Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Проблема тромбозов в артериях, венах, микроциркуляторном русле является одной из самых актуальных в современной медицине. Артериальные тромбозы в коронарных сосудах являются основной причиной инфаркта миокарда, они же вызывают почти 90 % нарушений мозгового кровообращения. Окклюзия микроциркуляторного русла в виде различных вариантов внутрисосудистого микросвертывания крови не имеет точной статистической оценки, хотя встречается при многих заболеваниях, сопровождающихся гипертонией, интоксикацией, сепсисом, нарушениями иммунитета и др. [2, 3].

Важную роль в развитии диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови играют продукты анаэробного метаболизма, вызывающие ацидоз. Они представляют реальную опасность для организма, так как способны не только нарушать функции, но и приводить к морфологическим изменениям в различных органах и тканях [1, 3, 6]. Накопление молочной кислоты, известной в качестве крупного донора протонов, изменяет гемостатические и реологические свойства крови, усиливает гипоксию тканей и уменьшает функцию энергообразования клеток вследствие разобщения гликолиза и цикла Кребса, снижает ресинтез АТФ и ведет к увеличению энтропии в организме [6, 7]. Влияние ацидоза на показатели гемостаза изучалось многими исследователями [1-3]. Благодаря этому были выявлены основные закономерности изменения функции тромбоцитов, свертывания крови, фибринолиза, антикоагулянтной активности, развития диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС) и тромбогеморрагического (ТГС) синдромов при ацидотических состояниях. Однако некоторые механизмы остаются не ясными. Наши исследования посвящены изучению влияния различных сдвигов рH на свертывание крови, фибринолиз, агрегацию и дзета-потенциал тромбоцитов.

Методы и организация исследования

Для исследования роли метаболических факторов в механизмах свертывания крови и сосудисто-тромбоцитарного гемостаза были проведены исследования in vitro. На 20 собаках весом от 15 до 25 кг, использованных в качестве доноров, изучали действие различных концентраций молочной кислоты, приготовленных на физ.растворе, на свертывание крови, фибринолиз, показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза. В экспериментах применялись различные концентрации лактата (от 2,5 до 17 ммоль/л). Пробы крови брали в силиконированные пробирки, содержащие 3,8 % цитрат натрия, так, чтобы конечное соотношение цитрата и крови составляло 1 к 9. Для получения плазмы кровь центрифугировали в течение 10 минут при 1500 об/мин, а плазму, богатую тромбоцитами, для изучения дзета-потенциала и агрегации – при 1000 об/мин. Определение электрокинетической подвижности тромбоцитов проводили в камере H.A. Abramson (1928) модификации В.В. Альфонсова (1977). Показатели КЩР определяли микрометодом Аструпа «Микро-Аструп». В опытах in vivo лактат-ацидоз создавали введением 3 % раствора молочной кислоты в изотоническом растворе NaCl в бедренную вену под гексеналовым наркозом. Различный сдвиг рН в кислую сторону достигали дозированным капельным введением лактата от 20 до 38 капель в мин. под контролем рН. Для определения показателей системы гемостаза пробы крови забирали до и после введения лактата из бедренной артерии. В работе с экспериментальными животными были соблюдены требования, изложенные в «Методических рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» от 1985 г. Статистическая обработка материала проводилась на ПЭВМ Pentium 5 с использованием пакета программ Microsoft Excel 2007 для операционной системы Windows 7. Достоверность различий показателей в группах оценивали по величине t -критерия Стьюдента

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что молочная кислота в опытах in vitro оказывает выраженное влияние на систему свертывания крови. Сдвиг рН в кислую сторону как в плазме, так и в цельной крови приводит к двухфазным изменениям гемокоагуляции. По мере подкисления плазмы от 7,4 до 7,22–7,10 скорость образования фибринового сгустка увеличивается, дальнейший сдвиг реакции среды в кислую сторону приводит к замедлению свертываемости крови и при рН 6,0 сгусток не образуется. Активность факторов, входящих в протромбиновый комплекс, наиболее устойчива к сдвигу рН в кислую сторону, VII фактор проявляет оптимальную активность при рН 7,40–7,22, дальнейшее подкисление среды приводит к быстрой его инактивации. Тромбиновое время в присутствии различных концентраций молочной кислоты также претерпевает двухфазные изменения. В малых дозах (до 5,95 ммоль/л) лактат укорачивает время перехода фибриногена в фибрин за счет связывания естественных антикоагулянтов, в больших (16,6 ммоль/л) – блокирует формирование фибрина в связи с нарушениями полимеризации фибрин – мономера (табл. 1).

Внутривенное введение 3 %-го раствора лактата приводит к выраженному ацидозу (рН – 7,10), падению щелочного резерва и уровня кислорода в крови. На фоне изменения внутренней среды организма происходит резкая активация процессов свертываемости крови – время рекальцификации укорачивается почти вдвое. Протромбиновое время обычной плазмы и плазмы с низким содержанием V и VII факторов практически не изменяется, активность антигемофильного глобулина возрастает. Ацидоз сопровождается устойчивым падением уровня фибриногена. В то же время лизис эуглобулинов в течение опыта остается замедленным. Снижение концентрации фибриногена и появление в крови фибриногена В заставляет предположить, что введение больших доз лактата сопровождается внутрисосудистым свертыванием крови (табл. 2).

Таблица 1

Влияние различных концентраций молочной кислоты на свертывание плазмы и фибринолиз в опытах in vitro (M ± m)

Примечание: * – p < 0,05, ** – p < 0,01, ***- p < 0,001 – различия достоверны между контролем и опытом.

Таблица 2

Влияние внутривенного введения 4 % раствора молочной кислоты на свертывание, фибринолиз и некоторые физико-химические показатели крови (M ± m)

Примечание: * – p < 0,05, ** – p < 0,01, ***- p < 0,001 – различия достоверны между контролем и опытом.

В следующей серии опытов изучали агрегацию тромбоцитов при различных сдвигах рН (7,50; 7,4; 7,34; 7,2; 7,18; 6,92; 6,8; 6,50; 6,11). Анализ кривых агрегации в контрольных наблюдениях показывает, что тромбоциты без добавления агрегирующего агента не склеиваются. Кривые агрегации, записанные при рН 7,4–7,5, характеризуют нормальную реакцию тромбоцитов на дозу АДФ, равную 0,0005 мк/мл плазмы (рис. 1).

Рис. 1. Варианты кривых агрегации тромбоцитов под влиянием АДФ (контроль)

Замена в изучаемых пробах физиологического раствора на различные концентрации молочной кислоты приводила к изменению характера агрегации тромбоцитов (рис. 2). При уменьшении рН до 7,34 в отдельных случаях появлялась спонтанная агрегация тромбоцитов, которая составляла по средним данным 2,5°, при этом время начала агрегации после внесения АДФ увеличивается не достоверно. Угол агрегации снижался до 59,0°. Процесс становился более растянутым, он удлинялся до 369 с, однако ввиду большой вариабильности результатов эти изменения не достоверны. Амплитуда агрегации пластинок уменьшалась, величина агрегатов оставалась практически неизменной. Сдвиг реакции среды в кислую сторону приводит также к снижению интенсивности дезагрегации. Более выраженные изменения агрегации наблюдались, если рН пробы равнялся 7,2. При такой концентрации водородных ионов во всех опытах обнаружена спонтанная агрегация тромбоцитов. Внесение в кювету калориметра агрегирующего агента усиливало склеивание кровяных пластинок, однако средняя величина угла агрегации падала до 42°, процесс агрегации становился бесконечным и через 900 с плотность плазмы достигала 33,5 %. Величина агрегатов при рН 7,13 оставалась такой же, как в контроле, дезагрегация отсутствовала во всех экспериментах. Дальнейшее подкисление среды приводило к более выраженным изменениям агрегации, основной особенностью которых являлось увеличение угла спонтанной агрегации в присутствии лактата и блокирование специфического действия АДФ. При рН 6,92 угол спонтанной агрегации тромбоцитов возрастал до 11,3° (р < 0,2), при 6,50 до 16° (р < 0,05), при 6,11 до 21,8° (р < 0,05). Угол наклона агрегации под влиянием АДФ в пробе с рН 6,92 несколько увеличивался, при рН 6,5 и 6,11 внесение АДФ уже не приводило к дальнейшему изменению угла агрегации. «Спонтанное» склеивание кровяных пластинок в кислой среде всегда было необратимым, амплитуда агрегации со временем увеличивалась.

аб

вг

Рис. 2. Агрегация тромбоцитов под влиянием различных концентраций молочной кислоты:а – кривая агрегации тромбоцитов при рН крови 7,0; б – кривая агрегации тромбоцитов при рН крови 7,2; в – кривая агрегации тромбоцитов при рН крови 6,9; г – кривая агрегации тромбоцитов при рН крови 6,42

Таким образом, тромбоциты при сдвигах в кислую сторону или ацидозе способствуют повышению гемокоагуляционных свойств крови и приобретают способность к спонтанной агрегации. Интересно проследить, как изменяется электрокинетический потенциал кровяных пластинок при ацидозе, вызываемом внутривенной инъекцией молочной кислоты.

В следующей серии наблюдений было выявлено, как влияют сдвиги рН в кислую сторону при внутривенном введении 3 % молочной кислоты из расчета 10 мл/кг веса (опыты на 8 собаках) на электрокинетический потенциал тромбоцитов (табл. 3).

Таблица 3

Влияние инъекции 4 % раствора молочной кислоты на дзета-потенциал тромбоцитов (M ± m)

Примечание: р – достоверность различий между контролем и опытом, n – количество исследований.

До инъекции молочной кислоты дзета-потенциал тромбоцитов, полученных из крови бедренной артерии, равнялся 14,958 мв. На фоне введения лактата электрокинетический заряд кровяных пластинок падал до 13,940 мв или на 6,9 % (Р < 0,05). Одновременно в системном кровотоке наблюдалось увеличение концентрации молочной кислоты с 11 до 26 об % (Р < 0,002), снижение рН с 7,30 до 7,07 (Р < 0,001), щелочного резерва со 110 до 90 м-экв/л (Р < 0,05) и уровня кислорода с 17 до 14 об % (Р < 0,05). На 10-й минуте после введения кислоты метаболические показатели частично восстанавливались, наряду с этим имело место и увеличение дзета-потенциала тромбоцитов. Из приведенных данных видно, что метаболические сдвиги, возникающие в организме в ответ на появление в кровеносном русле лактата, сопровождается снижением электрокинетического потенциала тромбоцитов. Снижение заряда кровяных пластинок создает благоприятные условия для их взаимного склеивания и нарушения движения крови по микроциркуляторному руслу. Ацидоз, вероятно, приводит к снижению не только электрокинетического потенциала форменных элементов крови, но и сосудистой стенки, что должно сопровождаться адгезией пластинок к поверхности эндотелия. В связи с этим можно наблюдать два одновременно протекающих процесса: с одной стороны – нарушение микроциркуляции тромбоцитарными агрегатами, и с другой – снижение числа тромбоцитов за счет прилипания их к измененной внутренней поверхности крупных сосудов.

Таким образом, гиперкоагуляция, возникающая при сдвигах рН крови в кислую сторону, сопровождается увеличением активности плазменных факторов, более быстрой полимеризацией фибрина, спонтанной агрегацией, нарушением процессов дезагрегации и понижением электрокинетического потенциала тромбоцитов.

Работа выполнена в рамках Государственного задания по вузу Минобрнауки РФ, № 4.3604.2011.

Рецензенты:

Степанов А.В., д.м.н., зав. кафедрой безопасности жизнедеятельности и медицины катастроф Читинской государственной медицинской академии, г. Чита;

Авсеенко Н.Д., д.м.н., профессор кафедры безопасности жизнедеятельности и защиты окружающей среды Забайкальского института железнодорожного транспорта (ИрГУПС), г. Чита.

Работа поступила в редакцию 07.05.2013