В последние годы большое внимание уделяется регуляторным факторам в патофизиологии и саногенезе патологических состояний. С этой точки зрения, одним из фокусов пристального внимания являются факторы, экспрессируемые эндотелием. При этом регулирующую роль эндотелия невозможно переоценить из-за его присутствия во всех без исключения органах, на структурное и функциональное состояние которых он оказывает значимое воздействие. Эндотелиоциты обладают паракринными свойствами, секретируемые ими биологически активные пептиды и химические соединения регулируют активность различных клеток и оказывают определяющее влияние на состояние кровотока в сосудах. Наиболее важными из них являются оксид азота NO и эндотелины.
Эндотелины – группа биологически активных пептидов широкого спектра действия, являющихся одним из важнейших регуляторов функционального состояния эндотелия. Впервые эндотелин был идентифицирован в 1988 г. в культуре эндотелиальных клеток аорты свиньи и рассматривался как эндотелиевый фактор с высокой вазомоторной активностью [21, 22, 39].
Эндотелий сосудов секретирует проэндотелин (Big-эндотелин), который, благодаря эндотелинпревращающему ферменту, находящемуся внутри и на поверхности эндотелия, преобразуется в три эндотелиновых изоформы: эндотелин-1, эндотелин-2 и эндотелин-3 [34, 40], при этом вазомоторная активность эндотелина повышается в 140 раз.
Эффекты эндотелина зависят от взаимодействующего с ним рецептора и особенностей их локализации. Рецепторы типа ETA (А-рецепторы) расположены на мембранах гладкомышечных клеток сосудов, и их взаимодействие с лигандом вызывает развитие сокращений клеток, приводя в итоге к выраженному спазму сосудов [28]. В противоположность этому рецепторы типа ETB (В-рецепторы) расположены на эндотелиоцитах, и их активация стимулирует повышение активности NO-синтазы. Таким образом, при помощи одного и того же фактора реализуются две противоположные сосудистые реакции (сокращение и расслабление), вызываемые различными механизмами.
Эндотелины и их рецепторы идентифицированы во многих тканях. Установлено, что эндотелин-1 продуцируется эндотелиальными клетками и может синтезироваться подлежащими гладкомышечными клетками, нейронами, астроцитами, клетками эндометрия, гепатоцитами, мезангиоцитами, клетками Сертоли, тканевыми базофилами, меланоцитами и др. [2, 26]. Эндотелин-2 присутствует в почках, кишечнике, миокарде, плаценте, матке, а эндотелин-3 считается относительно специфичным для головного мозга, где он образуется в наибольшем количестве [1].
Самым распространенным из эндотелинов является эндотелин-1. Именно его признают одним из маркеров коронарного атеросклероза и коронарной эндотелиальной дисфункции, нарушения функционирования печени, снижения функции почек. Кроме того, высокий уровень эндотелина-1 в плазме крови наблюдается при таких состояниях, как ишемическая болезнь сердца, острый инфаркт миокарда, нарушение ритма сердца, гипертрофия миокарда, а также после гемодиализа и эпизодов значительного подъема артериального давления [5, 14, 15, 17, 31].
Действие эндотелина-1 связывают с развитием гипертрофического фенотипа кардиомиоцитов и нарушением упорядоченности миофибрилл в них при гипертрофической кардиомиопатии [35]. Показано, что у крыс SHR (характеризующихся ранним развитием гипертрофии сердца) действие эндотелина-1 на кардиомиоциты, обусловливающее увеличение площади поверхности клеток, плотности внутриклеточного актина и синтеза белков, опосредовано через фосфорилирование внеклеточной сигнал-регулируемой киназы ½ (ERK1/2) [41].
Установлено, что эндотелин-1 индуцирует в разных органах и тканях провоспалительные процессы, способствуя усилению выработки супероксид аниона и секреции цитокинов [27]. Показано также, что эндотелин-1 вовлекается в активацию таких транскрипционных факторов, как NF-κB, влияет на усиление синтеза фактора некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкинов 1 и 6. Внутривенное введение блокатора А-рецептора эндотелина сопровождается повышением антиоксидантных свойств плазмы крови, снижением процессов перекисного окисления липидов и уменьшением артериального давления. Применение блокаторов эндотелиновых рецепторов А и В (таких как босентан, ситаксентан или BQ788) оказывало также выраженный кардиопротективный эффект у мышей с доксорубициновой кардиомиопатией [33].
Эндотелин-1 не накапливается в эндотелиальных клетках, а быстро образуется под воздействием таких факторов, как гипоксия, ишемия, острый стресс [38]. Эти факторы активируют транскрипцию иРНК и синтез предшественников эндотелина через механизмы, связанные с белками цитоплазматической мембраны эндотелиоцитов [6]. В то же время, катехоламины, ангиотензин II, липопротеины высокой плотности, факторы роста, тромбин, тромбоксан А2, Са2+-ионофор активируют внутриклеточные механизмы синтеза эндотелина-1 [32]. К ингибиторам синтеза эндотелина-1 и эндотелина-2 относят натрийуретические пептиды, а синтеза эндотелина-3 – простагландин Е2, простациклин и оксид азота (NO).
В ряде работ освещаются множественные механизмы взаимодействия эндотелиоцитов с клеточным и матриксным окружением в сердечной мышце [20, 24]. При этом эндотелиоциты, как правило, являются зависимым звеном во множественной межклеточной стимуляции. Эндотелин-1 способствует усилению экспрессии адгезивных молекул на эндотелиальных клетках сосудов и стимулирует таким образом агрегацию нейтрофилов, что, в свою очередь, способствует развитию воспалительных процессов и эндотелиальной дисфункции [27].
Эндотелиальная дисфункция, в свою очередь, является важным патогенетическим звеном в развитии многих сердечно-сосудистых заболеваний, в частности, атеросклероза. Усиление экспрессии эндотелина-1 выявлено как в клинических исследованиях атеросклероза, так и в его экспериментальных моделях [12], причем уровень эндотелина-1 в крови коррелирует с тяжестью патологического процесса. Установлено также повышение экспрессии эндотелина-1 в гладкомышечных клетках из коронарных артерий с атеросклеротическими повреждениями по сравнению с таковыми из артерий без атеросклеротических бляшек [19]. При этом эндотелин-1 ассоциирован преимущественно с самими атеросклеротическими бляшками, особенно с теми их участками, в которых высоко содержание моноцитов/макрофагов [16].
Эндотелин-1 играет важную роль в развитии кардиофиброза при различных патологических состояниях, например, при таких как гипертензия или диабет, а также при старении [37]. Экспрессия эндотелина-1 заметно возрастает в фибробластах, полученных из сердца мышей и прошедших 30 пассажей при культивировании (по сравнению с фибробластами после 3 пассажей). Усиление экспрессии эндотелина-1 было выявлено также в сердцах стареющих мышей (в возрасте 130 нед) и в срезах сердец людей в возрасте 70 лет. Усиление экспрессии эндотелина-1 во всех этих случаях сопровождалось повышением экспрессии фибронектина и коллагена. Ингибирование эндотелина-1 с помощью siRNA или ингибиторов эндотелин-конвертирующего фермента в фибробластах, прошедших 30 пассажей, приводило к заметной супрессии фибропластических процессов.
В миокарде экспериментальных животных с возрастом выявлено усиление экспрессии эндотелина-1, индуцибильной NO-синтазы (iNOS) и фактора некроза опухолей-α при снижении экспрессии эндотелиновых В-рецепторов и эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) [18]. Отмеченные возрастные изменения в экспрессии NO-синтаз и субтипов эндотелиновых рецепторов могут быть купированы при снижении калорийности употребляемой пищи.
Достаточно много работ посвящено изменению уровня эндотелина в периферической крови при сердечно-сосудистой патологии, в частности, при инфаркте миокарда. Установлено, что при острой ишемии миокарда повышается уровень эндотелина-1 в периферической крови, а его концентрация коррелирует с тяжестью патологического процесса [5]. При осложненном течении инфаркта миокарда уровень эндотелина-1 в плазме сохраняется в высокой концентрации и в подострый период [13].
Более того, рядом исследований показано, что длительное повышение уровня эндотелина-1 при инфаркте миокарда выступает в качестве неблагоприятного прогностического фактора в плане развития осложнений и прогрессирования сердечной недостаточности [23], что приводит к рекомендациям назначения больным инфарктом миокарда блокаторов эндотелиновых рецепторов [11, 30].
В то же время в ряде работ поднимается вопрос о неоднозначности действия эндотелина на процессы, вызванные острым ишемическим повреждением, – расширением зоны инфаркта и усилением аритмогенеза в ранние сроки, но ускорением репарации зоны инфаркта в последующем [25]. При этом исследование системного уровня эндотелина не вполне отражает особенности его тканевого распределения [9, 36]. В динамике развития инфаркта миокарда продемонстрировано различие экспрессии генов эндотелина в разных участках сердца [29]. Кроме того, при изменении концентрации разных ростовых факторов в очаге поражения и вблизи него в постинфарктный период возможно изменение параметров цитолиза, сдвиг фаз воспаления и репаративных процессов [7, 8, 10].
Нами проведено исследование динамики экспрессии эндотелинов в сердечной мышце при развитии инфаркта миокарда и на стадиях его репарации. Изучены образцы миокарда, полученные от 29 пациентов (из них 18 мужчин), умерших в различные сроки трансмурального инфаркта. В 50 % случаев возраст умерших был старше 65 лет (средний возраст составил 63,7 года).
Все случаи инфаркта миокарда были распределены в зависимости от давности на основании гистологических критериев: некроз кардиомиоцитов, нейтрофильная инфильтрация и характер ее распределения, инфильтрация лимфоцитами, макрофагами, плазматическими клетками, пролиферация кровеносных сосудов, фибробластов, коллагеновые волокна [3, 4]. Нами исследована синтетическая функция резидентных клеток, принимающих участие в формировании новых сосудов из предсуществующих, в отношении эндотелина. Иммуногистохимическим методом выявляли экспрессию эндотелина в зоне инфаркта миокарда и периинфарктной зоне.
При исследовании патологоанатомического материала в случае гибели пациентов в первые сутки после развития инфаркта миокарда зарегистрирована подчеркнутость сосудов в зоне некроза миокарда. В остальные сроки сохранялась окраска эндотелиоцитов, в основном в периинфарктной зоне. При этом максимальная интенсивность окраски отмечена на 7–13-е сутки.
Учитывая полученные нами данные о характере экспрессии эндотелина при инфаркте миокарда у людей, а также данные литературы о таких эффектах эндотелина, как регуляция роста и выживаемости самих синтезирующих эти пептиды эндотелиоцитов и окружающих их клеток, нами исследована продукция эндотелинов при экспериментальном инфаркте миокарда. Чтобы проследить связь между уровнем продукции эндотелина и сохранностью активности ферментов, участвующих в реакциях окислительного фосфорилирования, нами произведено иммунофлюоресцентное исследование на OxPhos комплекс.
Выявлено, что у животных контрольной группы наблюдалась нежная окраска на эндотелин в зоне инфаркта миокарда и периинфарктной зоне, начиная с 1-х суток после моделирования патологического процесса. Окраска на OxPhos Complex IV выявила закономерное снижение яркости окраски в зоне инфаркта и прилегающих к ней участках по сравнению с зоной «интактного» миокарда уже через 2 ч после моделирования инфаркта. С 1-х суток, когда наблюдалось начало повышения синтеза эндотелинов, выявлена легкая неравномерность распределения OxPhos-комплексов в кардиомиоцитах пограничной зоны и отсутствие окраски в зоне инфаркта миокарда. Неравномерность окраски сохранялась до 14-х суток наблюдения.
Пик окраски на эндотелин наблюдался на 3-и сутки, когда выявлялась хорошо визуализируемая окраска в области грануляций, в то же время активность комплексов OxPhos в этой области находилась на невысоком уровне. К 7-м суткам интенсивность окраски на эндотелин значительно снижалась, в этот срок отмечалась подчеркнутость сосудов в пограничной и инфарктной зонах. В более поздние сроки специфическая окраска не регистрировалась. В «интактной» зоне специфическая окраска не регистрировалась весь период наблюдения.
Стимуляция эндотелия вазоэндотелиальным фактором роста (VEGF) резко усиливала окраску пограничной и инфарктной зон на эндотелин уже через 1 сутки после моделирования инфаркта миокарда. К 3-м суткам интенсивность окраски резко нарастала, затем медленно снижалась и регистрировалась до 14-х суток. Причем при использовании VEGF через 1 и 3 суток регистрировалось повышение выработки эндотелина и в сосудах «интактного» миокарда.
В то же время при введении VEGF регистрировалась глыбчатость и неравномерность окраски на OxPhos-комплексы в зоне ишемического повреждения начиная со 2-го часа после моделирования инфаркта миокарда. В срок 3–7 суток картина значительно отличалась от наблюдаемой в контрольной группе – интенсивность флюоресцентного свечения меток, связанных с OxPhos-комплексами, в кардиомиоцитах периинфарктной зоны достигала максимума, при этом также регистрировалась и в фибробластах в участках формирования постинфарктного кардиосклероза. Неравномерность и глыбчатость окраски сохранялись в последующие сроки наблюдения.
Изменение динамики выработки эндотелина в ответ на повышение уровня VEGF свидетельствует о сдвиге и повышении экспрессии этого регулятора на более ранние этапы репарации миокарда после его ишемического повреждения. Вероятно, это объясняется, с одной стороны, большей сохранностью клеток в зоне ишемического повреждения при высоких концентрациях ростовых факторов, способностью их к ответу на стимуляцию в условиях гипоксии, а с другой стороны – повышением готовности генного аппарата клеток к ответу на стимулы, активирующие транскрипцию генов в ответ на экстрацеллюлярные сигналы. С учетом эффекта взаимодействия данного лиганда с ETB рецепторами эндотелиальных клеток, приводящего к вазодилатации, выявленная динамика свидетельствует об увеличении объемного кровотока в зоне повреждения и прилежащих к ней областях миокарда.
При отсутствии в сосудах гладкомышечных клеток, имеющих доминирующие ETA рецепторы (при активации которых развивается вазоспазм), выделяемый эндотелин связывается с ETB рецепторами на эндотелиоцитах, что приводит к активации синтеза и экскреции NO и вазодилатации посткапиллярного русла.
Совокупность этих факторов (особенностей строения сосудов в зоне репарации и специфичности эффектов эндотелина в зависимости от типа связываемых рецепторов) может служить механизмом обеспечения повышенных метаболических потребностей в зоне активного репаративного процесса.
Применение антител к факторам роста снижало интенсивность окраски на эндотелин инфарктной и периинфарктной зон в ранние сроки после моделирования инфаркта миокарда (с 1-х по 3-и сутки), особенно это было характерно для животных, которым вводили анти-VEGF. После прекращения введения антител (по плану эксперимента последнее введение осуществлено на 3-и сутки) к 7-м суткам интенсивность окраски на эндотелин резко нарастала и достигала максимума, а к 14-м суткам вновь снижалась.
Столь значимая динамика выработки эндотелина в ответ на изменение концентрации факторов роста свидетельствует о функциональных связях между стимуляцией рецепторов факторов роста и синтезом эндотелина.
Анализируя полученные результаты, во-первых, необходимо отметить тот факт, что продукция эндотелина возрастает только в сосудах, прилегающих к зоне повреждения – там, где идет развитие воспалительного процесса и запуск механизмов репарации миокарда. Во-вторых, сроки повышения экспрессии эндотелинов (с 1-х по 14-е сутки инфаркта миокарда) соответствуют времени от запуска клеточной пролиферации в зоне повреждения до пика пролиферативной реакции. Стимуляция эндотелия повышенными концентрациями VEGF приводит к более раннему и более выраженному повышению продукции эндотелина в поврежденном миокарде. В-третьих, нам известно о разнонаправленном эффекте эндотелина на различные типы клеток, несущих на мембране рецепторы к этому полипептиду.
Основное действие эндотелин оказывает на ETA-рецепторы, активация которых приводит к резкому сокращению гладкомышечных клеток. Эндотелины также связываются с ETB-рецепторами на эндотелиоцитах, и это приводит к активации синтеза и экскреции NO и вызывает вазодилатацию. При этом в области репарации происходит развитие широкой сети капилляров, что обеспечивает большое рецепторное поле с ETB-рецепторами при отсутствии гладкомышечных клеток. Таким образом, повышение синтеза эндотелина может быть важным патофизиологическим механизмом поддержания повышенного объемного кровотока в участках формирования грануляционной ткани и активного фибропластического процесса, а также может поддерживать достаточный уровень энергетического обеспечения сократительной функции близлежащих кардиомиоцитов.
В то же время полученные результаты не опровергают тех фактов, что повышенный системный уровень эндотелина является плохим прогностическим признаком в отношении течения инфаркта миокарда на поздних стадиях постинфарктного кардиосклероза. Установлено [36], что уровень эндотелина в крови из коронарного синуса не связан с системным уровнем эндотелина, определяемым в венозной крови периферических вен. Однако полученные данные о прямой связи уровня окислительного фосфорилирования в области репарации миокарда с уровнем выработки эндотелина в зоне инфаркта ставят под сомнение пользу применения блокаторов ангиотензиновых рецепторов в острый и подострый периоды инфаркта миокарда.
Рецензенты:
Шкурупий В.А., д.м.н., профессор, зав. отделом общей патологии, ФГБНУ «НИИ экспериментальной и клинической медицины», г. Новосибирск;
Волков А.М., д.м.н., ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии, ФГБУ «Новосибирский НИИ патологии кровообращения имени акад. Е.Н. Мешалкина» Минздрава РФ, г. Новосибирск.