Scientific journal
Fundamental research
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

MAKING LABELED WITH TECHNETIUM-99M NANODISPERSED DTPA DERIVATIVES KOMPLEKSONAM

Skuridin V.S. 1 Stasyuk E.S. 1 Varlamova N.V. 1 Nesterov E.A. 1 Belyanin M.L. 1 Sadkin V.L. 1 Rogov A.S. 1
1 National Research Tomsk Polytechnic University
В работе исследована возможность получения меченных технецием-99м коллоидных нанодисперсных систем с регулируемыми свойствами на основе производных комплексона ДТПА с гидрофобными (липофильными) заместителями, обеспечивающими стабильность наноколлоидов в водной среде. В результате экспериментов, проведенных на четырнадцати смесях с различным соотношением компонентов и приготовленных по разным методикам, были определены оптимальные условия получения меченного ДТПАмод путем прямого взаимодействия элюата 99mTc с раствором смеси [0,107 мг ДТПАмод + 0,14 мг SnCl2]. В результате проведенных исследований определены условия введения радиоактивной метки 99mTc в структуру модифицированного ДТПА и подобраны количественные составы реагентов для наработки опытных партий наноколлоидных препаратов. Содержание радиохимической примеси 99mTc (VII) в полученном наноколлоидном препарате составляет 2,7 %.
We have studied the possibility of technetium-99m-labeled colloidal nano-dispersed systems with controlled properties on the basis of the chelator DTPA derivatives with hydrophobic (lipophilic) substituents nanocolloids ensure stability in aqueous media. As a result of experiments conducted on fourteen mixtures with different ratios of ingredients and prepared by different methods, were the optimal conditions for obtaining labeled DTPAmod by direct interaction 99mTc elution with a solution of a mixture of [DTPAmod 0,107 mg + 0,14 mg SnCl2]. The studies identified conditions radiolabeling 99mTc DTPA modified the structure and quantitative compositions of selected reagents for production of pilot batches nanokolloidnyh drugs. Radiochemical impurity content 99mTc (VII) obtained in Preparation nanokolloidnom is 2,7 %.
technetium
DTPA
nanocolloids
chromatogram
1. Beljanin M.L. Usov V.Ju. Borodin O.Ju. Filimonov V.D. Vizualizacija pogloshhenija miokardom fenilpentadekanovoj kisloty, mechenoj Mn(II)DTPA, s ispol’zovaniem nizkopol’noj magnitno-rezonansnoj tomografii v jeksperimente // Medicinskaja vizualizacija. 2007. no. 2. pp. 124–129.
2. Becker W.S. Behr T.M. Cumme F. Rössler W. Wendler J. Kern P.M. Gramatzki M. Kalden J.R. Goldenberg D.M. Wolf F.G. 67Ga citrate versus 99mTc-labeled LL2-Fab’ (anti-CD22) fragments in the staging of B-cell non-Hodgkin’s lymphoma, Cancer Res., 1995, no.1;55, pp. 5771–5773.
3. Ciambellotti E. Lanza E. Coda C. Cartia G.L. Comparison of 2 microcolloids labeled with 99m Tc Minerva Med, Lymphoscintigraphy., 1986, no. 10;77, pp. 313–319.
4. Miot-Noirault E. Perin F. Routledge L. Normier G. Le Pape A. Macrophage targeting with technetium-99m labelled J001 acylated poly-galactoside for scintigraphy of inflammation: optimization and assessment of imaging specificity in experimental arthritis, Eur J Nucl Med., 1996, no. 23(1), pp. 61–69.
5. Yoshida H. Uno K. Minoshima S. Imazeki K. Miyoshi T. Saitou M. Akiba H. Arimizu N. Fundamental study of 99mTc nanocolloids for inflammation imaging, Radioisotopes., 1989, no. 38(8), p. 347.

Использование в медицине радиоактивных наноколлоидных материалов открывает широкие возможности для проведения высокоинформативных диагностических исследований [2]. Например, наноколлоиды с технецием-99м (99mТс) нашли применение в кардиологии для мечения аутолейкоцитов с целью диагностики воспалительных процессов [5], а также в онкологии для проведения лимфосцинтиграфии и выявления «сторожевых» лимфатических узлов у онкологических больных [3]. Данный метод обладает достаточно высокой чувствительностью в плане выявления заболеваний в сочетании с высоким разрешением получаемых сцинтиграфических изображений и минимальной радиационной нагрузкой на организм [4].

В настоящее время рассматривается два принципиальных подхода к формированию наночастиц на основе неорганической и органической матриц. Первый из них подразумевает получение уже готовых частиц, например, нанопорошков с заданными размерами и последующей их модификацией. Второй подход заключается в создании коллоидных нанодисперсных систем с регулируемыми свойствами на основе органических хелатирующих агентов. В соответствии с этим подходом, в работе был проведен комплекс исследований по созданию меченных 99mTc производных комплексона ДТПА, несущих гидрофобные (липофильные) заместители. Данные заместители обеспечивают образование стабильных наноколлоидных систем в водной среде.

Цель исследования – создание меченных 99mTc производных комплексона ДТПА.

Материалы и методы исследования

Исходная субстанция (ДТПАмод) была синтезирована на Кафедре биотехнологии и органической химии Института физики высоких технологий [1]. Для получения препарата 99mTc в виде раствора натрия пертехнетата,99mTc использовали сорбционный генератор «99mTc-ГТ-ТОМ» производства Физико-технического института ТПУ.

Введение радиоактивной метки 99mТс в наноколлоидную субстанцию проводили двумя способами: путем смешивания растворов, содержащих ДТПАмод и восстанавливающий агент SnCl2 с элюатом технеция-99м из 99Мо/99mТс-генератора, а также путем растворения сухих остатков, полученных после упаривания растворов ДТПАмод и SnCl2 в элюате 99mТс.

С этой целью предварительно готовили по отдельности раствор активного вещества ДТПАмод и раствор восстановителя SnCl2∙2Н2О.

Для приготовления коллоидного раствора ДТПАмод использовали следующую методику. Навеску модифицированного ДТПА массой 0,027 г количественно перенесли в мерную колбу вместимостью 25 мл и растворили в 20 мл 5 %-го раствора NaHCO3 при нагревании до 80 °С. После довели объем этим же раствором до метки (концентрация 1,1 мг/мл). Затем в полученном растворе провели определение размеров частиц по оптической плотности коллоидной системы в различных участках видимой области спектра (λ = 400–800 нм) с использованием спектрофотометра Unico 2802(S). Было установлено, что средний радиус частиц составляет 93 нм, а их диаметр 187 нм. С целью уменьшения размера частиц суспензию нагрели на водяной бане до 70 °C и обработали в ультразвуковой ванне в течение 40 мин, что позволило снизить средний радиус частиц до 60 нм.

Для приготовления исходного раствора восстановителя Sn (II) навеску SnCl2∙2Н2О массой 70 мг растворили в 200 мкл 1 М раствора HCl и довели объём раствора до 10 мл дистиллированной водой (концентрация 7 мг/мл).

В дальнейшем полученные растворы смешивали в разных соотношениях с последующим добавлением к этим смесям элюата 99mТс и снимали их радиохроматограммы с целью определения радиохимического выхода продуктов взаимодействия, в том числе и меченного 99mТс – ДТПАмод.

В качестве подвижных фаз для хроматографирования использовали смеси:

а) хлороформ:метанол:вода:уксусная кислота (лед) = 4:4:0,1:0,3 (система № 1), время хроматографирования 20 мин;

б) хлороформ:этанол:аммиак (конц) = 5:5:1 (система № 2), время хроматографирования 60 мин;

в) ацетон, время хроматографирования 10 мин.

Ацетон был выбран в качестве подвижной фазы для определения непрореагировавших пертехнетат-ионов 99mТс(VII), распределение которых по хроматограмме проходит достаточно быстро, около 10 мин. Системы № 1 и 2 подбирали с учетом свойств модифицированного ДТПА. Линия старта на хроматограммах – 20 мм от нижнего края.

Параллельно с радиометрическим определением пиков, меченых 99mТс продуктов, проводили определение местоположения на полученных хроматограммах пятен немеченых исходных субстанций с помощью УФО-кабинета и камеры, насыщенной парами йода. В качестве эталонного раствора использовали 10 %-й раствор гидрокарбоната натрия, содержащего ДТПАмод в количестве 1 мг/мл. Место расположения пятна модифицированного ДТПА находили по его характерному свечению в ультрафиолетовом свете и появлению коричневого пятна в йодной камере. В результате было установлено, что исходной субстанции модифицированного ДТПА соответствует область Rf = 0,5.

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение радиохроматограмм, полученных при анализе проб исходного элюата 99mTc из генератора, показало, что пертехнетат-ионам семивалентного 99mТс на ленточках хроматограмм во всех выбранных подвижных фазах (системах) соответствует пик с Rf = 0,9. То же самое наблюдается при прямом взаимодействии 99mTc с модифицированным ДТПА. Здесь также во всех системах на хроматограммах наблюдается единственный пик в области Rf = 0,9, что свидетельствует об отсутствии взаимодействия ДТПАмод с 99mТс(VII).

Напротив, при введении в элюат 99mTc восстановителя Sn(II) основной пик смещается, практически, к линии старта в область Rf = 0,1, что позволяет предполагать образование малоподвижного гидролизованного оксида 99mТсО2. Не исключена также хемосорбция радионуклида на поверхности коллоида олова, образующегося при гидролизе SnCl2∙2Н2О. Вероятность такого взаимодействия достаточно велика, т.к. количество ядер 99mTc несоизмеримо мало по сравнению с количеством атомов олова. Информация в литературе по этому вопросу отсутствует. Тем не менее тот факт, что смещение пика в область Rf = 0,1 связано с восстановлением 99mTc, не вызывает сомнения.

В процессе работы были исследованы смеси следующего состава.

Смесь № 1. Во флакон вместимостью 10 мл ввели 0,1 мл 5 %-го раствора гидрокарбоната натрия, содержащего ДТПАмод в количестве 1,1 мг/мл, 0,02 мл раствора хлорида олова с концентрацией SnCl2∙2Н2О 7 мг/мл и 5 мл элюата 99mТс. После инкубирования смеси в течение 20 мин провели отбор проб объемом 5 мкл для хроматографирования. рН раствора = 7.

Смесь № 2. Во флакон ввели 0,1 мл 10 %-го раствора гидрокарбоната натрия, содержащего ДТПАмод в количестве 1,1 мг/мл, 0,01 мл 1 М раствора NaOH, содержащего Sn в количестве 11,9 мг/мл (по металлу) и 5 мл элюата 99mТс. Время инкубирования 20 мин. рН раствора = 8.

Смесь № 3. Во флакон ввели 0,1 мл обезвоженного спирта, содержащего ДТПАмод в количестве 1 мг/мл, 0,01 мл обезвоженного спирта, содержащего Sn в количестве 6,3 мг/мл (по металлу) и 5 мл элюата 99mТс. Инкубировали в течение 20 мин. рН раствора = 6.

Смесь № 4. Во флакон ввели 1 мл обезвоженного спирта, содержащего ДТПАмод в количестве 1 мг/мл, 0,01 мл обезвоженного спирта, содержащего Sn в количестве 1 мг/мл (по металлу) и 5 мл элюата, 99mТс. Инкубировали в течение 20 мин. рН раствора = 6.

Смесь № 5. Во флакон ввели 0,1 мл 10 %-го раствора гидрокарбоната натрия, содержащего ДТПАмод в количестве 1 мг/мл и 0,01 мл 1 М раствора NaOH, содержащего Sn в количестве 11,9 мг/мл (по металлу). Смесь высушили до сухого остатка и ввели 5 мл элюата 99mТс. Инкубировали в течение 20 мин. рН раствора = 8.

Смесь № 6. Во флакон ввели 0,1 мл обезвоженного спирта, содержащего ДТПАмод в количестве 1 мг/мл, 0,01 мл обезвоженного спирта, содержащего Sn в количестве 6,3 мг/мл (по металлу). Смесь высушили до сухого остатка и ввели 5 мл элюата 99mТс. Инкубировали в течение 20 мин. рН = 6.

Смесь № 7. Во флакон ввели 0,1 мл обезвоженного спирта, содержащего ДТПАмод в количестве 1 мг/мл. После упаривания до сухого остатка, на другую сторону дна флакона внесли 0,01 мл 1 М HCl, содержащей Sn в количестве 0,63 мг/мл (по металлу) и также упарили. После ввели 5 мл элюата 99mТс и провели инкубирование в течение 20 мин. рН раствора = 8. Результаты хроматографирования всех смесей представлены в таблице.

Обобщенные данные по введению метки 99mТс в структуру ДТПАмод

Номер смеси

Система

Расстояние от линии старта, L, см

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Активность, имп./с

1

Ацетон

41661

118270

688

570

781

1165

1745

2619

126

Система № 1

76314

93553

1511

4760

2501

148

148

112

2

Система № 1

163

566

1364

608

6270

246149

132

109

3

Система № 1

72

66151

109302

4715

3117

4367

3182

77

4

Система № 2

186

196907

17877

11905

12930

16945

27405

114136

2466

230

5

Система № 1

129

2893

4876

2814

11027

248081

144

104

6

Система № 1

67

58905

118239

5940

1629

2650

103

67

7

Система № 2

145

294076

918

468

476

925

2436

14006

5541

165

Из анализа радиохроматограмм, представленных в таблице, можно сделать следующие выводы. Исходя из хроматограммы смеси № 2, где для мечения ДТПАмод использовался раствор SnCl2 в 1 М NaOH, следует, что олово в щелочной среде не проявляет восстанавливающих свойств. Напротив, в спиртовом растворе (смесь № 3) наблюдается полное восстановление 99mTc. Однако в этой среде происходит полное растворение коллоида ДТПАмод.

Наиболее интересный результат получается при прямом взаимодействии раствора элюата 99mTc с раствором смеси № 1 [0,107 мг ДТПАмод + 0,14 мг SnCl2], которой соответствует хроматограмма, приведенная на рисунке. Подвижная фаза – ацетон.

pic_6.wmf

Радиохроматограмма элюата 99mTc с раствором смеси [0,107 мг ДТПАмод + 0,14 мг SnCl2]

Исходя из хроматограммы можно сделать вывод, что содержание радиохимической примеси (РХП) невосстановленного 99mTc (VII) в полученном препарате наноколлоида составляет 2,7 %. Это достаточно хороший показатель, близко соответствующий нормативным требования к подобным препаратам. Окончательный вывод о его качестве и функциональной пригодности может быть сделан только при проведении медико-биологических испытаний на следующих этапах проведения НИР.

Достаточно низкое содержание радиохимической примеси 99mTc (VII) наблюдается также при взаимодействии элюата 99mTc с сухими остатками, полученными из спиртовых смесей (хроматограмма смеси № 7 в системе № 2). Здесь величина РХП составляет 4,8 %.

В заключение следует отметить, что ни на одной из радиохроматограмм, представленных в таблице, нам не удалось зафиксировать немеченую субстанцию в области Rf = 0,5. Пятно проявлялось по Rf = 0,1. Из этого следует, что субстанция взаимодействует, скорее всего, с оловом, через которое вводится радиоактивная метка с 99mTc, например, путем присоединения к хелатирующим группам цепочки –Sn(ОН)2–О–Тс(ОН)О вместо «прямого» присоединения гидратированного иона Тс (ОН)О+. Во избежание гидролиза олова, приводящего к его окислению и снижению восстанавливающих свойств, в дальнейшем для приготовления наноколлоидного раствора ДТПАмод планируется использовать раствор олова в виде лиофилизата.

Заключение

В результате проведенных исследований определены условия введения радиоактивной метки 99mTc в структуру модифицированного ДТПА и подобраны количественные составы реагентов для наработки опытных партий наноколлоидных препаратов с низким содержанием радиохимической примеси 99mTc(VII) для последующего проведения исследований на экспериментальных животных.

Рецензенты:

Чернов В.И., д.м.н., профессор, руководитель отделения радионуклидной диагностики, ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии СО РАМН», г. Томск;

Лишманов Ю.Б., д.м.н., профессор, заместитель директора по научно-исследовательской работе, ФГБУ «Научно-исследовательский институт кардиологии» СО РАМН, г. Томск.

Работа поступила в редакцию 24.09.2013.