Актуальной проблемой медицины является расшифровка механизма действия биологически активных веществ эндогенного происхождения, способных выступать в роли мультипотентных регуляторов гомеостаза. Ранее нами убедительно продемонстрирована роль белков острой фазы церулоплазмина и альфа-1-кислого гликоапротеина в регуляции активности единой клеточно-гуморальной защитной системы организма [2-7, 13]. В последние годы объектом пристального внимания многих отечественных и зарубежных исследователей выступает эритропоэтин [1]. Нами показано участие эритропоэтина (ЭПО) в коррекции аффективного статуса у больных хронической почечной недостаточностью [11]. По нашим данным, ЭПО снижает выраженность геморрагического синдрома у больных хронической почечной недостаточностью, регулирует функциональную активность тромбоцитов и плазменных протеолитических систем при хронической почечной недостаточности (ХПН) в клинических и экспериментальных условиях [8–10, 12]. Возникает вопрос о возможности регуляторного влияния ЭПО на активность тромбоцитов и плазменных систем гемостаза и антигемостаза в интактных условиях вне зависимости от наличия патологии. Цель работы – исследовать влияние ЭПО на функциональную активность тромбоцитов и плазменных систем гемостаза и антигемостаза в экспериментальных условиях in vitro.
Материалы и методы исследования
Для реализации поставленной цели использована цельная кровь 96 клинически здоровых добровольцев-доноров Челябинской областной станции переливания крови и 30 больных ХПН, не принимающих ЭПО, находящихся на лечении гемодиализом в ГБУЗ ЧОКБ. Стабилизацию крови осуществляли 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 1:5 для исследований агрегации тромбоцитов и 1:9 – для исследований коагуляционного гемостаза. ЭПО в форме препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, «Roche», Швейцария) применяли в концентрациях 30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/л, что соответствует 200, 100, 50, 25, 12,5 % от его нормальной концентрации в сыворотке. После добавления ЭПО плазму инкубировали в условиях термостата при температуре 37 °С в течение 30 мин. АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали с помощью двуканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «LA-230» (Россия). Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) кровь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Затем получали бедную тромбоцитами плазму (БТП), для чего остаток центрифугировали в течение 15 минут, при 4500 об/мин. Смешиванием ОТП и БТП получали тромбоцитарную плазму с концентрацией тромбоцитов 300∙109/л. В качестве индуктора агрегации использовали динатриевую соль АДФ в концентрации 0,109 М. Регистрировали амплитуду агрегации (%), время агрегации (мин), скорость агрегации (% мин). Для исследования коагуляционного гемостаза плазму получали путем центрифугирования цельной крови при 3000 об/мин в течение 15 мин. С использованием коагулометра «АПГ2-02» (Россия) определяли тромбиновое время (ТВ), активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), протромбиновое время (ПТВ), концентрацию фибриногена (ФГ) в плазме, активность антитромбина (АТ), XIIа-зависимый (хагеманзависимый) фибринолиз (ФЛ) с использованием реактивов фирмы «Технология-Стандарт» (Россия, Барнаул). Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критериев Манна–Уитни, Вальда–Вольфовитца, Уилкоксона. Для выявления связи между изучаемыми параметрами использовали коэффициенты корреляции Спирмена (R) и Гамма.
Результаты исследования и их обсуждение
На первом этапе исследовали влияние ЭПО на агрегацию тромбоцитов, полученных от больных ХПН, т.к. при ХПН содержание ЭПО прогрессивно снижается, что позволяет исследовать функцию тромбоцитов в условиях дефицита эндогенного ЭПО и при добавлении к ним различных концентраций экзогенного ЭПО. Установлено, что ЭПО ускоряет агрегацию тромбоцитов во всех дозах, кроме максимальной (30 МЕ/л). Ускорение агрегации тромбоцитов достигается за счет уменьшения времени процесса, а не увеличения амплитуды, более того, амплитуда процесса при этом значимо уменьшается (табл. 1). Создается впечатление, что большие дозы ЭПО оказывают ингибирующий, а малые – стимулирующий эффект на реактивность тромбоцитов. Причем по мере уменьшения дозы скорость агрегации тромбоцитов нарастает. Для выявления дозозависимого эффекта ЭПО был использован корреляционный анализ в парах «доза» – «эффект», в качестве интегрального показателя «эффекта» ЭПО использована скорость агрегации. Установлено, что скорость агрегации тромбоцитов нарастает по мере снижения дозы ЭПО (коэффициент корреляции Спирмена R = −0,44; р < 0,05).
Таблица 1
Влияние ЭПО на показатели агрегации тромбоцитов больных ХПН (M ± m)
|
Показатели Группы сравнения |
Амплитуда агрегации, % |
Время агрегации, мин |
Скорость агрегации, %/мин |
|
Группа 1 (n = 6) тромбоциты + физ. р-р |
62,50 ± 8,59 |
4,78 ± 0,76 |
14,66 ± 2,92 |
|
Группа 2 тромбоциты + ЭПО 30 МЕ/л (n = 6) |
28,17 ± 2,75 p = 0,004 |
2,68 ± 0,96 |
16,03 ± 3,14 |
|
Группа 3 тромбоциты + ЭПО 15 МЕ/л (n = 6) |
38,63 ± 5,12 p = 0,002 |
2,93 ± 1,03 |
23,52 ± 6,64 p = 0,02 (WW) |
|
Группа 4 тромбоциты + ЭПО 7,5 МЕ/л (n = 6) |
51,13 ± 2,17 |
2,02 ± 0,52 p = 0,02 |
34,31 ± 7,59 p = 0,02 (U) |
|
Группа 5 тромбоциты + ЭПО 3,75 МЕ/л (n = 6) |
44,1 ± 5,63 |
2,46 ± 1,04 |
41,84 ± 10,00 p = 0,04 (W) |
|
Группа 6 тромбоциты + ЭПО 1,88 МЕ/л (n = 6) |
71,23 ± 5,26 |
1,34 ± 0,22 p = 0,003 |
60,39 ± 8,51 p = 0,04 (W) |
Примечание. Здесь и далее р – показатель значимости различий при сравнении с группой 1.
Для выявления эффекта ЭПО на функциональную активность тромбоцитов независимо от наличия патологии нами проведены аналитические эксперименты in vitro в условиях, аналогичных при исследовании уремических тромбоцитов (табл. 2). При этом ЭПО добавляли к интактным тромбоцитам, полученным от клинически здоровых добровольцев-доноров.
Как видно, ЭПО ускоряет агрегацию тромбоцитов при всех используемых дозах. Эффект ЭПО в одних случаях реализовался за счет увеличения амплитуды процесса, в других был связан с укорочением времени агрегации. С использованием непараметрического корреляционного анализа установлено, что скорость агрегации тромбоцитов нарастает по мере снижения дозы ЭПО (коэффициент корреляции Гамма = −0,23; р < 0,05).
Таблица 2
Влияние ЭПО на показатели агрегации тромбоцитов здоровых людей (M ± m)
|
Показатели Группы сравнения |
Амплитуда агрегации, % |
Время агрегации, мин |
Скорость агрегации, %/мин |
|
Группа 1 тромбоциты + физ. р-р (n = 8) |
107,40 ± 15,54 |
4,79 ± 0,92 |
25,89 ± 3,06 |
|
Группа 2 тромбоциты + ЭПО 30 МЕ/л (n = 8) |
83,33 ± 4,79 p < 0,01 |
4,25 ± 1,06 p = 0,04 |
33,16 ± 8,11 p = 0,002 |
|
Группа 3 тромбоциты + ЭПО 15 МЕ/л (n = 8) |
81,12 ± 9,35 |
2,29 ± 0,28 |
39,36 ± 5,75 р = 0,04 |
|
Группа 4 тромбоциты + ЭПО 7,5 МЕ/л (n = 8) |
93,30 ± 7,36 |
2,30 ± 0,29 р = 0,01 |
42,90 ± 4,31 р = 0,01 |
|
Группа 5 тромбоциты + ЭПО 3,75 МЕ/л (n = 8) |
78,30 ± 6,63 |
2,42 ± 0,64 p = 0,01 |
47,28 ± 8,30 p = 0,002 |
|
Группа 6 тромбоциты + ЭПО 1,88 МЕ/л (n = 8) |
130,37 ± 23,13 р = 0,03 |
3,49 ± 0,84 p < 0,01 |
53,91 ± 12,27 р = 0,04 |
В аналитических условиях in vitro ЭПО изменял показатели коагуляционного гемостаза после 30-минутной инкубации с цельной кровью здоровых людей (табл. 3). Отмечено угнетение активности системы фибринолиза в связи с удлинением времени фибринолиза. Гипокоагуляционный эффект ЭПО обусловлен заинтересованностью факторов внешнего и внутреннего, т.к. наряду с укорочением тромбинового времени при всех используемых дозах, наблюдалось укорочение ПТВ во всех дозах кроме минимальной (1,88 МЕ/л), и укорочение АПТВ при добавлении ЭПО в дозе 7,5 и 30 МЕ/л. Дисперсионный однофакторный анализ позволил установить, что влияние ЭПО на показатели системы фибринообразования может составить (р < 0,05): для тромбинового времени не менее 21,54 % и не более 72,28 % от общего влияния всей суммы факторов; для протромбинового времени – не менее 19,94 % и не более 64,32 % от общего влияния всей суммы факторов.
Таким образом, ЭПО ускоряет агрегацию интактных и уремических тромбоцитов; скорость агрегации тромбоцитов увеличивается по мере снижения дозы ЭПО от 30 МЕ/л до 1,88 МЕ/л. Добавление ЭПО к интактной плазме угнетает систему фибринолиза и оказывает гипокоагуляционный эффект в диапазоне доз от 1,88 до 30 МЕ/л.
Таблица 3
Влияние ЭПО на активность систем плазменного протеолиза (M ± m)
|
Группы Показатели |
Группа 1 Кровь + физ. р-р n = 8 |
Группа 2 Кровь + ЭПО 1,88 МЕ/л n = 8 |
Группа 3 Кровь + ЭПО 3,75 МЕ/л n = 8 |
Группа 4 Кровь + ЭПО 7,5 МЕ/л n = 8 |
Группа 5 Кровь + ЭПО 15 МЕ/л n = 8 |
Группа 6 Кровь + ЭПО 30 МЕ/л n = 8 |
|
ТВ, с |
14,65 ± 0,49 |
15,73 ± 0,35 р = 0,01 |
16,05 ± 0,65 р = 0,02 |
18,03 ± 1,05 р = 0,001 |
16,60 ± 0,85 р = 0,05 |
17,10 ± 0,70 р = 0,01 |
|
АПТВ, с |
33,53 ± 0,68 |
33,30 ± 1,36 |
34,33 ± 1,66 |
40,18 ± 4,69 р = 0,05 |
33,20 ± 1,82 |
39,40 ± 1,44 р = 0,001 |
|
ПТВ, с |
15,30 ± 0,59 |
15,63 ± 0,66 |
17,53 ± 1,05 р = 0,001 |
18,08 ± 0,99 р = 0,001 |
16,90 ± 0,78 р = 0,001 |
16,73 ± 0,68 р = 0,001 |
|
ФГ, г/л |
3,16 ± 0,21 |
3,08 ± 0,28 |
2,83 ± 0,22 |
2,99 ± 0,24 |
3,03 ± 0,23 |
2,99 ± 0,25 |
|
ФЛ, мин |
5,58 ± 0,17 |
4,90 ± 0,20 р = 0,001 |
5,05 ± 0,16 р = 0,001 |
4,90 ± 0,55 |
5,15 ± 0,06 р = 0,01 |
4,98 ± 0,21 р = 0,001 |
|
АТ, с |
105,30 ± 2,63 |
111,43 ± 4,94 |
100,85 ± 5,59 |
109,88 ± 5,92 |
102,80 ± 5,83 |
109,57 ± 2,28 |
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 12-04-31726 «Механизм влияния эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов».
Рецензенты:
Абрамовских О.С., д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;
Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.
Работа поступила в редакцию 11.04.2013.