За период с 2009 по 2012 гг. в Тюменской области показатель заболеваемости на 1000 госпитализированных пациентов колебался в пределах от 0,84 до 1,4. Всего за эти годы зарегистрировано 1239 случаев ИСМП, вызванных культивируемыми бактериями. Наибольшее количество заболеваний зарегистрировано в хирургических стационарах (610 случаев) и среди новорожденных и родильниц (368 случаев) [4]. Анализ лабораторной диагностики инфекционных заболеваний в Тюменской области показал, что до настоящего времени основным методом диагностики инфекционных заболеваний было выделение чистых культур микроорганизмов и их идентификация. Однако в последние годы сформировалось новое представление об экологии микроорганизмов, колонизирующих различные ткани организма человека. В кишечнике, на поверхности слизистых оболочек, коже, зубах находятся специфически организованные ассоциации микроорганизмов, покрытых биопленкой. Электронная микроскопия ожоговых ран показала, что 60 % биоптатов, взятых с поверхности ран у больных с хронической инфекцией, содержат биопленкообразующие бактерии [14]. В биопленках бактерии находятся в некультивируемом состоянии, выработанном в течение миллионов лет под влиянием естественного отбора в меняющихся экологических условиях [11]. В основе формирования биопленок лежат физико-химические взаимодействия микробных клеток, так, Staphylococcusepidermidis синтезирует полисахаридный межклеточный адгезии, который обеспечивает адгезию между микробными клетками и в последующем участвует в образовании биопленки [6]. Находясь в жизнеспособном, но в неактивном состоянии, они могут длительное время находиться во внешней среде, а также в организме человека или животного, не вызывая патологических изменений в тканях и органах, но при определенных условиях эти бактерии могут переходить в активное (культивируемое) состояние.
В настоящее время достоверно доказана роль биопленкообразующих бактерий в возникновении и развитии госпитальных инфекций [1]. По данным Центра контроля за заболеваемостью в США, до 80 % инфекционной патологии человека связано с образованием микробных биопленок [12]. Среди клинически значимых бактерий способность образовывать биопленки показана для представителей семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp., Actinomyces spp., Pseudomonas spp. и Haemophilus spp. [2]. Имеются данные, свидетельствующие, что микробную ассоциацию биопленок можно рассматривать как форму существования нормальной микрофлоры человека [10].
На наш взгляд, переход некультивируемых бактерий в культивируемое состояние необходимо рассматривать в общебиологическом плане, а не только с позиций микробиологических исследований с использованием стандартных питательных сред для роста и размножения бактерий. Некультивируемые и культивируемые бактерии могут находиться в различных ассоциациях в биологических жидкостях организма человека и животного, во внешней среде, а также в дезинфицирующих растворах, широко применяемых в ЛПУ.
Целью настоящих исследований явилось изучить влияние микробных ассоциаций на развитие инфекционного процесса.
Материалы и методы исследований
Проведен анализ микробных ассоциаций кишечника у детей до года и взрослых, обратившихся в ЛПУ г. Тюмени по поводу дисбактериоза кишечника. За период с 2002 по 2010 гг. обследовано 869 лиц. Готовили взвесь испражнений в буферном 0,85 % растворе хлорида натрия. Из различных разведений микробных взвесей проводили посев бактерий на чашки Петри с питательными средами: Плоскирева, Эндо, Левина, кровяной агар, Сабуро, MRS (для выделения лактобацилл), энтерококкагар, посев по Шукевичу и модифицированную жидкую среду Блаурокка. Для изучения морфологии бактерий готовили мазки с последующей окраской по Граму, изучали биохимические свойства и идентифицировали выделенные культуры по тестам, регламентированным нормативной документацией.
Изучена однородность 120 штаммов бактерий, выделенных от пациентов г. Тюмени с использованием «Хладотермостата» [7]. На базе ООО «Научно-производственного инновационного предприятия «Тюменский институт микробиологических технологий» (НПИП ТИМТ разработана экспериментальная модель «Хладотермостата», позволяющая переводить бактерии из некультивируемого в культивируемое состояние. Экспериментальная модель создана на основе выпускаемого промышленностью термостата воздушного лабораторного ТВЛ-К, г. Санкт-Петербург. Проводили фракционирование госпитальных штаммов Staphylococcusaureus и следующих спорадических штаммов: S.aureus, Pseudomonasaeruginosa и E.coli. Выделено 120 фракций культивируемых и 120 фракций некультивируемых бактерий. Концентрацию бактерий определяли по результатам учета изолированных колоний, выросших на плотной питательной среде.
Влияние культивируемых и некультивируемых бактерий на инфекционный процесс изучали в опытах на кроликах породы шиншилла. Под наблюдением находилось 32 кролика. В опытной группе кроликов в количестве 16 голов проведено исследование влияния микстинфекции на инфекционный процесс, вызванный некультивируемыми P.aeruginosa и S.aureusна фоне ожоговой травмы. Контрольную группу кроликов (16 кроликов) инфицировали культивируемыми S.aureus и P.aeruginosa на фоне ожоговой травмы в условиях проведения основного опыта. Масса кроликов составила 2262,5 ± 28,36 грамм. Смесь бактерий животным вводили подкожно в левое бедро в концентрации 104–105 микробных клеток в 1 мл, выделенных от больных, находящихся на лечении в ожоговом отделении ГБУЗ ТО «Областная клиническая больница № 1» г. Тюмени. Перед термической травмой животным давали наркоз по методике, предложенной А.В. Разиной [5]. За животными наблюдали в течение 21 дня. При вскрытии погибших и выживших животных определяли количество культивируемых бактерий P.aeruginosa и S.aureus. В опытной и контрольной группах определяли количество культивируемых бактерий в следующих органах: почки, легкие и печень.
Эксперименты на кроликах породы «шиншилла» проводили в виварии ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья». Здоровых кроликов содержали в клетках в соответствии с требованиями санитарных правил (Утв. Главным государственным санитарным врачом № 1045–73).
Статистический анализ исследований проводили с помощью компьютерной программы Statistika v 6.0, с использованием средней арифметической и отклонением ошибки средней (М ± m).
Результаты исследования и их обсуждение
Анализ микробного пейзажа 869 больных дисбактериозом кишечника показал, что в 19,4 ± 1,5 % случаев в содержимом кишечника определялись микробные ассоциации, состоящие из 2-х и более видов бактерий. Установлено также, что при дисбактериозе происходит изменение микробного пейзажа кишечника. В 17,7 ± 1,4 % случаев от больных выделяется патогенная микрофлора с фекально-оральным механизмом передачи инфекции. S.aureus определялся в 30,8 ± 1,7 % случаев, а в 19,4 ± 1,5 % случаев (136 пациентов) выделялась условно патогенная микрофлора. Проведенный анализ показал, что больные дисбактериозом в 67,9 % случаев выделяют во внешнюю среду патогенные и условно-патогенные бактерии. Следовательно, они могут быть источником распространения внутрибольничных инфекций.
Одновременно установлено, что у больных дисбактериозом в 80,8 ± 1,5 % (702 пациента) случаев отмечались соматические и инфекционные заболевания (энтероколит, колиэнтерит и аллергический дерматит). Следовательно, для успешного лечения дисбактериоза необходимо обеспечить эффективное лечение сопутствующего заболевания.
По сравнению с нормальной микрофлорой кишечника микробный пейзаж у больных с дисбактериозом кишечника изменился. Отмечено уменьшение количества и частоты выделения типичной E.coli. У взрослых типичная E.coli определялась в 20,8 ± 1,5 % случаев, а у детей до года – в 14,7 ± 1,3 %. У больных отмечалось снижение количества анаэробов (бифидобактерий) и факультативных анаэробов. В 76,9 ± 1,6 % случаев наблюдалось значительное снижение количества или отсутствие лактобактерий и в 78,1 ± 1,6 % – бифидобактерий. Эти данные дают основание предположить, что в кишечнике снижается концентрация биопленкообразующей кишечной палочки. В.А. Гриценко с соавт. [3] установили вариабельность E.coli по способности образовывать биопленки. Меньшая часть (35,6 ± 7,2 %) бактерий не образовывала биопленки, а 64,4 ± 7,2 % E.coli были способны к биопленкообразованию. Как известно, в биопленках находятся микробные ассоциации, а постоянно выделяемая планктонная фракция микробных популяций очевидно выполняет функцию нормальной микрофлоры кишечника. На основании вышеизложенного возникает необходимость изучения биологических свойств биопленкообразующих E.coli в плане создания более эффективных препаратов для лечения дисбактериоза.
Изучение однородности 120 штаммов бактерий, выделенных от пациентов г. Тюмени, по методике, предложенной Л.Б. Козловым с соавт. [7], показали, что штаммы S.aureus, P.aeruginosa и E.coli состоят из неоднородных популяций. Неоднородность заключалась в том, что в популяциях бактерий определялись культивируемые и некультивируемые микроорганизмы одного и того же вида бактерий, причем концентрация некультивируемых бактерий была на 2 и более логарифма выше по сравнению с культивируемой фракцией. Как известно, вышеперечисленные бактерии обладают биопленкообразующей активностью, поэтому не исключено, что выделенные некультивируемые бактерии представляют собой планктонную фракцию выше перечисленных биопленкообразующих бактерий. Получение культивируемых и некультивируемых бактерий послужило основанием для изучения их инфекционной активности.
В опытах на кроликах породы шиншилла изучено влияние микст-инфекции, вызванной культивируемыми и некультивируемыми бактериями P.aeruginosa и S.aureus на фоне ожоговой травмы. Ожоговая травма нами была использована в качестве преморбидного фона в связи с тем, что на поверхности ожоговых ран формируется влажная, коагулированная биологическая ткань с постоянно пополняющимся запасом диффундирующих из плазмы питательных веществ, а температура животного обеспечивает оптимальные условия для интенсивного размножения микроорганизмов. Кроме того, при ожоговой травме возникают иммунодефицитные состояния.
Опыт на кроликах породы «шиншилла» показал, что после подкожного введения животным на фоне ожоговой травмы смеси некультивируемых бактерий S.aureus и P.aeruginosa в дозах, определяемых на поверхности ожоговых ран, отмечалась гибель кроликов в среднем на 3,43 ± 0,94 сутки в 87,5 ± 6,25 % случаев. Заболевание проявлялось следующими клиническими признаками: стон, крик, возбуждение, судороги. При вскрытии погибших животных отмечался отек мозговой ткани в 43,75 % случаев, а при микробиологическом исследовании мозговой ткани у трех кроликов выделены культивируемые бактерии P. aeruginosa. При вскрытии погибших животных на 9-е и 13-е сутки из печени, почек и легких при микробиологическом исследовании были выделены культивируемые бактерии P.aeruginosa и E.coli в концентрациях, вызывающих генерализованную инфекцию.
Проведенный экспериментальный опыт показал, что в организме кроликов в условиях проведения опыта создались благоприятные условия для перехода некультивируемых бактерий в культивируемое состояние, и в результате репродукции бактерий развился патологический процесс с летальным исходом.
В контрольной группе 16 кроликов, которым на фоне ожоговой травмы со средней площадью поражения 17,03 ± 0,63 % поверхности тела, также как и в опыте, вводили подкожно по 1,0 мл смеси бактерии S.aureus и P.aeruginosa в концентрации 104–105 микробных клеток в 1 мл, наблюдали гибель животных в 75,0 ± 6,25 % на 13,58 ± 0,63 сутки. Свыше 21 суток выжило 4 (25 %) кролика.
Проведенные исследования с культивируемыми бактериями показали, что ожоговая травма кожи в сочетании с продуктивной бактериальной инфекцией приводит к изменениям со стороны желудочно-кишечного тракта. За 2–3-е суток до летального исхода у 9 (75 %) из 12 погибших экспериментальных животных наблюдали клиническую картину пареза кишечника, которая проявлялась отказом от еды и вздутием живота. Полученные данные позволили сделать предположение о том, что в условиях проведенного эксперимента летальный исход был вызван микрофлорой пищеварительного тракта кролика, очевидно в результате пареза кишечника.
При бактериологическом исследовании внутренних органов погибших животных в почках, печени и легких определялась E.coli. При исследовании почек 12 (100 %) погибших экспериментальных животных выявлена ассоциированная микст-инфекция, вызванная E.coli и P.aeruginosa. Концентрация E.coli составила 2,5 ± 0,6∙109, а P.aeruginosa – 1,1 ± 0,7∙105 микробных клеток в 1 мл. При микробиологическом исследовании легочной ткани у 8 (66,7 %) погибших кроликов на 12–13 день содержание E.сoli и P.aeruginosa составило 4,7 ± 0,1∙109 и 2,55 ± 0,31∙104 микробных клеток в 1 мл соответственно. В печени у 8 (66,7 %) погибших животных на 12–13 день определяли E.сoli в титре 6,18 ± 0,31∙109 микробных клеток в 1 мл, а P.aeruginosa – 3,18 ± 0,45. У 3-х (25 %) кроликов – P.aeruginosa в концентрации 5,2 ± 0,82∙109, а E.сoli в титре 1,7 ± 0,55∙103 микробных клеток в 1 мл.
Итак, выявлены отличия в характере течения патологического процесса у кроликов породы шиншилла. Некультивируемые P.aeruginosa в организме кроликов переходили в культивируемое состояние в течение первых суток и вызывали патологический процесс с летальным исходом на 2–3 сутки при наличии признаков поражения головного мозга, а культивируемые бактерии P.aeruginosa вызывали гибель лабораторных животных на 13–14 сутки в результате развития продуктивного инфекционного процесса с развитием генерализованной инфекции.
Полученные результаты опыта на кроликах породы шиншилла коррелируют с клиническими наблюдениями. С.В. Хрулев [8] по результатам компьютерной томографии головного мозга и повышению уровня нейрон-специфической енолазы в сыворотке крови больных выявил признаки поражения головного мозга у больных с ожоговой травмой при инфекционном процессе. Наибольший риск возникновения церебральных осложнений при ожоговой болезни наблюдался в периоды с 1 по 5 и с 16 по 18 сутки после ожоговой травмы.
Результаты проведенных исследований позволили установить роль некультивируемых бактерий в инфекционной патологии человека, а также выявлена возможность формирования в ЛПУ источников инфекционных заболеваний, вызванных патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, среди больных с диагнозом «дисбактериоз». В плане совершенствования лабораторной диагностики инфекционных заболеваний перспективным направлением является разработка инновационных технологий по выявлению некультивируемых бактерий и биопленкообразующих бактерий в различных стадиях биопленкообразования.
Выводы
1. Анализ микробного пейзажа у больных с дисбактериозом кишечника показал, что больные дисбактериозом в 67,9 % случаев выделяют во внешнюю среду патогенные и условно-патогенные бактерии и могут служить источником распространения внутрибольничных инфекций.
2. Выявлено, что штаммы микроорганизмов S.aureus, P.aeruginosa и E.coli состоят из смешанных популяций, включающих ассоциации культивируемых и некультивируемых бактерий.
3. В эксперименте на кроликах породы шиншилла установлено, что на фоне термической травмы при подкожном введении смеси культивируемых бактерий P.aeruginosa и S.aureus происходит генерализованная инфекция грамотрицательными культивируемыми бактериями с колонизацией во внутренних органах (почки, легкие, печень): из кишечника – E.coli, а из подкожных локусов – P.aeruginosa с последующим развитием сепсиса и гибели 75,0 % животных в среднем на 13,58 ± 0,63 сутки. Диссеминация культуры золотистого стафилококка не регистрировалась.
3. Подкожная инкорпорация ассоциации некультивируемых бактерий P.aeruginosa и S.aureus на фоне термической травмы вызывала гибель 87,5 % лабораторных животных на 3,43 ± 0,94 сутки при явлениях поражения головного мозга и выявлением в печени, почках и легких культивируемых бактерий P.aeruginosa.
4. В плане совершенствования лабораторной диагностики инфекционных заболеваний перспективным направлением является разработка инновационных технологий по выявлению некультивируемых и биопленкообразующих бактерий в различных стадиях биопленкообразования.
Рецензенты:
Мефодьев В.В., д.м.н., профессор кафедры медико-профилактического дела ФПК и ППС, ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Тюмень;
Мальчевский В.А., д.м.н., главный научный сотрудник Отдела протекторных механизмов репродуктивных систем криосферы, ФГБУН «Тюменский научный центр» СО РАН, г. Тюмень.
Работа поступила в редакцию 15.08.2013.