Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Основная причина патологических процессов в организме человека, вызывающих преждевременное старение и развитие многих болезней, избыточное накопление в организме активных форм кислорода (АФК). Защита клеток, тканей и других биоструктур от токсического действия АФК и органических свободных радикалов осуществляется антиоксидантами, под которыми понимают соединения различной химической природы, способные тормозить или устранять свободнорадикальное окисление органических веществ метаболитами молекулярного кислорода [11].

К настоящему времени проведенные исследования подтвердили высокую антиоксидантную активность молока [10], которая в большей степени обусловлена его белками, являющимися основными антиоксидантами специфического действия.

Однако молоко относится к скоропортящимся продуктам питания, что обусловливает его обязательную тепловую обработку на молочных заводах. Термолабильный характер полипептидов и их денатурация при термообработке должны способствовать изменению содержания свободных S-H связей в молоке и, как следствие, приводить к изменению интегральной антиоксидантной активности молока [8].

В связи с этим целью работы являлось исследование влияния наиболее распространенных промышленных режимов пастеризации молока (65 °С, 30 мин; 76 °С, 5 мин; 90 °С, 20 сек и 95 °С, 5 мин) на изменение его полипептидного состава.

В ранее опубликованных работах [2, 3] на основании одномерного электрофореза нами была показана неоднозначность изменения полипептидного состава молока при его пастеризации: рост, снижение содержания ПП определенной молекулярной массы, появление или исчезновение некоторых фракций ПП, что свидетельствует об одновременном протекании процессов дезинтеграции и реструктурирования ПП фрагментов при пастеризации.

Более детальное исследование протеома молока позволяет осуществить метод двумерного электрофореза (2DE) с последующей идентификацией ПП, претерпевающих наиболее значительные изменения при его термообработке.

Материалы и методы исследования

Подготовка проб молока. В работе осуществлялся нагрев проб молока до температуры пастеризации с соответствующей выдержкой при условии максимально возможного сокращения времени предварительного нагрева молока. Для этого пробы молочного сырья объемом 10 мл погружали в водяную баню, нагретую до 100 °С, и при интенсивном перемешивании нагревали до достижения необходимой температуры с последующей выдержкой.

Двумерный электрофорез в первом направлении (изоэлектрофокусирование) проводили с помощью самостоятельно изготовленных гелей (4 % акриламид, 0,1 % бисакриламид, 8 М мочевина, 1 % амфолита, 2 % ХАПС) в стеклянных трубочках (Bio-Rad) размером 1,0×180,0 мм. В качестве верхнего электродного буфера использовали 50 мм NaOH, нижнего – 20 мм Н₃PO_4. Для 2DЕ белок растворяли в ИЭФ-буфере (8 М мочевина; 2 М тиомочевина; 2 % ХАПС; 0,2 % амфолита рН 3–10; 30 мм ДТТ и 20 мм Tрис). Пробы фокусировали по следующей программе: 1 час при 100 В, 1 час при 200 В, далее каждый час повышали напряжение на 100 В до достижения 700 В (напряжение постоянное; сила тока не должна превышать 0,7 мА). Затем гели выдерживали 15 мин в уравновешивающем буфере (6 М мочевина; 2 % ДСН; 30 % глицерин; 50 мм Трис-HCl; следы бромфенолового синего и 2 % ДТТ) и накладывали на 2D-мини-гель (6–16 % ПААГ). 2DЕ проводили с использованием электродного буфера, содержащего 25 мм Tрис-HCl; 192 мм глицина и 0,1 % ДСН, при силе тока 5 мА на 1 гель в течение 20 мин, затем при 10 мА в течение 120–150 мин. Для визуализации белков гели окрашивали 0,1 % спиртовым раствором Кумасси R-250 в течение 10 мин, затем отмывали 50 % этанолом [5]. В ряде случаев белки дополнительно (перед помещением в раствор Кумасси R-250) окрашивали раствором солей серебра [12]. Гели сканировали при помощи Epson Perfection 3170 Photo, и данные переводили в числовые значения оптической плотности при помощи программы Scion Image [9] (Великобритания) и Flicker [6] (США).

Идентификацию белков осуществляли методом MALDI-TOF MS (Matrix аssisted laser desorption/ionisation – time of flight mass – spectrometers) [14, 15]. Для идентификации белков по масс-спектрометрическим пептидным картам была использована поисковая программа Mascot [7]. Поиск проводился в базе данных NCBI.nr, поддерживаемой NCBI [1], с ограничением по таксону Mammalia (млекопитающие) с указанной точностью и с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха, возможной модификации цистеинов акриламидом и неполного прохождения протеолитического гидролиза.

Результаты исследования и их обсуждение

Спектры полипептидов термообработанного коровьего молока, разделенных методом 2DЕ приведены на рис. 1.

Полученные результаты показали изменения спектров ПП при пастеризации молока, особенно минорных, что, очевидно, вызвано разложением более высокомолекулярных ПП, высвобождением оболочечных белков жировых шариков, а также образованием гликозилированных форм белков по разным аминокислотным остаткам и другими посттрансляционными модификациями [13].

Режим пастеризации 76 °С, 5 мин (рис. 1, в) вызвал наименьшее изменение спектров ПП в сравнении со всеми другими режимами пастеризации (65 °С, 30 мин; 90 °С, 20 сек.; 95 °С, 5 мин). При этом режиме сохранялось большее число высокомолекулярных ПП. Хорошо разделены ПП со средней мол. массой 50–70 кДа во всем диапазоне pI.

Оценка количества полипептидов нативного и пастеризованного при различных режимах молока, по данным 2DE, показала, что при всех режимах пастеризации степень деструкции нативных ПП достигает 15–27 % (рис. 2).

Для идентификации методом MALDI-TOF MS мы выбрали 3 ПП из числа исчезнувших, сильно изменяющихся по содержанию и появившихся при пастеризации. Результаты представлены в таблице: ПП № 1, 2 были вырезаны из геля нативного и № 3 из пастеризованного молока.

Из идентифицированных белков коровьего молока наибольший интерес представляют ПП № 2 и № 3. Chain A of Diferric Bovine Lactoferrin исчезает при всех исследованных режимах пастеризации, за исключением 76 °С, 5 мин (рис. 1). Однако и при этом режиме его содержание значительно уменьшается. Из литературы известно, что при его дезамидировании и автофрагментации с образованием пептидных составляющих происходит нарастание антирадикальных свойств, которые могут самостоятельно проявлять антиокислительные свойства [4], что, возможно, может увеличивать антиоксидантную активность пастеризованного молока. Нами было выявлено, что белок № 3 (Chain A, Structure-Based Design Of Novel Pin1 Inhibitors (I)) появляется в молоке после его пастеризации, за исключением жесткого режима 65 °С, 30 мин. Это может быть вызвано разрушением жировых глобул молока и выходом в плазму дополнительных ПП. Chain A, Structure-Based Design Of Novel Pin1 Inhibitors (I) может обладать антирадикальными свойствами и также повышать антиоксидантные свойства пастеризованного молока.

а) б)

в) г)

д)

Рис. 1. Влияние промышленных режимов пастеризации на полипептидный состав коровьего молока (нагрузка 690 мкг белка на гель): а) контроль; б) 65 °С, 30 мин; в) 76 °С, 5 мин; г) 90 °С, 20 сек; д) 95 °С, 5 мин

Рис. 2. Влияние режимов обработки на деструкцию полипептидов молока (Деструкция: количество разрушенных ПП в % от количества в нативном молоке)

Белки, идентифицированные из коровьего молока (для ПП № 1, 2 достоверны значения выше 71 единицы mowse score; для ПП № 3 достоверны значения выше 72 единиц mowse score)

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможном повышении антиоксидантной активности молока при его пастеризации, а также позволили выявить режимы термообработки (76 °С, 5 мин и 90 °С, 20 сек), приводящие к наименьшим изменениям в полипептидном спектре молока, что представляет как теоретический, так и практический интерес.

Рецензенты:

Ежкова Г.О., д.б.н., профессор, заведующая кафедрой технологии мясных и молочных продуктов, ФГБОУ ВПО «КНИТУ», г. Казань;

Чернов В.М., д.б.н., заместитель директора, ФГБОУ науки Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, г. Казань.

Работа поступила в редакцию 15.04.2015.