Селезёнка – орган, который обладает огромными резервными возможностями и, несмотря на длительное многолетнее изучение, всё ещё до конца не исследован. Известно, что селезёнка выполняет в организме многообразные функции: фильтрационную, кроветворную, иммунную, эндокринную ‒ и состоит из большого числа самых разнообразных клеток. В настоящее время спленотерапия – введение в организм пациента различных элементов селезенки ‒ с успехом зарекомендовала себя в различных областях медицины при лечении той или иной патологии, которая сочетается с изменениями в иммунном статусе. Однако в такой терапии используется только донорская свиная селезёнка или получаемые из неё препараты, содержащие биологически активные вещества и природные цитокины [1, 2].
Не секрет, что при злокачественном росте нарушается иммунный гомеостаз, и селезёнка играет важную роль в противоопухолевой защите организма. Так, например, было найдено, что у спленэктомированных крыс метастазы опухолей развивались более интенсивно. Позднее было показано, что селезёнка является депо NK-клеток. Установлено, что NK-клетки обладают противоопухолевой активностью, увеличивающейся под совместным влиянием интерлейкина 18 и интерлейкина 10. Лимфокинактивированные киллеры, полученные при действии интерлейкина 2 на NK-клетки селезёнки, проявляют выраженный цитотоксический эффект в отличие от неактивированных NK-клеток лимфатических узлов. Также на сегодняшний день известно, что селезёночные дендритные клетки имеют высокий противоопухолевый потенциал и активнее костномозговых, тогда как дендритные клетки тимуса вообще не способны подавлять рост опухолевых клеток. Дендритные клетки селезенки, которые наряду с собственной противоопухолевой активностью, участвуют также в индукции цитотоксических Т-лимфоцитов, синтезирующих интерлейкин 12 [3, 6].
Однако очень большая группа онкологических пациентов лишается селезенки после оперативного вмешательства, например при раке желудка [5]. Включение собственных клеточных элементов селезёнки в терапию таких больных в тех случаях, когда не удаётся избежать спленэктомии, на наш взгляд, обладает большим резервом в плане усиления противоопухолевого эффекта цитостатиков, с одной стороны, и увеличения продолжительности жизни онкобольных за счёт уменьшения токсического действия химиопрепаратов на организм в целом, с другой.
Целью данного исследования явилась оценка противоопухолевой эффективности и продолжительности жизни у крыс с индуцированными опухолями при проведении аутоспленохимиотерапии (АСХТ).
Материалы и методы исследования
Опыты поставлены на белых беспородных крысах разного пола, массой 180–280 грамм, с индуцированными 3, 4-бензпиреном (БП) опухолями. Животные были разделены на 3 группы:
– 1-ю группу (контроль 1) составили крысы (5 штук), которым в яремную вену вводили физ. раствор в объёме около 1,5 мл: первоначально – через 1–1,5 часа после удаления селезёнки и повторно – через 24 часа после 1 введения в том же объёме.
– 2-ю группу (контроль 2) составили крысы (7 штук), которым в яремную вену вводили химиопрепарат, растворенный в 1,5 мл физ. раствора: первоначально – через 1–1,5 часа после удаления селезёнки в разовой дозе 40 мг/кг и повторно – через 24 часа после 1 введения в разовой дозе 48 мг/кг. Суммарная доза цитостатика на 1 животное – 88 мг/кг.
– 3-ю группу (основную) составили крысы (8 штук), которым выполняли спленэктомию. Выделение спленоцитов проводилось по общепринятой методике в стерильных условиях на льду [4]. Выделенную селезенку каждой крысы отдельно помещали в чашку Петри и измельчали ножницами в физ. растворе объемом 5 мл. Полученную взвесь собирали в центрифужную пробирку, давали отстояться в течение 10 минут и делили на 2 равные части: к одной добавляли питательную среду 199 в том же объеме, помещали в стерильный флакон с крышкой и оставляли в холодильнике при 6–8 °С на 24 часа; к другой приливали физ. раствор до суммарного объёма 10 мл и центрифугировали при 1,5 тыс. об. в мин 5 мин. Спленоциты дважды отмывали физ. раствором и разводили до концентрации клеток – 5–6 ∙109/л. После получения взвеси с нужной концентрацией клеток, к ней добавляли циклофосфан, растворённый в физ. растворе (1–40 мг ЦФ) и помещали в термостат при t = 37 °С на 40 минут, затем вводили животным в яремную вену (для каждой крысы использовали элементы собственной селезенки). На следующий день все этапы методики повторялись. Отличие от 1 дня: спленоциты трижды отмывали физ. раствором; цитостатик добавляли к спленоцитам в дозе 48 мг/кг. Суммарная доза препарата – 88 мг/кг.
В опытах применялся циклофосфан (ЦФ) (ОАО «Биохимик», г. Саранск).
Для анализа противоопухолевой эффективности использовали следующие показатели: продолжительность жизни, средний размер опухолей, изменение объема опухолей в процентах от исходного и процент торможения роста опухолей.
Объем (V) каждой опухоли определяли по формуле Шрека, замеряя штангенциркулем ее длину, ширину и высоту до лечения, перед 2 введением ЦФ и затем каждые 7 дней наблюдения до конца жизни животных:
V = A∙B∙C/6,
где А – длина опухоли (см); В – ширина опухоли (см); С – высота опухоли (см).
Эффективность экспериментальной химиотерапии оценивали по показателю процента торможения роста опухоли (ПТРО) и коэффициенту эффективности химиотерапии (γ).
ПТРО определяли по формуле:
ПТРО = (К – Оп)/К∙100,
где К – средний объем опухоли в контроле; Оп – средний объем опухоли в опытной группе.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи параметрического критерия Стьюдента на персональном компьютере посредством программы Statistica 6.0. Достоверными считали различия между двумя выборками при р < 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Прежде всего, следует отметить, что системное двукратное с интервалом 24 часа введение ЦФ в суммарной дозе 88 мг/кг на физиологическом растворе приводило к ранней гибели спленэктомированных животных вследствие токсического воздействия цитостатика на организм крыс. Животные из 2 контрольной группы погибали на 3–5 сутки от 2 введения препарата. Размер опухолей у некоторых из них несколько уменьшался после завершения введения в организм ЦФ, но среднее значение объемов опухолей у крыс данной группы перед гибелью достоверно не отличалось от исходной величины: исходно 3,89 ± 1,28 см3, перед гибелью – 3,39 ± 1,44 см3.
Средняя продолжительность жизни животных всех экспериментальных групп представлена в табл. 1.
Таблица 1
Продолжительность жизни крыс после экспериментальной аутоспленохимиотерапии
|
Экспериментальные группы |
Контроль 1 |
Контроль 2 |
АСХТ |
|
Количество прожитых дней |
18,14 (от 5 до 32 суток) |
4,20* ± 0,74 |
37,75 *,** ± 4,34 |
|
Количество животных в группе |
8 |
5 |
8 |
Примечания: * – достоверные отличия от контроля 1; ** – достоверные отличия от контроля 2.
Как видно из табл. 1, продолжительность жизни у крыс после внутривенного введения ЦФ, растворённого в физиологическом растворе, была в 4,3 раза меньше, чем у животных, которым не вводился цитостатик, что свидетельствовало о высокой токсичности такой дозы препарата. Введение аналогичной дозы ЦФ на клетках собственной селезёнки значительно увеличивало продолжительность жизни спленэктомированных животных: этот показатель был в 9,0 раз выше контроля 2 и в 2,1 раза выше контроля 1 (табл. 1).
Эффективность экспериментальной аутоспленохимиотерапии оценивали по динамике среднего объема опухолей и показателю процента торможения роста опухолей (ПТРО) относительно спленэктомированных крыс без химиотерапии (контроль 1).
Установлено, что введение ЦФ методом АСХТ оказывало выраженное противоопухолевое действие. Об этом свидетельствовала и динамика среднего объёма опухоли, и величина ПТРО в разные сроки наблюдения за экспериментальными животными. Так, средний объем опухоли у крыс после аутоспленохимиотерапии был достоверно ниже контрольного показателя (К 1): на 7 сутки от 2 введения цитостатика – в 5,7 раза, на 14 сутки – в 5,8 раза (табл. 2). В остальные сроки наблюдения достоверность отличий между этими группами не наблюдалась из-за уменьшения количества контрольных животных в результате их более ранней гибели, чем в основной группе (табл. 1, 2). ПТРО при аутоспленохимиотерапии был минимальным после 1 введения ЦФ и максимальным на 7–14 сутки от 2 введения химиопрепарата с постепенным уменьшением величины с 21 суток наблюдения (табл. 2).
Таблица 2
Средний объем опухолей и процент торможения роста опухолей у спленэктомированных крыс после проведения экспериментальной аутоспленохимиотерапии
|
День эксперимента |
Размер опухолей в см3 (в % от исходного объема) |
ПТРО (%) |
|
|
Контроль 1 |
АСХТ |
||
|
До лечения |
5,07 ± 0,95 (100 %), n = 8 |
3,95 ± 0,69 (100 %), n = 8 |
|
|
Перед 2 введением |
7,42 ± 2,21 (146,3 ± 43,6 %), n = 8 |
3,52 ± 0,78 (89,1 ± 19,7 %), n = 8 |
52,6 % |
|
7 сутки от 2 введения |
20,14 ± 6,91 (397,2 ± 136,3 %), n = 5 |
3,50* ± 0,64 (88,6 ± 16,2 %), n = 8 |
82,6 % |
|
14 сутки от 2 введения |
50,14 ± 11,98 (988,9 ± 236,3 %), n = 4 |
8,65* ± 2,38 (219,0 ± 60,2 %), n = 8 |
82,7 % |
|
21 сутки от 2 введения |
83,44 ± 27,27 (1645,7 ± 537,9 %), n = 3 |
23,90 ± 8,19 (605,0 ± 207,3 %), n = 7 |
71,3 % |
|
28 сутки от 2 введения |
129,71 ± 13,15 (2558,4 ± 259,4 %), n = 2 |
49,60 ± 15,0 (1255,7 ± 379,7 %), n = 6 |
61,8 % |
|
35 сутки от 2 введения |
‒ |
85,10 ± 26,57 (2154,4 ± 672,6 %), n = 4 |
|
|
42 сутки от 2 введения |
‒ |
215,25 ± 29,31 (5449,4 ± 742,0 %), n = 3 |
|
|
49 сутки от 2 введения |
‒ |
396,54 (10039,0 %), n = 2 |
|
Примечание. * – достоверные отличия от контроля 1.
Таким образом, полученные данные, свидетельствующие о более высокой продолжительности жизни крыс основной группы и более высокой противоопухолевой эффективности используемой нами модели экспериментальной аутоспленохимиотерапии, позволяют говорить о целесообразности использования клеточных элементов селезёнки в схемах химиотерапии в тех случаях, когда имеет место спленэктомия у онкологических больных.
Рецензенты:
Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, заведующая лабораторией биофизики рака, ФГБУ РНИОИ Минздрава России, г. Ростов-на-Дону;
Непомнящая Е.М., д.м.н., профессор, главный научный сотрудник лаборатории иммунофенотипирования опухолей, ФГБУ РНИОИ Минздрава России, г. Ростов-на-Дону.
Работа поступила в редакцию 10.06.2014.