Плоды софоры японской и получаемая из них настойка используются в медицинской практике в качестве антисептического средства. Установлено, что плоды софоры являются носителем и других видов фармакотерапевтической активности, в частности они обладают противовоспалительным и иммуномодулирующим действием, ускоряют регенерацию тканей, влияют на липогенез, способны оказывать регулирующее воздействие на гемостаз [2, 6]. Вышеперечисленные лечебные эффекты, безусловно, связаны с химическим составом данного лекарственного растительного сырья (ЛРС), отличающимся заметным разнообразием биологически активных веществ (БАВ). Плоды софоры японской хорошо известны как богатый источник флавоноидов, в частности рутина, гликозидов кемпферола, генистеина и др. [1,10]. Кроме того, они содержат кумаронохромоны, полисахариды, тритерпеновые сапонины, лектины, жирное масло и др. [6, 8, 9, 11]. Среди БАВ плодов софоры японской, способных определять медицинское применение этого ЛРС, на наш взгляд, заслуживают внимания свободные аминокислоты, играющие в организме человека чрезвычайно важную роль, участвуя в белковом обмене, синтезе биогенных аминов и других процессах [3,4].
Целью исследования являлось изучение качественного состава и количественного содержания свободных аминокислот плодов софоры японской.
Материал и методы исследования
Объектом исследования служили образцы плодов софоры японской как собственной, так и промышленной заготовки.
Качественное обнаружение аминокислот проводили в водных извлечениях с помощью нингидриновой реакции, а также методом бумажной хроматографии. Для хроматографического анализа 0,03–0,05 мл полученных извлечений наносили на подготовленную хроматографическую бумагу «Filtrak» № 1 и хроматографировали в системе н.бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2) с достоверными образцами аминокислот. Хроматограммы высушивали на воздухе, обрабатывали их 0,2 % спиртовым раствором нингидрина и нагревали в сушильном шкафу при 100–105 °С в течение нескольких минут [3].
Более детальное исследование аминокислотного состава плодов софоры японской проводили методом капиллярного электрофореза на приборе «Капель-103Р» (ОАО «НПФ Люмэкс», Россия) с кварцевым капилляром Lэфф/Lобщ = 50/60 см, ID = 75 мкм. Метод основан на разделении анионных форм N-фенилтиокарбамил-производных аминокислот под действием электрического поля вследствие их различной электрофоретической подвижности. Пробоподготовку осуществляли путем СВЧ-экстракции плодов софоры японской 10 % спиртом этиловым на СВЧ-минерализаторе «Минотавр-1». Пробу сырья в количестве 1,0 г помещали во фторопластовый контейнер СВЧ-минерализатора, добавляли 25 мл 10 % спирта этилового, устанавливали контейнер в магнетрон минерализатора. Минерализацию проводили, используя режим «разложение без давления», в течение 10 мин. По истечении указанного времени контейнер извлекали из СВЧ-минерализатора, охлаждали в естественных условиях в течение 3–5 мин. Полученное извлечение количественно переносили в мерную колбу объемом 25 мл.
К пробе полученного извлечения прибавляли 10 % водный раствор карбоната натрия и раствор фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте. Реакционную смесь перемешивали, выдерживали в течение 35 минут при комнатной температуре для прохождения реакции между фенилизотиоцианатом и свободными аминокислотами плодов софоры японской, а затем высушивали в потоке теплого воздуха. К сухому остатку прибавляли воду очищенную, тщательно перемешивали и центрифугировали при 6000 об–1 в течение 5 минут, полученную пробу (фугат) переносили в систему капиллярного электрофореза и пневматическим методом под давлением 30 миллибар в течение 5 секунд дозировали пробу в капилляр. Капилляр перед измерением подготавливали к работе, промывая его последовательно 3,5 % раствором соляной кислоты, водой очищенной, 4 % раствором гидроксида натрия и рабочим буферным раствором. Электрофорез проводили под напряжением в 10 кВольт. Анализируемую пробу дозировали в прибор не менее двух раз. Градуировку прибора осуществляли при помощи калибровочных растворов стандартных образцов аминокислот. Градуировочную смесь готовили путем смешения исходных растворов аминокислот, 10 % водного раствора карбоната натрия и раствора фенилизотиоцианата в изопропиловом спирте. Для идентификации и количественного определения анализируемых компонентов регистрировали ультрафиолетовое поглощение при длине волны 254 нм. По электрофореграмме определяли качественную характеристику вещества – время миграции и количественную (после построения градуировочной зависимости) – высоту или площадь пика, пропорциональную концентрации вещества [5, 7].
Результаты исследования и их обсуждение
Извлечения из плодов софоры японской давали положительную нингидриновую реакцию: аминокислоты проявлялись в виде красно-фиолетовых пятен.О наличии аминокислот в данном ЛРС свидетельствовали также данные хроматографического анализа. С достоверными образцами аминокислот в плодах софоры идентифицировали:аргинин, лейцин, метионин, валин, пролин, треонин, триптофан, серин, α-аланин, глицин.
Дальнейшее исследование аминокислотного состава плодов софоры японской проводили методом капиллярного электрофореза. Электрофореграмма свободных аминокислот плодов софоры японской представлена на рисунке. На основании полученных электрофореграмм при помощи программного обеспечения к прибору рассчитывали количественное содержание отдельных свободных аминокислот в пяти образцах плодов софоры японской по установленным градуировочным характеристикам. Результаты исследований приведены в таблице.
Как показывают результаты исследования, с использованием бумажной хроматографии и методом капиллярного электрофореза в плодах софоры японской обнаружены разнообразные аминокислоты: аргинин, лейцин, метионин, валин, пролин, треонин, триптофан, серин, α-аланин, глицин. Следует отметить, что пять из найденных аминокислот (лейцин, метионин, валин, треонин, триптофан) относятся к разряду незаменимых.
Общее количество свободных аминокислот в изученных образцах сырья колебалось от 658,04 до 756,45 мг/кг, в среднем же оно составило 712,49 мг/кг. В плане количественного содержания среди всех свободных аминокислот наибольшая концентрация установлена для пролина и глицина, их содержание составило примерно половину от суммарного количества всех свободных аминокислот. Около 30 % аминокислотной фракции приходится на треонин и аргинин, все остальные обнаруженные в плодах софоры аминокислоты занимают примерно 20 % от общего содержания данных БАВ в изученных объектах.
Заключение
Таким образом, в результате проведенных исследований изучен качественный состав и количественное содержание свободных аминокислот плодов софоры японской. Полученные данные свидетельствуют о том, что плоды софоры японской характеризуются существенной широтой и уровнем содержания свободных аминокислот. Установленное разнообразие и достаточно высокое количественное содержание данной группы БАВ могут стать основанием для рассмотрения свободных аминокислот как одних из фармакологически активных компонентов плодов софоры японской.
Электрофореграмма свободных аминокислот плодов софоры японской
Содержание свободных аминокислот в плодах софоры японской
|
Наименование свободных аминокислот |
Содержание свободных аминокислот, мг/кг |
||||
|
Образец № 1 |
Образец № 2 |
Образец № 3 |
Образец № 4 |
Образец № 5 |
|
|
Аргинин |
77,37 ± 15,47 |
52,15 ± 10,43 |
88,43 ± 17,69 |
82,90 ± 16,58 |
71,80 ± 14,36 |
|
Лейцин |
8,13 ± 1,63 |
12,41 ± 2,48 |
10,29 ± 2,06 |
10,83 ± 2,17 |
11,53 ± 2,31 |
|
Метионин |
49,12 ± 9,82 |
51,33 ± 10,27 |
57,67 ± 11,53 |
52,18 ± 10,44 |
50,61 ± 10,12 |
|
Валин |
41,13 ± 8,23 |
38,17 ± 7,63 |
33,04 ± 6,61 |
36,71 ± 7,34 |
39,26 ± 7,85 |
|
Пролин |
221,30 ± 44,26 |
197,40 ± 39,48 |
204,90 ± 40,98 |
218,20 ± 43,64 |
213,50 ± 64,05 |
|
Треонин |
95,09 ± 19,02 |
107,10 ± 21,42 |
123,10 ± 24,62 |
112,60 ± 22,52 |
119,40 ± 23,88 |
|
Триптофан |
30,37 ± 6,07 |
27,44 ± 5,49 |
28,93 ± 5,79 |
28,67 ± 5,73 |
29,51 ± 5,90 |
|
Серин |
10,85 ± 2,17 |
13,54 ± 2,71 |
12,55 ± 2,51 |
13,18 ± 2,64 |
12,83 ± 2,57 |
|
α-Аланин |
14,15 ± 2,83 |
11,86 ± 2,37 |
13,84 ± 2,77 |
11,57 ± 2,31 |
12,92 ± 2,58 |
|
Глицин |
167,30 ± 33,46 |
179,80 ± 35,96 |
183,70 ± 36,74 |
174,10 ± 34,82 |
180,60 ± 36,12 |
|
Сумма аминокислот |
714,81 ± 142,96 |
691,2 ± 138,24 |
756,45 ± 151,29 |
658,04 ± 131,61 |
741,96 ± 148,39 |
Примечания:
Образец 1 – ООО «СОИК», г. Москва;
Образец 2 – ООО «Сила природы», Краснодарский край, Отрадненский район;
Образец 3 – Краснодарский край, ст. Динская;
Образец 4 – Краснодарский край, г. Краснодар;
Образец 5 –Краснодарский край, ст. Васюринская.
Рецензенты:
Коновалов Д.А., д.фарм.н., заведующий кафедрой фармакогнозии Пятигорского филиала ГБОУ ВПО «Волгоградского государственного медицинского университета» Минздрава России, г. Пятигорск;
Шевченко А.М., д.фарм.н., доцент кафедры технологии лекарств Пятигорского филиала ГБОУ ВПО «Волгоградского государственного медицинского университета» Минздрава России, г. Пятигорск.
Работа поступила в редакцию 08.11.2013.