Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

При термической переработке отходов образуются сложные продукты, которые в различных сочетаниях попадают в окружающую среду. Часть из них представляет реальную канцерогенную и генетическую опасность, масштабы которой постоянно возрастают. Общепринятых критериев реальной оценки этой опасности не существует, поскольку она складывается не из суммы количественного содержания отдельных канцерогенов в выбросах, а формируется при участии модифицирующего действия многих других содержащихся в них соединений. В связи с этим эффективным способом экспрессной оценки потенциального онкологического риска сложных смесей может быть только сочетание данных физико-химического анализа с результатами оценки суммарной мутагенной и канцерогенной активности в биологических тестах.

Методологическим подходом исследования послужила двухстадийная теория химического канцерогенеза, в соответствии с которой опухоль возникает в результате сочетанного действия инициирующих факторов, вызывающих злокачественную трансформацию клетки и промоторов, способствующих реализации ее потенциала. В связи с этим помимо определения количественного состава канцерогенных соединений в выбросах исследовали их мутагенную и промоторную активность. Кроме того, индуцировали опухоли у гетерозиготных личинок дрозофилы.

Цель работы – разработка системы оценки канцерогенной опасности выбросов, образующихся при разной технологии термического разложения биомедицинских отходов.

Материалы и методы исследования

Исследованию подвергалась корпускулярная фаза воздушного выброса, образующегося при термическом разложении пластмассовых изделий биомедицинского назначения, отсортированных по виду изделий и типу пластмассы. Данный объект был избран потому, что относительно низкая стоимость пластмасс и простота их обработки создали возможность массового производства изделий, широко применяемых в клинике и научных учреждениях медицинского профиля.

Отходы перерабатывали на новой, ранее не эксплуатировавшейся установке «ЭЧУТО-150.03» («Экологически чистая утилизация твердых отходов» (рисунок)), основным технологическим принципом работы которой является непрямое двухступенчатое сжигание, включающее предварительное термическое разложение (пиролиз) органической части исходного сырья, сжигание газообразных продуктов и дожиг коксового остатка [2, 7].

Для исследования влияния пиролиза на состав и количество канцерогенных соединений в выбросах термическую переработку проводили по двум схемам – с использованием процесса пиролиза и без пиролиза. Для сравнения часть несортированных отходов сжигали в печи открытого типа. Отбор корпускулярной фазы воздушного выброса проводили автоматическим пробоотборником «ОП-442ТЦ» с объемной скоростью 10 л/мин на фильтры АФА-РМА-20.

Установка «ЭЧУТО 150-03»

Исследование полициклических ароматических углеводородов в выбросах при термическом разложении отходов

Для определения состава и количества канцерогенных полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) фильтры экстрагировали бензолом три раза по 50 мл на ультразвуковой бане (Branson B-12, 50 Гц) по пятнадцать минут; все экстракты анализируемой пробы объединяли и концентрировали до объема 10 мл. Часть экстракта отбирали для проведения биологических экспериментов. Для качественного и количественного определения ПАУ был использован разработанный в нашей лаборатории высокочувствительный спектрально-флуориметрический метод, основанный на избирательном возбуждении спектров флуоресценции замороженных при 77 °К поликристаллических н-октановых растворов (эффект Шпольского). Анализ исследуемых соединений осуществляли низкотемпературным спектрально–люминесцентным методом на спектрофлуориметре Hitachi M-850 (Япония) с двойным монохроматором на входе (возбуждение) и выходе (эмиссия люминесценции) и приставкой для низкотемпературной люминесценции (флуоресценции и фосфоресценции) с ксеноновым источником возбуждения [1, 12]

Биологические тесты

Тест Эймса. Индукция генных мутаций в системе сальмонелла/микросомы [13] проводилась в соответствии с международным стандартом [11]на индикаторных штаммах Salmonella typhimurium ТА100, дающих обратные мутации по механизму замены пар оснований и ТА98, мутирующей в результате сдвига рамки считывания. Метаболическую активацию промутагенных соединений осуществляли микросомной фракцией гомогената печени крыс линии «Вистар» с предварительной индукцией ферментов системы цитохрома P450 смесью полихлорированных бифенилов «Совол» [2]

Бензольные экстракты дымовых выбросов упаривали досуха, остаток растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО), инкубировали в пробирках с 0,6 % селективным полуобогащенным агаром, суспензией бактерий и микросомальной активирующей смесью S9, либо растворителем. Далее содержимое пробирок наносили на слой минимального агара без гистидина в чашках Петри. Позитивным контролем служили стандартные мутагены. В качестве прямого мутагена для штамма ТА100 использовали азид натрия или нитрозогуанидин, для штамма ТА98 2,7-диамино-4,9диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен (ДДДТДП). Способность фракции S9 активировать промутагены контролировали бенз/a/пиреном (БП) и 2-ацетиламинофлуореном (ААФ) для обоих штаммов. Учет результатов проводили через 48–72 часа инкубации при 37 °С. Наличие и величину мутагенного эффекта определяли по количеству колоний обратных ревертантов. В каждом варианте использовали по 3 чашки Петри на дозу.

Тест на нарушение метаболической кооперации клеток

В работе использовали линию иммортализованных клеток печени крысы IAR-2 [8]. Клетки рассевали на 6-луночные планшеты с покровными стеклами на дне. Через 24 часа после посева к клеткам добавляли экстракты в разведениях 1/100, 1/1000, 1/10000 и 1/100000 и инкубировали в течение 72 часов. За 2 часа до проведения эксперимента клетки, служащие положительным контролем, обрабатывали TPA (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат) (Cell Signaling Technology) в концентрации 5 нг/мл. После окончания инкубации клетки дважды промывали PBS, покрывали раствором люминесцентного индикатора (люцифер желтый) и наносили на монослой клеток царапины хирургическим скальпелем. Затем клетки инкубировали 2 минуты при 37 °С, во влажной атмосфере без доступа света, трижды промывали PBS в течение 1 мин при комнатной температуре. После промывки клетки покрывали фиксирующим раствором и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Стекла с клеточным монослоем исследовали на флуоресцентном микроскопе Zeiss с фотонасадкой (Axioplan 2 imaging), с использованием фильтра для FITC-флуоресценции и при 400-кратном увеличении.

Для каждой исследуемой дозы экстракта делали 10 независимых снимков области монослоя клеток, прилегающих к линии царапины. Разобщение межклеточных контактов определяли как отношение среднего числа слоев клеток, в которые произошло проникновение красителя для каждой концентрации исследуемого препарата к среднему числу слоев клеток, в которые произошло проникновение красителя в контрольных образцах (клетки, обработанные растворителем).

Индукция опухолей у дрозофилы

Тестирование проводили на гетерозиготах wtsP4/ + , полученных путем скрещивания: ♀ w; wtsP4/TM3 х ♂ D-32 по методике, описанной нами ранее [14]

Родителей скрещивали массово, помещая по 10 самок и 5 самцов в пробирки со стандартной питательной средой на 36–40 часов. Личинок первого возраста F1 обрабатывали испытуемыми соединениями из расчёта 0,2 мл раствора тестируемого вещества на пробирку (10 % экстракта корпускулярной фазы выброса в диметилсульфоксиде + 90 % дистиллированной воды). В качестве отрицательного контроля использовали 10 % ДМСО в дистиллированной воде, в качестве положительного – 3 мМ водный раствор оксоплатина (Lachema, Чехия).

Взрослых самцов и самок из F1 просматривали под бинокулярной лупой на наличие опухолей. Подсчитывали количество просмотренных особей (N), количество опухолевых клонов (ОК), рассчитывали частоту опухолей на 100 особей p = (ОК/N)∙100 %.

Во всех экспериментах статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента для определения М ± m, где М – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего, (стандартное отклонение ) с помощью пакета программ Microsoft Excel.

Результаты исследования и их обсуждение

В дыме печи открытого типа и установки ЭЧУТО было измерено содержание 6 ПАУ, из которых БП и БФЛ обладают высокой канцерогенной и мутагенной активностью. Количество всех ПАУ в дыме печи неорганизованного сжигания было на порядки выше, чем в выбросах установки ЭЧУТО, работавшей для сравнимости результатов по технологической схеме, не включающей процесс пиролиза (табл. 1).

Максимальное содержание БП в выбросах этой установки при сжигании пластмасс без пиролиза составило 65,85 мкг/мз, т.е. было в 33 раза меньше, чем в дымовом выбросе печи открытого типа, а БФЛ в 170 раз (табл. 1). В случае сжигания с пиролизом количество ПАУ в выбросе ЭЧУТО снизилось еще на 1–2 порядка и приблизилось по содержанию БП к ПДК в воздухе рабочей зоны, которая составляет 0,15 мкг/м3 (табл. 2).

Это связано с тем, что при пиролизе пластмассы разлагаются на простые олефины, которые сгорают при высокой температуре практически полностью [12, 7].

Выяснилось, что дымовые выбросы от сгорания различных изделий из одного и того же вида пластмасс образуют разное количество БП (табл. 2). В частности, сжигание без пиролиза полистироловых флаконов для культивирования клеток давало в несколько раз больше БП, чем сжигание других изделий из полистирола. Это связано с тем, что название «полистирол» объединяет ряд вариантов с различным строением молекулы. В исходном виде полистирол гидрофобен и не пригоден для изготовления флаконов, в которых культивируются клетки, поскольку они не могут прикрепляться к их поверхности. Для повышения гидрофильности и улучшения условий адгезии клеток в его состав вводят дополнительные NH2 группы.

Таблица 1

Содержание ПАУ в дымовых выбросах при сжигании отходов в печи открытого типа и в установке ЭЧУТО без пиролиза

Примечания:

н.и. – не идентифицирован

Б(а)П – бенз(а)пирен; Б(е)П – бенз(е)пирен; БФЛ – бенз(b)флуорантен + бенз(k)флуорантен; ДБА – дибенз(a,h)антрацен + дибенз(a,c)антрацен; БА – бенз(а)антрацен; Ф – фенантрен.

Таблица 2

Влияние пиролиза на содержание бенз(а)пирена в дымовом выбросе

Примечание.* остаток БП при сжигании с пиролизом в % к его количеству при сжигании без пиролиза.

Таким образом, утилизация пластмасс биомедицинского назначения на установке ЭЧУТО с пиролизом приближает выброс БП, индикатора содержания ПАУ, к уровню ПДК для воздуха рабочей зоны.

Мутагенное действие экстрактов дымового выброса

Экстракт дыма печи открытого типа вызвал значимый мутагенный эффект, по типу замены пар оснований (ТА 100) в варианте с метаболической активацией (+S9), был получен при добавлении в культуры эквивалента 0,14 литра дыма, а без активации (-S9) от эквивалента 1,35 литра, т.е. на порядок больше (табл. 3). Такая же разница, но при меньших концентрациях была получена и на штамме ТА 98. Это свидетельствует о том, что в дыме содержалось значительно больше стабильных канцерогенов непрямого действия, чем менее устойчивых с прямым действием.

Таблица 3

Мутагенное действие экстракта дыма печи открытого типа на индикаторные штаммы бактерий ТА 100 и ТА 98

Обозначения к табл. 3–7:

* – доза на чашку в пересчете на 1 литр выброса.

Mi/Mo – отношение числа ревертантов в опыте к числу ревертантов в контроле.

МА – мутагенная активность препарата.

«+» наличие, «–» отсутствие мутагенной активности.

М ± m – стандартная ошибка среднего

В выбросе установки ЭЧУТО при сжигании без пиролиза статистически значимый мутагенный эффект экстрактов дыма был обнаружен только от пищевых полипропиленовых стаканов и полистироловых флаконов для культивирования клеток. В обоих случаях эффект проявлялся при метаболической активации экстрактов, которые индуцировали как мутации типа сдвига рамки считывания, так и замены пар оснований. Эффект мутагенов прямого действия отсутствовал. Добавление в культуры сальмонеллы экстракта 0,47 л дыма, образовавшегося при сгорании пищевых стаканов из полипропилена, который в соответствии с табл. 1 должен содержать около 0,03 мкг БП и 0,007 мкг БФЛ, вызвало у штамма ТА100 повышение количества ревертантов в 3,6 раза по сравнению с фоном и такое же при добавлении к штамму ТА98 экстракта эквивалентного 1,18 л дыма (0,09 мкг БП и 0,021 мкг БФЛ). При этом в положительном контроле данного опыта чистый БП вызвал превышение фонового уровня мутаций на штамме ТА100 в 21,6 раза при дозе на два порядка большей – 4,4 мкг на чашку (табл. 4).

На штамме ТА98 (табл. 5) БП при дозе 10 мкг в положительном контроле повысил уровень мутирования в 6 раз – на величину того же порядка, что и экстракт, содержавший, согласно табл. 1, БП в дозе – 0,09 мкг БП и 0,021 мкг БФЛ.

Еще более выраженное несоответствие мутагенного эффекта экстрактов дыма в сравнении с содержанием в них БП выявилось при анализе образцов от сжигания без пиролиза культуральных флаконов. В этом эксперименте на штамме ТА100 экстракт, содержащий 0,18 мкг БП и 0,04 мкг БФЛ, вызвал повышение уровня мутаций в 5 раз, а 4,4 мкг чистого БП – в 10,7 раза (табл. 6). В культуре ТА98 эффект был аналогичным: 7-кратное повышение количества ревертантов от экстракта с 0,18 мкг БП и 0,04 мкг БФЛ и практически такое же – в 10,9 раза от 4,4 мкг чистого БП в положительном контроле (табл. 7).

Таблица 4

Мутагенное действие экстракта дыма от установки ЭЧУТО на индикаторный штамм бактерий ТА 100

Таблица 5

Мутагенное действие экстракта дыма от установки ЭЧУТО на индикаторный штамм бактерий ТА 98

Таблица 6

Мутагенное действие экстракта выбросов на индикаторный штамм бактерий ТА 100 (сжигание без пиролиза)

Таблица 7

Мутагенное действие экстракта выбросов на индикаторный штамм бактерий ТА 98 (сжигание без пиролиза)

Таким образом, полученные эффекты не могут быть отнесены за счет действия только сильных мутагенов БП и БФЛ, поскольку их суммарное содержание в мутагенных дозах экстракта было на порядок ниже минимальной мутагенной дозы, которая при изолированном действии БП составляет 2 мкг на чашку. Очевидно, что полученный эффект зависит от наличия в дыме помимо БП и ДБА других сильных мутагенов типа бензфенантренов, тетрафенов, бензпирен-хинонов, требующих других методов определения [4, 10]. Существенно, что если в процесс был включен пиролиз, то во всех случаях мутагенная активность отсутствовала, то есть при этом разрушаются и не определявшиеся нами мутагены. Таким образом, мутагенность дымового выброса в установке ЭЧУТО зависит от типа пластмассы и режима ее переработки. В целом низкое содержание одного или нескольких избранных канцерогенов, определяемых в дыме, не может быть гарантией его мутагенной безопасности.

Нарушение клеточной кооперации экстрактами дымовых выбросов

Все экстракты дыма в исследованном диапазоне концентраций практически в равной степени препятствовали распространению в клетках флуоресцирующего красителя, т.е. разобщали их щелевые межклеточные контакты (табл. 8). Эффекты были дозозависимыми при разведениях 1∙10–3–1∙10–4.

Таблица 8

Разобщение клеток экстрактами дымовых выбросов

Примечание. Во всех случаях, кроме *, доля прокрашенных клеток значимо отлична от контроля с Н2О (Р < 0,01). ** (12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат).

Наиболее вероятно, что этот эффект не связан с ПАУ, поскольку в результате пиролиза их содержание в выбросах на примере БП уменьшалось на несколько порядков, но при этом способность разобщать клетки практически не изменялась. Относительно их природы можно сказать только, что они обладают термостойкостью.

Данный фрагмент исследования впервые показал, что при термическом разложении пластмасс образуются соединения, обладающие способностью ингибировать клеточную кооперацию и по этому свойству могущие быть промоторами канцерогенеза, как это было показано относительно других соединений [9, 15].

Индукция опухолей у дрозофилы экстрактами дымовых выбросов

Результаты экспериментов показали, что канцерогены, к которым чувствительна дрозофила – канцерогенные металлы, N-нитрозосоединения и некоторые другие агенты [14] не образуются при сгорании пластмассовых изделий медико-биологического назначения и что концентрация канцерогенных ПАУ находится ниже уровня, способного вызывать у них опухоли (табл. 9). Канцерогенные ПАУ вызывают опухоли у личинок дрозофилы только в относительно высоких концентрациях, поскольку, как показали наши исследования, ферменты системы цитохрома Р450 в их клетках менее активны, чем у млекопитающих

Таблица 9

Индукция опухолей у дрозофилы экстрактами дымовых выбросов

Примечания: N – количество особей; ОК – количество опухолевых клонов; * – частота статистически значимо отлична от контроля, Р < 0,01.

Заключение

При неорганизованном сжигании твердых отходов в печи открытого типа с дымом выбрасывается большое количество канцерогенных ПАУ прямого и непрямого действия. Дымовой выброс специализированной установки ЭЧУТО 150-03 от сжигания пластмассовых отходов биомедицинского назначения в беспиролизном режиме содержит в несколько раз меньше этих соединений, причем только с непрямым механизмом действия. Пиролиз уменьшает содержание канцерогенов в дыме на один-два порядка и приближает его к ПДК в воздухе рабочей зоны. Низкое содержание в выбросе одного или двух индикаторных канцерогенов не может служить показателем его мутагенной и канцерогенной безопасности, поскольку значительное количество реверсий штаммов сальмонеллы в тесте Эймса было получено при содержании бенз(а)пирена и бензфлуорантенов в экстрактах дыма в количестве на порядок ниже минимально мутагенного. Различные типы полистирола и полипропилена дают при горении дым с различным содержанием ПАУ. Экстракт этого дыма содержит соединения, разобщающие клеточные контакты, причем пиролиз не снижает их содержание. Разобщающий эффект экстракта не коррелирует ни с их мутагенностью, ни с содержанием в них ПАУ, т.е., по-видимому, связан с неизвестными пока термостабильными соединениями. Корпускулярная фаза дыма от сжигания пластмасс на установке ЭЧУТО не содержит соединений, которые в полученных концентрациях увеличивали бы частоту образования опухолей у гетерозиготных личинок дрозофилы, высоко чувствительных к действию многих канцерогенов млекопитающих, за исключением ПАУ. Относительно установки ЭЧУТО 150-03 можно заключить, что она эффективно перерабатывает пластмассовые изделия медицинского назначения при минимальном загрязнении воздушного бассейна мутагенными и канцерогенными выбросами.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 13-0401308 А.

Ильницкий А.П., д.м.н., ведущий научный сотрудник, НИИ института канцерогенеза ФГБНУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина», г. Москва;

Соленова Л.Г., д.б.н., ведущий научный сотрудник, НИИ института канцерогенеза ФГБНУ «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина», г. Москва.

Работа поступила в редакцию 19.12.2014.