вены. Исследование проводили однократно, до начала специ­фической противотуберкулезной химиотерапии.

Выделение мононуклеарных клеток проводили методом центрифугирования на градиенте плотности фиколл-урографина (ρ = 1,077 г/см3). Выделение лимфоцитов из смешанной культуры мононуклеаров осуществляли методом адгезии к пластику. Идентификацию клеток осуществляли путем витальной окраски азур II-эозином. Жизнеспособность выделенных лимфоцитов (по данным трипанового теста) составляла 97%. Культивирование полученных клеточных суспензий осуществляли в полной питательной среде по методу Е.Д. Гольдберга и соавт. (1992) с поэтапным добавлением в культуру клеток моноклональных антител к CD3-, CD28-молекулам («R&D Systems», США) и блокатора внутриклеточного транспорта монензин («Sigma», США). Образцы инкубировали в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С. Для изучения CD3/CD28-индуцированной секреции IL-2 образцы инкубировали в присутствис моноклональных антител к CD3-, CD28-молекулам в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С в течение 48 ч.

Прошедшие стимуляцию лимфоциты дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (рН = 7,4) и стандартизировали количество клеток в суспензии до 2·105 клеток/мл. Непосредственно перед окраской проводили Fc-блокировку клеток. Процедуру окрашивания поверхностных молекул (CD3, CD28, CTLA4), внутриклеточных IL-2 и активированных форм транскрипционных факторов (ТФ) NFAT, NFκB, АР-1 осуществляли согласно протоколам фирм производителя («R&D Systems», США; «Santa Cruz Biotechnology», США), которая включала в себя фиксацию, пермеабилизацию и окрашивание клеток специфическими моноклональными антителами, меченных флуоресцентными метками. Определение уровня экспрессии рецепторных молекул и внутриклеточных аналитов в лимфоцитах крови проводили методом двух- и трехцветной цитометрии на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием изотипических контролей («R&D Systems», США).

Уровень базальной и CD3/CD28-индуцированной секреции интерлейкина IL-2 в супернатантах культуральных суспензий мононуклеарных лейкоцитов осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа в соответствии с методическими рекомендациям фирмы-производителя («eBioscience Company», США).

Обработку полученных результатов проводили на основе общепринятых статистических методов с помощью пакета программ Statistica for Windows (2000, версия 6.0).

Результаты исследования и их обсуждение

Анализ полученных данных показал, что у больных ЛЧТЛ и ЛУТЛ отмечались однонаправленные изменения цитокинпродуцирующей активности лимфоцитов, выражающиеся в снижении базальной секреции IL-2 по сравнению с соответствующими параметрами у здоровых доноров (12,9 ± 3,76 пг/мл), наиболее выраженном при диссеминированной форме ТЛ (3,76 ± 1,04 пг/мл, р < 0,001). CD3/CD28-ин-
дукция клеток вызывала увеличение (по сравнению с базальным уровнем) продукции исследуемого цитокина во всех группах обследуемых лиц, которая, однако, была существенно ниже данного показателя в группе контроля. При этом наиболее выраженное угнетение стимулированной IL-2-секреции (относительно контрольных значений) было зафиксировано в группе больных инфильтративным ЛУТЛ.

На фоне выраженной гипосекреции IL-2 у больных ТЛ регистрировалось снижение количества лимфоцитов, несущих поверхностный маркер CD3, относительно показателей у здоровых доноров, наиболее выраженное при диссеминированной форме ЛУТЛ, где данный показатель снижался в 1,9 раз (р < 0,001). Наряду с этим во всех группах обследованных лиц с туберкулезной инфекцией устанавливалось резкое снижение процентного числа CD3+CD28+ клеток, содержащих внутриклеточный IL-2, по сравнению с таковым в контрольной группе. При этом степень выраженности данных нарушений была существенно выше при лекарственно-устойчивом ТЛ, чем при его лекарственно-чувствительном варианте, и не зависела от клинической формы заболевания. Такая же картина отмечалась относительно числа CD3+CD28+IL-2- клеток.

Процент CD3+CD28-IL-2- лимфоцитов у больных ТЛ оказался выше такового в группе контроля, где данный показатель составил 49,08 ± 10,9%. При этом лекарственно-устойчивый вариант ТЛ независимо от клинической формы заболевания характеризовался более высоким процентным содержанием CD3+CD28-IL-2- клеток относительно такового при ЛЧТЛ. Корреляционный анализ позволил установить прямую зависимость между общим содержанием CD3-позитивных клеток и числом CD3+CD28-IL-2- лимфоцитов при инфильтративном (R = 0,56, p = 0,0156) и диссеминированном (R = 0,57, p = 0,019) ЛУТЛ.

У всех больных в острый период заболевания выявлялось увеличение содержания CTLA-4-позитивных Т-лимфоцитов в сравнении с группой здоровых доноров. При этом наиболее выраженное увеличение относительного числа данной субпопуляции клеток регистрировалось при ЛУТЛ, не зависело от клинической формы заболевания и превышало значения как в группе контроля, так и у пациентов с ЛЧТЛ. При оценке количества Т-лимфоцитов, негативных по CTLA-4, было отмечено снижение их численности во всех обследованных группах относительно контрольных значений. При этом наиболее выраженное снижение процентного числа CTLA-4-негативных Т-лимфоцитов наблюдалось у пациентов с диссеминированным ЛУТЛ как относительно нормы (в среднем в 2,4 раза), так и по сравнению с показателями при его лекарственно-чувствительном варианте.

При оценке числа Т-лимфоцитов, содержащих активные формы ТФ после индукции клеток антителами к CD3- и CD28-молекулам, было установлено снижение относительного и абсолютного числа CD3-позитивных клеток, содержащих активную форму NF-kB у больных ТЛ по сравнению с аналогичными показателями в группе здоровых доноров. При этом диссеминированный ТЛ характеризовался более выраженным снижением числа CD3+NF-kB+ клеток.

Что касается AP-1-позитивных Т-лим­фо­цитов, то у больных ЛЧТЛ, несмотря на тенденцию к снижению, численность CD3+AP-1+ клеток оставалась в пределах контрольных значений. ЛУТЛ характеризовался разнонаправленными изменениями относительного и абсолютного количества CD3+AP-1+ лимфоцитов: увеличением при инфильтративной и снижением при диссеминированной форме ЛУТЛ по сравнению с показателями у здоровых доноров и у больных с аналогичными формами ЛЧТЛ.

Исследование количества Т-лимфо­цитов, содержащих активную форму NFATс1, позволило установить снижение процентного и абсолютного числа CD3+NFATс1+ клеток у больных ТЛ относительно показателя в группе здоровых доноров. Исключение составили больные инфильтративным ЛУТЛ, у которых численность данной субпопуляции Т-лимфоцитов не отличалась от нормальных величин и была значимо выше аналогичных показателей в других обследуемых группах пациентов с ТЛ. Количественный анализ Т-клеток, содержащих активную форму NFATс2, у больных ИТЛ позволил зарегистрировать существенное увеличение относительного и абсолютного числа CD3+NFATс2+ лимфоцитов при лекарственно-устойчивом варианте ТЛ в сравнении с показателем у здоровых доноров и больных инфильтративным ЛЧТЛ, где данный параметр не превышал контрольных значений. ДТЛ, напротив, характеризовался низкими показателями численности CD3+NFATс2+ клеток при ЛЧТЛ и сохраняющимся в пределах нормы количеством NFATс2-позитивных Т-лимфоцитов при его лекарственно-резистентном варианте.

В качестве одной из причин, обуславливающих снижение секреции IL-2, отмечают дефицит и функциональную несостоятельность Т-лимфоцитов, необходимых для эффективного антимикобактериального иммунного ответа [2]. Угнетение IL-2-секреторной активности Т-лимфоцитов, установленное в настоящем исследовании, во многом определяется снижением количества данной субпопуляции клеток. Уменьшение общего числа CD3-позитивных лимфоцитов может быть связано как с непосредственной гибелью клеток в очаге воспаления в легких, что приводит к ускоренной миграции Т-клеток из периферической крови [3], так и с запуском программы апоптоза [5]. Кроме того, на фоне выраженной Т-лимфоцитопении нами выявлено изменение субпопуляционного состава Т-клеток периферической крови при специфической индукции CD3/CD28-антителами, проявляющееся снижением числа активных Th1-лимфоцитов (CD3+CD28+IL2+).

Причины снижения активности Th1 могут лежать в нарушении взаимодействия между T-лимфоцитами и AПК, которое, как известно, осуществляется путем непосредственного контактного взаимодействия клеток с участием их поверхностных молекул и опосредовано через регуляцию цитокинами [2]. Нами была предпринята попытка выявить возможные нарушения взаимодействия между АПК и Т-лимфоцитами в процессе межклеточной кооперации на уровне CD3-TCR, молекул костимуляции и ТФ, приводящие к гипопродукции IL-2 при ТЛ.

Известно, что передача импульсов, опосредованная CD3-TCR/CD28, в отсутствие костимуляторного приводит к запуску программы апоптоза Т-клеток [5, 6]. Механизм реализации апоптоза в данном случае зависит от NF-ATс2-индуцированной экспрессии апоптотического фактора FasL в ответ на «неправильный» антигенный стимул, определяющей дальнейшую судьбу наивного Т-лимфоцита - гибель. Установленное в нашем исследовании снижение количества Т-лимфоцитов, презентирующих на своей поверхности CD28 (CD3+CD28+IL2+, CD3+CD28+IL2-), а также уменьшение общего числа CD3-позитивных клеток, сочетающееся с увеличением численности CD3+NFATс2+ лимфоцитов у больных ЛУТЛ, не исключают данный механизм нарушения активации Th1, приводящий к снижению секреции IL-2.

С другой стороны, гипопродукция IL-2, а также снижение числа CD3+CD28+IL-2+ лимфоцитов у больных ТЛ могут быть обусловлены, на наш взгляд, анергией Т-клеток. Выявленное нами увеличение процентного содержания CD3+CD28-IL-2- лимфоцитов на фоне выраженной Т-лимфоцитопении и гипосекреции IL-2, связано, по всей видимости, с увеличением числа регуляторных клеток (Treg) и усилением их функциональной активности, что может стать причиной супрессии лимфопролиферации и анергии Т-клеток [4]. При этом большое значение придается присутствию на поверхности Treg-лимфоцитов ингибитора костимуляции - молекулы CTLA-4, поскольку именно с этой молекулой связывают реализацию их супрессорной функции [4].

Экспрессия CTLA4 на поверхности Т-лимфоцитов не является постоянной и усиливается при индукции клеток через TCR. Установленное в настоящем исследовании увеличение числа CD3+CTLA4+ лимфоцитов при CD3/CD28-индукции свидетельствует об усилении супрессорной активности Treg. Известно, что CTLA4, в силу своей высокой авидности к молекулам CD80/CD86 на AПК, являющимися его лигандами, способен предотвращать их костимулирующее действие, формирование синапса с CD28-молекулой на Т-лимфоцитах и, таким образом, подавлять активацию Th1-клеток [3, 4]. Механизм супрессии Th1 посредством CTLA4 определенно вносит свой вклад в развитие Т-клеточной анергии при ЛУТЛ, при котором отмечается более выраженное увеличение числа CD3+CTLA4+ лимфоцитов. В данном случае мы можем судить об анергии Т-клеток, индуцированной возбудителем с определенными биологическими свойствами [3]. Косвенным доказательством этому может служить выявленная отрицательная взаимосвязь между общим содержанием CD3+ лимфоцитов и субпопуляцией Т-клеток, имеющих фенотип CD3+CTLA4+ и CD3+CD28-IL-2- при лекарственно-устойчивом варианте ИТЛ (R = 0,68; p = 0,0042 и R = 0,56, p = 0,0156 соответственно) и ДТЛ (R = 0,81; p = 0,011 и R = 0,57, p = 0,019 соответственно).

Важным моментом в индукции Th1-лим­фоцитов служит активация ТФ и их интегрированное влияние на промотор гена IL2 и синтез одноименного цитокина. Так, передача импульсов, опосредованная Т-клеточным рецептором приводит к последовательной активации цепочки тирозиновых киназ (Fyn, Lck, ZAP70), которые вызывают расщепление фосфатидилинозитолдифосфата с образование диацилглицерола и инозитолтрифосфата, который высвобождает Са2+ из внутриклеточных депо. Ионы кальция необходимы для активации кальций-зависимых ферментов, таких как кальциневрин, который активирует ТФ NFAT, что вызывает его транслокацию в ядро. Диацилглицерол активирует протеинкиназу С, которая затем активирует фактор транскрипции NF-kB. Последний включает в ядре «ранние гены» клеточной пролиферации Fos и Jun и промотор AP-1, который (взаимодействуя с NFAT) активирует транскрипцию гена IL-2 и его рецептора (CD25) [1].

В ходе настоящего исследования у больных ТЛ установлено снижение числа CD3-позитивных клеток, содержащих активную форму NF-kB в лимфоцитах крови. При этом активность AP-1 у больных ЛЧТЛ оставалась в пределах нормы, повышалась у больных инфильтративным ЛУТЛ и снижалась при диссеминированной его форме. Активность ТФ NFATс1 у больных ТЛ в целом снижалась, а NFATс2 - увеличивалась при инфильтративном ЛУТЛ и снижалась при диссеминированном ЛЧТЛ. Полученные результаты позволяют предположить, что при ТЛ имеют место нарушения в активации NF-kB - запуск собственно NF-кB-пути, который приводит к экспрессии антиапоптотических/антинекрозных генов, активации, пролиферации и, в конечном итоге, к выживанию клетки.

Установлено, что AP-1 взаимодействует с ядерным ТФ NFATc1, активирующим Т-лимфоциты и регулирующим транскрипцию цитокинов, в том числе и IL-2, Т-клетками [7]. В сочетании с низкой активностью NFATс1, являющегося наиболее эффективным активатором транскрипции гена IL2, и низкой активностью NF-kB выявленное нами снижение числа клеток, содержащих активную форму AP-1, у больных диссеминированным ЛУТЛ, вероятно, определяет снижение активности Th1-лимфоцитов при данной форме ТЛ, влияя на их IL-2-секретирующую способность, пролиферацию и дифференцировку в целом.

Известно, что NFATс2-белок участвует в негативном контроле пролиферации Т-лимфоцитов за счет инициации экспрессии FasL [7]. Увеличение содержания активной формы NFATс2 в Т-лимфоцитах крови больных инфильтративным ЛУТЛ в сочетании с низкой активностью NFATс1 при данной форме ТЛ, возможно, объясняется негативным влиянием NFATс2 на активацию Th1 и снижение их IL-2-секретирующей функции.

Кроме того, показана способность NFATс1 и NFATс2 (в комплексе друг с другом) существенно усиливать транскрипцию гена IL-4 на начальных этапах активации (NFATс2), взаимодействуя с пурин-богатыми последовательностями промотора (Рo-Р5), с дальнейшим ингибированием (NFATс1) поздней фазы транскрипции гена IL4 [4]. Снижение количества CD3+NFATс1+ лимфоцитов у больных ТЛ при нормальном или увеличенном содержании CD3+NFATс2+ клеток позволяет предположить дезинтеграцию в работе изучаемых ТФ, приводящую, по всей видимости, к нарушению ингибирования поздней фазы транскрипции гена IL4, увеличению IL-4 продуцирующей способности Т-клеток и переключению их активации с Th1 на Th2 иммунный ответ.

Заключение

Таким образом, при ТЛ нарушение взаимодействия АПК и Т-лимфоцитов, приводящее к гипо- и анергии Т-клеток, является комплексным, многоуровневым и обусловливается не только влиянием супрессорных Т-регуляторных клеток (в том числе посредством CTLA4), но также и гипоэкспрессией молекул костимуляции (CD28) на Т-клетках в сочетании с нарушением процессов сигнальной трансдукции в лимфоцитах крови вследствие низкой активности внутриклеточных ТФ (NF-kB, NFATс1, AP-1).

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (ГК №16.512.11.2046 от 14.02.2011 г.) и РФФИ (Проект №11-04-98057-р).

Рецензенты:

  • Воронкова О.В., д.м.н., профессор кафед­- ры патофизиологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, г. Томск;
  • Потапов А.В., д.м.н., профессор кафед­ры гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, г. Томск.

Работа поступила в редакцию 20.07.2012.