Вакцинопрофилактика является наиболее эффективным, безопасным и экономически обоснованным средством борьбы с гриппом. В качестве приоритетного средства профилактики гриппа ВОЗ рекомендует живую гриппозную вакцину (ЖГВ) [14].
Формальным требованием, предъявляемым к гриппозным вакцинам, являются показатели прироста сывороточных антител. Состав внутренних генов вакцинных штаммов ЖГВ постоянен, поэтому основное влияние на иммуногенность вакцинного штамма оказывают свойства гемагглютинина (HA) и нейраминидазы (NA) эпидемического вируса.
Существуют два основных субстрата, в которых производится культивирование вируса гриппа и получение вакцинных штаммов: развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) и перевиваемые клеточные линии [8, 11]. Мутации, появляющиеся в поверхностных антигенах вирусов гриппа в процессе адаптации к субстрату, могут оказывать влияние на иммуногенность вакцинного штамма, поэтому исследования одиночных мутаций в молекуле НА штаммов, культивируемых в разных биологических системах, могут помочь в выборе вакцинного кандидата.
Целью исследования было изучение аминокислотного состава НА штаммов ЖГВ, подготовленных на основе вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) в разных биологических субстратах (РКЭ, культура клеток MDCK) и определение их иммуногенности в экспериментах на животных.
Материалы и методы исследования
В работе были использованы полученные из ВОЗ два варианта «дикого» вируса А/Новая Каледония/20/99 (А/NC), выделенные в РКЭ и культуре клеток MDCK, и 4 их реассортанта с донором аттенуации отечественной ЖГВ А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), (табл. 1). Реассортанты были подготовлены в отделе вирусологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН.
Таблица 1
Перечень использованных в экспериментах реассортантных штаммов
|
Название штамма |
Система, в которой изолирован «дикий» родительский вирус |
Система, в которой получен реассортант |
Автор штамма |
|
25М/1 |
MDCK1 |
MDCK |
Киселева И.В. [12] |
|
39Е/2 |
РКЭ2 |
MDCK |
Киселева И.В. [12] |
|
NC1453 |
РКЭ2 |
РКЭ |
Киселева И.В. [1] |
|
NC84 |
РКЭ4 |
РКЭ |
Федорова Е.А.4 |
Примечания: 1№ последовательности HA ISDNAU0001 [7]. 2№ последовательности гемагглютинина AJ344014 [7]. 3Штамм коммерческой ЖГВ A/17/Новая Каледония/99/145. 4Клонированный вариант А/NC. 4Не опубликовано.
Секвенирование последовательности сегментов генома осуществляли с использованием автоматического капиллярного секвенатора 3130x Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Последующая обработка данных производилась с использованием пакета программ Lasergene 7.1 (DNAstar). Моделирование пространственной структуры молекул белков проводилось с использованием сервиса SWISS-MODEL [10], Swiss-PdbViewer 4.1.0 и сервиса ZDOCK [13].
В работе использовались морские свинки (самки–альбиносы) весом 300–350 г, полученные из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» РАМН. Работа с животными проводилась в соответствии с «Правилами лабораторной практики» (Приказ МЗРФ № 708н от 23.08.2010).
Для исследования иммуногенности разных штаммов вируса гриппа морских свинок заражали интраназально в дозе 5 lg ЭИД50 на одну особь. Забор крови и назальных смывов производили через 2, 4 и 8 недель после заражения. В сыворотках определяли содержание вируссспецифических антител к штамму А/NC методами РТГА, микронейтрализации, содержание IgG методом ИФА, в смывах – содержание IgA методом ИФА.
Результаты исследования и их обсуждение
Для изучения состава гетерогенной популяции «дикого» вируса было проведено клонирование «яичного» варианта с последующим секвенированием сегмента генома, кодирующего НА полученных клонов (табл. 2). Также было проведено секвенирование последовательности HA и NA реассортантов, перечисленных в табл. 1. Последовательность сегмента генома, кодирующего нейраминидазу изученных штаммов, не отличалась.
Таблица 2
Отличия в аминокислотной последовательности гемагглютинина вакцинных штаммов на основе вируса гриппа А/NC
|
Позиция аминокислоты1 |
Локализация мутации в молекуле НА |
Гетерогенность в исходной популяции |
Штаммы |
|||
|
25М/1 |
39Е/2 |
NC145 |
NC84 |
|||
|
78 |
Глобулярная часть HA1 |
Glu/Lys |
Glu |
Glu |
Glu |
Lys |
|
131 |
Thr |
Thr |
Ile |
Thr |
Thr |
|
|
190 |
Asp/Asn |
Asn |
Asp |
Asp |
Asn |
|
|
225 |
Asp/Gly |
Gly |
Asn |
Gly |
Asp |
|
|
436 (HA2 106) |
Ножка НА2 |
Arg/Lys |
Arg |
Arg |
Lys |
Arg |
|
442 (HA2 112) |
Asp |
Asn |
Asp |
Asp |
Asp |
|
Примечание. 1 Позиции аминокислот указаны в H3-нумерации.
В HA1 вариабельность была обнаружена в четырех аминокислотных позициях – 78, 131, 190 и 225. Еще две вариабельные позиции располагались в ножке гемагглютинина (аминокислотные остатки 106 и 112) (табл. 2). Аминокислотные позиции, по которым была выявлена гетерогенность, были визуализированы с использованием компьютерного моделирования (рисунок).
Расположение вариабельных аминокислотных остатков в молекуле гемагглютинина А/NC. На одном из мономеров показано расположение вариабельных аминокислотных остатков. Разными цветами показано расположение антигенных сайтов Ca, Cb, Sb, Sa [7]. Слева – вид со стороны одного из мономеров. Справа – один из мономеров показан в виде схемы основных элементов структуры, чтобы продемонстрировать аминокислотные позиции 106 и 112 в субъединице HA2, расположенные в центре тримера. Иллюстрация получена с использованием программы RasMol 2.7.5
Варианты вируса, выделенные в разных субстратах, отличались аминокислотной позицией 190: у MDCK-варианта в данной позиции располагается остаток Asn190, у РКЭ-варианта – Asp190 . Замена Asn190 → Asp190 описана в литературе как адаптационная к куриным эмбрионам: изменяется распределение заряда и способность к взаимодействию с рецептором с α-2,3 связью [5]. Реассортанты, подготовленные на основе вирусов, выделенных в разных субстратах, сохраняли аминокислотный остаток в позиции 190: штамм 25М/1 содержал Asn190, штаммы 39Е/2 и NC145 – Asp190. При клонировании «дикого» вируса в РКЭ нам удалось выделить компонент популяции, содержавший Asn190. Данный чистый клон был использован для подготовки вакцинного штамма NC84, и Asn190 сохранился после 6 пассажей в куриных эмбрионах. Это говорит о том, что влияние субстрата не однозначно определяет появление аминокислотной замены, но значительно повышает вероятность отбора субстрат-адаптированных вариантов. Это можно использовать при подготовке штаммов ЖГВ: предварительное клонирование и выбор клона может обеспечить более предсказуемый результат.
Наибольшие различия по показателям иммунного ответа были обнаружены между штаммами, подготовленными в культуре клеток MDCK (25M/1 и 39Е/2) и подготовленными в РКЭ (NC145, NC84) (табл. 3). Значения титров антител были наиболее низкими у штамма 25M/1: средние значения титров антител у животных, вакцинированных штаммом 25М/1, статистически достоверно отличались от значений титров антител в сыворотках животных, вакцинированных штаммами NC145 и NC84, на всех сроках, по результатам всех исследований. Штамм 39Е/2 был более иммуногенен, значения титров антител в данной группе статистически достоверно превышали титры, полученные в результате вакцинации 25М/1, на сроке 8 недель по результатам исследований сывороток тремя методами. Штаммы NC145 и NC84 вызывали статистически достоверно более высокие приросты титров антител, чем штаммы 25M/1 и 39Е/2. Между группами NC145 и NC84 статистически значимых различий обнаружено не было.
Две вариабельные позиции в НА1 не оказали значительного влияния на иммуногенность: это гетерогенная позиция 78 (табл. 2), относящаяся к антигенному сайту Cb [7], и позиция 225, расположенная в петле 220 рецептор-связывающего кармана. 225 позиция, по данным литературы, является вариабельной среди вирусов подтипа H1 [3].
Таблица 3
Среднегеометрические титры антител против вируса гриппа А/NC в сыворотках и назальных смывах морских свинок
|
Препарат |
Метод учета |
Срок после вакцинации, недели |
Метод учета |
Срок после вакцинации, недели |
||||
|
2 |
4 |
8 |
2 |
4 |
8 |
|||
|
25M/1 |
РТГА, сыворотки |
5,0 |
9,6 |
12,9 |
ИФА IgG3, сыворотки |
72,5 |
262,5 |
951,0 |
|
39E/2 |
5,0 |
10,0 |
29,7 |
390,1 |
1159,3 |
2826,5 |
||
|
NC145 |
13,5 |
65,6 |
144,9 |
7608,3 |
20480,0 |
22611,8 |
||
|
NC84 |
15,9 |
40,0 |
80,0 |
6450,8 |
10240,0 |
16255,0 |
||
|
Плацебо |
< 10 |
< 10 |
< 10 |
< 10 |
< 10 |
< 10 |
||
|
Н1 |
22,29 |
11,01 |
13,39 |
20,99 |
19,15 |
20,14 |
||
|
р2 |
0,0001 |
0,0117 |
0,0039 |
0,0001 |
0,0003 |
0,0002 |
||
|
25M/1 |
РМН, сыворотки |
10,0 |
16,4 |
40,0 |
ИФА IgA, смывы4 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
|
39E/2 |
10,0 |
26,9 |
215,3 |
2,5 |
2,0 |
1,6 |
||
|
NC145 |
195,0 |
2100,0 |
5120,0 |
12,6 |
32,0 |
20,0 |
||
|
NC84 |
50,4 |
1015,9 |
2031,9 |
8,0 |
10,1 |
6,3 |
||
|
Плацебо |
< 10 |
< 10 |
< 10 |
< 2 |
< 2 |
< 2 |
||
|
Н |
22,90 |
20,91 |
21,70 |
4,21 |
5,93 |
6,12 |
||
|
р |
0,0001 |
0,0001 |
0,0001 |
0,2362 |
0,1152 |
0,1050 |
||
Примечания:
1 значение критерия Краскела – Уоллеса.
2 уровень статистической значимости;
3 определение содержания сывороточных иммуноглобулинов класса G методом ИФА;
4 определение содержания иммуноглобулинов класса А в назальных смывах методом ИФА.
Штамм 39Е/2 за счет замены Thr131 → Ile131 в НА1 потерял потенциальный сайт гликозилирования. Подобная замена описана в исследовании [4] как влияющая на способность НА вируса к связыванию с рецептором. Возможно, именно это стало причиной сниженной иммуногенности данного реассортанта, поскольку по остальным позициям 39E/2 не отличается от более иммуногенных штаммов на основе А/NC.
Среди исследованных нами штаммов были два варианта, содержавшие уникальные замены в НА2 – NC145 и 25M/1. Штамм NC145, обладавший наиболее высокой иммуногенностью по показателям гуморального иммунного ответа, содержал Lys106 в НА2, у остальных исследованных штаммов в данной позиции располагается остаток Arg106. Гетерогенность Arg/Lys в данной позиции характерна для H1-вирусов [15]. Позиция 106 располагается в области оси симметрии тримера HA, в непосредственной близости от пептида слияния, в точке, где длинный α-спиральный участок подвергается анфолдингу при низких pH [2]. Остаток Lys106 формирует водородные связи с Glu103 и взаимодействует с анионами, что стабилизирует структуру в области оси тримера. Arg106 формирует солевые мостики с Glu105, но ионные взаимодействия в области оси тримера значительно слабее [6]. Возможно, Lys106 стабилизировал структуру НА штамма NC145, что и привело к его наибольшей иммуногенности среди исследованных штаммов.
Замена Asp112 → Asn112 в HA2 была обнаружена у штамма 25М/1, обладавшего самой низкой иммуногенностью среди исследованных штаммов, а также сниженными показателями репродукции в развивающихся куриных эмбрионах. По данным литературы, Asp112 формирует 4 водородных связи, стабилизирующих пептид слияния, и мутации в этой позиции приводят к изменению конформации при менее кислых pH [9]. Вероятно, данная мутация изменила свойства НА штамма 25М/1, что привело к более низкой иммуногенности.
Заключение
Вакцинные штаммы на основе вируса гриппа А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), содержавшие отдельные аминокислотные замены в НА, обладали разной иммуногенностью по показателям гуморального иммунного ответа в эксперименте на морских свинках. Наиболее высокие показатели гуморального иммунного ответа были достигнуты после иммунизации штаммами, подготовленными в развивающихся куриных эмбрионах. Штаммы, подготовленные в культуре клеток, приобрели уникальные аминокислотные замены в гемагглютинине и вызывали гуморальный иммунный ответ меньшей степени выраженности.
Работа выполнена при поддержке гранта № 14–15–00034 Российского Научного Фонда (Москва, Россия).
Рецензенты:
Жилинская И.Н., д.б.н., ФГБУ «НИИ гриппа» МЗ РФ, г. Санкт-Петербург;
Рябчикова Е.И., д.б.н., профессор, ФГБУН «Институт химической биологии и фундаментальной медицины» СО РАН, г. Новосибирск.
Работа поступила в редакцию 27.10.2014.