Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

THE β-ADRENORECEPTORS AS REGULATORS OF INTRACELLULAR CALCIUM IN WHITE ADIPOSE ADIPOCYTES

Turovsky E.A. 1 Turovskaya M.V. 1 Tolmacheva A.V. 1 Dolgacheva L.P. 1 Zinchenko V.P. 1 Dynnik V.V. 1
1 Institute of Cell Biophysics, Russian Academy of Sciences, Pushchino
In experiments on mouse white adipocytes using fluorescent microscopy and imaging analysis systems it was shown that a neurotransmitter noradrenalin and the agonists of β-adrenergic receptors – isoproterenol and BRL-37344 in the presence of α1/2-adrenoreceptor antagonists, phentolamine, led to an increase in [Ca2+]i in the cells. Selective agonist of all the three subtypes of β-adrenergic receptors, propranolol, suppressed this Са22+ -response. Maximal amplitude of [Ca2+]i was observed upon the application of an activator of β3-adrenergic receptors – BRL-37344. The increase of [Ca2+]i initiated by the activation of β-adrenergic receptors is realized through the adenylate cyclase signal transduction system. Using selective activators of adenylate cyclase system – forskolin and 8-Bromo-cAMP, as well as inhibitors of protein kinase A (H-89) and ryanodine receptor (ryanodine), it was shown that cAMP, protein kinase A and ryanodine receptors take part in the pathway of generating slow Са2+ -response in the culture of white fat adipocytes of mouse.
adipocytes
β-adrenoreceptors
protein kinase A
Са2+
RyR
IP3-receptor
1. Bartness T.J., Song C.K. Thematic review series: adipocyte biology. Sympathetic and sensory innervation of white adipose tissue // J Lipid Res. 2007. Vol. 48. рр. 1655-1672.
2. Bruce J.I., Straub S.V., Yule D.I. Crosstalk between cAMP and Ca2 + signaling in non-excitable cells. // Cell Calcium. 2003. Vol. 34, no. 6. рр. 431–444.
3. Dolgacheva L.P., Abzhalelov B.B., Zhang S.J., Zinchenko V.P., Bronnikov G.E. Norepinephrine induces slow calcium signaling in murine brown preadipocytes through the beta-adrenoceptor/cAMP/protein kinase A pathway // Cell Signal. 2003. Vol. 15, no. 2. pp. 209–216.
4. Hayato R., Higure Y., Kuba M., Nagai H., Yamashita H., Kuba K. β₃-Adrenergic activation of sequential Ca(2 +) release from mitochondria and the endoplasmic reticulum and the subsequent Ca(2 +) entry in rodent brown adipocytes // Cell Calcium. 2011. Vol. 49, no. 6. P. 400–414.
5. Langin D., Ekholm D., Ridderstråle M., Lafontan M., Belfrage P. cAMP-dependent protein kinase activation mediated by beta 3-adrenergic receptors parallels lipolysis in rat adipocytes // Biochim Biophys Acta. 1992. Vol. 1135, no. 3.
pp. 349–352.
6. Morimoto S., O-Uchi J., Kawai M., Hoshina T., Kusakari Y., Komukai K., Sasaki H., Hongo K., Kurihara S. Protein kinase A-dependent phosphorylation of ryanodine receptors increases Ca2 + leak in mouse heart. // Biochem Biophys Res Commun. 2009. Vol. 390, no. 1. pp. 87–92.
7. Mottillo E.P., Shen X.J., Granneman J.G. Beta3-adrenergic receptor induction of adipocyte inflammation requires lipolytic activation of stress kinases p38 and JNK. // Biochim Biophys Acta. 2010. Vol. 1801, no. 9. pp. 1048–1055.
8. Turovsky E.A., Turovskaya M.V., Berezhnov A.V., Tolmacheva A.V., Kaimachnikov N.P., Dolgacheva L.P., Zinchenko V.P., Maevskii E.I., Dynnik V.V. Convergence of Ca2 + -signaling pathways in adipocytes. The role of L-arginine and protein kinase G in generation of transient and periodic Ca2+ -signals // Biochemistry (Moscow). 2012. Vol. 6, no. 1. pp. 35-44.

Симпатическая нервная система и нейротрансмиттер норадреналин (НА) играют важную роль в процессе липолиза триглицеридов белой жировой ткани [1]. Взаимодействие норадреналина с ?-адренорецепторами приводит к активации Gs-белков, аденилатциклазы, увеличению уровня сАМР и активации протеинкиназы А (PKA). Фосфорилирование протеинкиназой А гормон-чувствительной липазы и перилипина инициирует липолиз [5]. На клетках бурого жира показано, что активация β-адренорецепторов может вызывать рост не только сАМР, но и Са 2+ [4]. Механизмы β-адренорецептор-зависимого повышения [Ca 2+ ]i в адипоцитах белой жировой ткани неизвестны. В данной работе на первичной культуре белых адипоцитов мышей предполагалось установить участие β-адренорецепторов и их подтипов в формировании Са 2+ -сигнала, пути передачи этих сигналов, участие Са 2 + каналов эндоплазматического ретикулума.

Материалы и методы исследования

В экспериментах использовали первичную культуру белых адипоцитов мыши на 9 день культивирования (9 DIV), полученную из мезенхимальной фракции стволовых клеток эпидидимального жирового депо в соответствии с общепринятой методикой [8]. Измерение динамики цитозольного кальция ([Ca 2+ ]i) проводили с помощью системы анализа изображений «Cell observer» (Carl Zeiss, Германия) на базе моторизованного микроскопа Axiovert 200M с высокоскоростной черно-белой CCD-камерой AxioCam HSm. Источником света служила ртутная лампа НВО 100. Возбуждение флуоресценции Fura-2 проводили при двух длинах волн (340 и 387 нм) с использованием запирающих светофильтров BP 340/30 и BP 387/15, регистрация в области (465–555) нм (светофильтр эмиссии ВР 510/90). Для формирования изображения использовали объектив Plan Neofluar 20×/0.3. В эксперименте получали серии изображений культуры с интервалом 3 сек. Для обработки серий изображений использовали программу Image J 1.44). Клетки загружали кальций-чувствительным зондом Fura-2 (Molecular probes, USA) в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS), содержащем 10 мМ HEPES, pH 7,4 при 37 °С в течение 40 мин с последующей отмывкой от красителя в течение 15 мин. Построение графиков осуществляли помощью программы Origin-8. Результаты, представленные в работе, получены на 4-х клеточных культурах с 5-ю повторами для каждой культуры.

Результаты исследования и их обсуждение

Ранее нами было показано на культуре белых адипоцитов, что норад­реналин (НА) в физиологических концентрациях вызывает 3 типа кальциевых ответов у белых адипоцитов. Поскольку НА взаимодействует с α1-, α2- и β-адренорецепторами адипоцитов белого жира, то для выделения Са2+ -ответа, инициируемого β-адренорецепторами, эксперименты были проведены в присутствии ингибитора ?1- и ?2-адренорецепторов – фентоламина (рис. 1). Как следует из рисунка, Са2+ -ответ начинается после лаг-периода и представляет собой медленное увеличение цитозольного кальция.

Похожие Са 2 + -ответы были зарегистрированы под действием изопротеренола (агонист β1, β2, β3-адренорецепторов), и BRL (агонист β3-адренорецепторов) (рис. 2). Максимальная амплитуда увеличения [Ca2+]i наблюдалась при аппликации агониста β3-адренорецепторов, что согласуется с данными о том, что β3-адренорецепторы селективно экспрессированы в зрелых адипоцитах [7]. Следует отметить, что изменения [Ca2+]i под действием каждого из трех агонистов обычно развивается медленный двухфазный ответ.

pic_6.wmf

Рис. 1. Изменение [Ca2 + ]i в адипоцитах белого жира при активации ?-адренорецепторов норадреналином (НА)на фоне антагониста ?1,2-адренорецепторов – фентоламина

pic_7.wmf

Рис. 2. Увеличение [Ca2 + ]i в дифференцированных белых адипоцитах при активации ?-адренорецепторов и протеинкиназы А. Активация ?-адренорецепторов селективными агонистами – изопротеренол (?1,2,3, кривая 1), BRL-37344 (?3, кривая 2), аденилатциклазы (форсколин, кривая 3) и протеинкиназы А (8-Bromo-cAMP, кривая 4) ? приводит к медленному увеличению [Ca2+]i

Для доказательства специфичности Ca2+ -ответа были использованы селективные ингибиторы β-адренорецепторов пропраналол и α1-, α2-адренорецепторов фентоламин. Как следует из табл. 1, пропраналол полностью подавлял Са2+ -ответ под действием изопротеренола, а фентоламин не оказывал влияния на этот ответ.

Для определения источника увеличения Са2+ были проведены эксперименты с ингибиторами различных Са2+ -транспортирующих систем (каналов). В табл. 1 показано, что в присутствии ксестоспонгина (ингибитора IP3-рецепторов) происходит подавление амплитуды Са2+-ответа на 84 %. Таким образом, повышение Са2+ является следствием активации IP3-рецепторов. Известно, что для целого ряда невозбудимых клеток мобилизация Са2+ является IP3- и Са2+ -зависимой, а активность IP3R регулируется фосфорилированием различными протеинкиназ.

Таблица 1

Изменение [Са2+]i под действием 3 µM изопротеренола и антагонистов рецепторов

Мишени

Антагонисты мишеней

Эффект

β-адренорецепторы

Пропранолол, 3 µM

Подавление [Са2+ ]I на 100 %

α1-,α2-адренорецепторы

Фентоламин, 5 µM

Нет эффекта

IP3-рецепторы

Ксестоспонгин, 0,5µM

Подавление амплитуды [Са2+ ] i на 84 %

В последующих экспериментах мы показали, что Са 2+ -ответ, инициированный активацией β-адренергических рецепторов, сопряжен с активацией аденилатциклазной системы. Активация b-адренорецепторов адипоцитов приводит к опосредованной G-белками стимуляции аденилатциклазы и к образованию вторичного мессенджера – сАМР. Эти события можно имитировать либо добавлением форсколина – непосредственного активатора аденилатциклазы, либо добавлением к клеткам проникающего через плазматическую мембрану аналога сАМР – 8-Br-cAMP. Соединение 8-Br-cAMP является более резистентным к действию фосфодиэстераз, чем сАМР и активирует РКА.

Как следует из рис. 2, медленное увеличение внутриклеточного кальция происходит также при активации аденилатциклазы и протеинкиназы А с помощью проникающего аналога сАМР. Таким образом, воздействия, влияющие на увеличение в клетке сАМР, также вызывают повышение [Ca2+]i . Основной мишенью сАМР в клетках является ПКА. Добавление к клеткам ингибитора протеинкиназы А Н-89 подавляло Ca2+ -ответы под действием сАМР (табл. 2), что указывает на участие этого фермента в повышении [Ca2+]i под действием сАМР в адипоцитах белого жира. Для ряда клеток показано, что протеинкиназа А фосфорилирует IP3- и рианодиновые рецепторы энодлазматического ретикулума, и это приводит к увеличению активности Са2+ -каналов этих рецепторов [6]. Как следует из табл. 2, ингибитор IP3-рецепторов подавлял амплитуду Са2+ сигнала на 83 %, а ингибитор рианодиновых рецепторов полностью подавлял Са2+ сигнал у 20 % клеток.

Таблица 2

Изменение [Ca2+]i под действием 5 µM 8-Br-cAMP и ингибиторов

Мишени

Антагонисты мишеней

Эффект

Протеинкиназа А

H-89, 200 нМ

Подавление[Ca2+]I  на 100 %

IP3R

Ксестоспонгин C, 0,5 µM

Подавление амплитуды [Ca2+]i  на 83 %

Рианодиновые рецепторы (RyR)

Рианодин, 1 µM

Подавление [Ca2+]I  полное у 20 % клеток

Адипоциты белой жировой ткани играют главную роль в поддержании энергетического гомеостаза организма при голодании и физической нагрузке за счет липолиза запасенных триглицеридов. Процесс липолиза активируется адреналином и норадреналином через β-адренорецепторы, аденилатциклазу, сАМР, РКА и фосфорилирование гормончувствительной липазы и перилипина [5]. Мишенями протеинкиназы А являются и Са2+ -транспортирующие системы клетки, такие как Са2+ -каналы эндо/саркоплазматического ретикулума и плазматической мембраны и Са2+ -АТРазы [6]. Ранее было показано, что активация β-адренорецепторов клеток бурого жира вызывает увеличение [Ca2+]i  [3]. В данной работе показано, что агонисты β-адренорецепторов, активатор аденилатциклазы форсколин или проникающий негидролизуемый аналог сАМР – 8-Br-cAMP вызывают медленное (по сравнению с Са2+ -ответами на агонисты α-адренорецепторов) повышение [Са2+]. В генерации этого Са2+ -сигнала участвуют не только протеинкиназы А, Са2+ -каналы IP3R- и RyR-рецепторов, но и Са2+ -каналы плазматической мембраны (неопубликованные данные). Эти факты свидетельствуют в пользу того, что один агонист (НА), активируя α- и β-рецепторы, создает условия для конвергенции таких сигнальных путей, регулирующих уровни cAMP, cGMP и Ca2+, как аденилатциклазный и фосфоинозитидный [8].

Заключение

Представленный в данной работе медленный Са2+ -сигнал, по-видимому, необходим клеткам для повышения базового уровня кальция, который влияет на частоту и амплитуду Са2+ -ответов на множество гормонов и трансмиттеров, сопряженных с активацией Са2+ -систем сигнализации. В таких параметрах, как частота и амплитуда, закодирована сигнальная информация, передаваемая в ядро на экспрессию специ­фических генов [2].

Работа выполнена при финансовой поддержке: ФНМ – 01201258223; ГК 16.512.11.2092 – 01201179771; ФНМ – 01201256033; РФФИ № 10-04-01306.