Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Литература

Александров А.В. 1 Грехов Р.А. 1 Шилова Л.Н. 1 Алехина И.Ю. 1

---

1 Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной ревматологии РАМН, Волгоград

Для диагностики ранних симптомов ревматоидного артрита (РА), системной красной волчанки (СКВ) и системной склеродермии (ССД) были разработаны новые диагностические тесты с использованием иммобилизированных антигенных препаратов на основе ферментов антиоксидантной системы (АОС). Выявленные изменения активности ферментов и содержания антител к ним при РА, СКВ и ССД являются свидетельством интенсификации антиоксидантной защитной системы при хронических аутоиммунных заболеваниях. Определение антител к ферментам АОС может использоваться для диагностики степени активности РА, СКВ и ССД, а также для дополнительной оценки эффективности проводимой терапии.

Статья в формате PDF

281 KB

1. Алекперов Р.Т., Старовойтова М.Н. Синдром Рейно в практике терапевта // Русский медицинский журнал. – 2010. – № 27. – С. 1695–1698.

2. Эмульсионная полимеризация как метод, модифицирующий ферменты с сохранением биологических свойств их наноструктур / И.П. Гонтарь, Г.Ф. Сычева, А.В. Александров и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2010. – № 12. – С. 715–719.

3. Фоломеева О.М., Эрдес Ш.Ф., Насонова В.А. Ревматические заболевания у населения Российской Федерации в начале XXI века // Тер. архив. – 2007. – № 12. – С. 5–12.

4. Gordon C., Salmon M. Update on systemic lupus erythematosus: autoanti-bodies and apoptosis // Clin. Med. – 2001. – Vol.1, №1. – P. 10–14.

5. Su W., Madaio M.P. Recent advances in the pathogenesis of lupus nephritis: autoantibodies and B cells // Semin. Nephrol. – 2003. – Vol. 23, № 6. – P. 564–568.

Из-за преимущественно хронического течения и склонности к неуклонному прогрессированию ревматические заболевания находятся на одном из первых мест среди причин ухудшения качества жизни, а также временной и стойкой нетрудоспособности, являясь тяжелым бременем, как для пациента, так и для всей системы здравоохранения [3]. В связи с этим наиболее актуальной становится проблема ранней диагностики начальных проявлений активации и прогрессирования патологического процесса у ревматических больных.

Целью работы явилась разработка дополнительных критериев иммунодиагностики ревматоидного артрита (РА), системной красной волчанки (СКВ) и системной склеродермии (ССД) с использованием иммобилизированных антигенных наносистем (АНС) на основе супероксиддисмутазы (СОД), церулоплазмина (ЦП), ксантиноксидазы (КО) и каталазы (КАТ).

Материалы и методы исследования

Исследовалась сыворотка крови 30 практически здоровых лиц - доноров станции переливания крови (группа контроля), а также 86 больных РА, 46 больных СКВ и 40 больных ССД. Диагноз РА и СКВ ставился на основании критериев Американского колледжа ревматологов 1987 г. и 1982 г. соответственно. Диагностика ССД, определение степени активности, характера течения и стадии заболевания проводились в соответствии с критериями АРА и отечественной классификацией (Н. Гусева, 1975).

Объектом исследований служила сыворотка крови. Ферментативную активность ЦП определяли по методике Ravin в модификации Тена (1981); активность плазменной СОД - по методу Дубининой Е.Е. и соавт. (1986); активность КО - по модифицированной методике Калькара (Дячина Е.Г., 1973); активность КАТ - по методу Королюк М.А. и соавт. (1988).

Антитела (АТ) к СОД, ЦП, КО и КАТ выявляли твердофазным иммуноферментным анализом в модификации Гонтаря И.П. и соавт. с использованием АНС, для получения которых применяли метод эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала и соответствующей антигенной матрицы [2].

Результаты исследования и их обсуждение

Предварительно нами были определены условия получения АНС:

1) АНС создавались на основе 20 %-го полиакриламидного геля и представляли собой гранулы сферической формы размером 10-100 мкм;

2) антигенную матрицу АНС формировали, используя водные растворы антигенов: оптимальная концентрация для СОД составила 1,4 мг/мл, для ЦП - 0,75 ммоль/л, для КО - 50 мкг/мл, для КАТ - 1,4 мкг/мл;

3) изучение влияния времени хранения на АНС с белковой матрицей показало, что максимальное количество белка удаляется из полиакриламидных гранул на 2-3 сутки хранения, а затем процесс резко замедляется; общее количество антигена, оставшееся в гранулах после 6 суток хранения, составило в среднем 96,8 %, после 30 суток - 96,8 %;

4) потери иммобилизированного антигена из АНС изучали при температуре +4, 20 и 37 °С; реальные потери белка при максимальной температуре составили 0,093 %. По-видимому, на поверхности гранул АНС имеются молекулы антигена, частично включенные в пространственную решетку геля, а при хранении и воздействии разных температур полиакриламидный гель несколько набухает, что и приводит к потерям белка.

При исследовании сывороток крови здоровых лиц на содержание антител к ферментам антиоксидантной системы организма с помощью иммуноферментного метода на основе АНС были получены следующие результаты: уровень АТ к СОД (M ± m) составил 0,06 ± 0,004 е.о.п., АТ к ЦП - 0,022 ± 0,003 е.о.п., АТ к КО - 0,032 ± 0,002 е.о.п. и АТ к КАТ - 0,067 ± 0,004 е.о.п. Ферментативная активность СОД в контрольной группе составила 40 ± 2,5 ед., ЦП - 1,087 ± 0,249 ед., КО - 3,67 ± 0,12 ед., КАТ - 22,6 ± 1,6 ед.

Ревматоидный артрит

При РА наблюдалось повышение ферментативной активности ЦП и КО (p = 0,035), снижение активности СОД и КАТ (p = 0,008). АТ к ЦП выявлены у 59,3 % больных РА, АТ к КО - у 47,7 % больных, АТ к СОД - у 65,1 % больных и АТ к КАТ - у 61,6 % больных РА.

У больных с I степенью активности РА при поступлении на стационарное лечение отмечалось повышение активности СОД (р = 0,12), ЦП (р = 0,007), КО (р < 0,001) и уменьшение активности КАТ (p = 0,004), а также увеличение содержания АТ к ЦП (р = 0,009), КАТ (p = 0,028) и СОД (р = 0,24). У больных РА со II степенью активности патологического процесса отмечено снижение активности СОД и КАТ (p = 0,039 и р = 0,042, соответственно) и увеличение содержания АТ к ним (p = 0,008 и р = 0,025 соответственно). Содержание АТ к ЦП и КО было в 1,5-2 раза выше уровня АТ при минимальной активности патологического процесса (р = 0,042), ферментативная активность ЦП (р > 0,05) и КО (p = 0,007) также возрастала. При III степени активности заболевания по сравнению с показателями больных РА с активностью II наблюдалось увеличение содержания АТ к СОД (p = 0,009), КО и КАТ (p > 0,05) и незначительное снижение уровня АТ к ЦП (р > 0,05), на фоне повышения активности ЦП (p = 0,004), СОД (p > 0,05) и уменьшения активности КАТ (p = 0,006) (табл. 1).

В результате проведенного в условиях стационара лечения у больных РА отмечалось повышение активности СОД (p = 0,029), КАТ (p = 0,025), снижение активности ЦП (р > 0,05), КО (p = 0,008) и уменьшение уровня антител к СОД (p = 0,033), КО (p = 0,007), ЦП и КАТ (р > 0,05).

Таблица 1

Показатели содержания антител к СОД, ЦП, КО, КАТ в зависимости
от активности патологического процесса (М ± SD)

Примечание: N - количество больных, SD - стандартное отклонение.

РА нередко сопровождается анемией, которая коррелирует не столько с длительностью болезни, сколько со степенью ее клинической активности (лихорадкой, количеством пораженных суставов, интенсивностью синовитов и другими проявлениями). Все больные РА были разделены в зависимости от уровня гемоглобина и количества эритроцитов на три группы: I группа - без анемии (57 человек); II группа - с анемией, 90 г/л < Hb < 115 г/л (19 человек); III группа - с выраженной анемией, Hb < 90 г/л (12 человек) (табл. 2).

Таблица 2

Уровни антител к СОД, КАТ и ЦП у больных РА с различным содержанием гемоглобина

Примечание: N - количество больных, SD - стандартное отклонение.

При поступлении в стационар у 31 (36 %) человека диагностированы явления анемии различной степени. Эта группа больных имела достоверные различия в содержании АТ к СОД, КАТ и ЦП по сравнению с пациентами без анемии (p < 0,001). В содержании АТ к КО у больных РА с различным уровнем гемоглобина различий не выявлено (р > 0,05).

Учитывая, что иммунологические изменения, происходящие в организме, тесно связаны с биохимическим процессами, было проведено изучение влияния выраженности антителогенеза к изучаемым ферментам на активность СОД, КАТ и ЦП у больных РА с различным уровнем гемоглобина. Ферментативная активность СОД была существенно снижена в III группе и достоверно отличалась от показателей больных РА с уровнем Hb < 115 г/л и > 90 г/л (II группа) (р = 0,0002). Статистически значимых различий между I и II группой в определении активности СОД выявлено не было (р = 0,320) (в I группе активность СОД - 4,76 ± 1,71, во II группе - 4,44 ± 1,79 и в III группе - 2,83 ± 1,12).

Также было отмечено угнетение ферментативной активности каталазы практически у всех больных РА, причем с нарастанием явлений анемии снижение активности фермента более выражено (в I группе активность КАТ - 9,62 ± 2,71, во II группе - 6,47 ± 1,78 и в III группе - 4,51 ± 0,96).

Известная стимулирующая роль ЦП на кроветворение подтолкнула нас к изучению зависимости между интенсивностью антителогенеза, содержанием ЦП с одной стороны, и выраженностью анемии - с другой. У больных I и II групп найдены достоверные отличия по уровню АТ к ЦП (p = 0,006), содержанию ферментативно-активного (1021 ± 329 и 1198 ± 499, p = 0,013) и иммунореактивного ЦП (1405 ± 492 и 1640 ± 704, p = 0,023). Изучаемые показатели в III группе были выше, чем во второй, но эти различия недостоверны (p > 0,05).

Таким образом, более высокий уровень антител к ферментам АОС наблюдается у больных с наличием внесуставных проявлений, особенно при развитии анемии, свидетельствуя о тяжести заболевания.

Системная красная волчанка

При СКВ имело место повышение ферментативной активности ЦП (менее выраженное, чем при РА, p = 0,048), снижение активности КАТ (p = 0,009), отмечена тенденция к росту активности КО (р > 0,05). Антитела к ЦП выявлены у 48 % больных СКВ, антитела к КАТ - у 52,2 % больных, АТ к СОД - у 39,9 % больных и АТ к КО - у 41,3 % больных. Следует отметить, что динамика показателей ферментативной активности и уровней антител к изучаемым энзимам у больных СКВ в зависимости от активности патологического процесса имела схожие черты с процессами, наблюдаемыми при РА (снижение активности СОД, p = 0,028 и КАТ, p = 0,019; на фоне роста уровня АТ к данным ферментам, p < 0,001) (см. табл. 1).

Однако имелись и особенности, так, например, в группе больных СКВ с наличием АТ к ЦП активность ЦП была существенно ниже, чем у больных без данных антител (p < 0,001). Интересные результаты были получены в ходе динамического наблюдения за больными. При выписке из стационара отмечалось некоторое снижение активности ЦП в группе больных без антител к ЦП. Однако в группе больных с наличием антител к ферменту активность ЦП не только не снижалась, а повышалась (p = 0,037). Уровень АТ к ЦП на фоне лечения имел тенденцию к снижению (р > 0,05). В группе больных СКВ с наличием АТ к КО отмечено увеличение активности фермента в сыворотке крови (p = 0,041), причем стандартная терапия оказывала слабое воздействие на нормализацию иммуно-биохимических сдвигов.

Системная склеродермия

Фиброзирование и нарушение микроциркуляции, приводящие к развитию ишемии и кардиосклероза, являются основой развития одного из ведущих висцеральных проявлений при ССД - поражения сердца. У 21 (52,5 %) больного ССД отмечалось поражение сердца.

Для раннего выявления сердечно-сосудистых осложнений при ССД наиболее эффективным оказалось определение антител к СОД. Данные антитела выявлялись в 40 % случаев. При минимальной степени активности патологического процесса (16 человек) высокие уровни АТ к СОД были выявлены у 6 (37,5 %) больных. С увеличением степени активности заболевания достоверные изменения отмечены при определении уровня АТ к СОД (р < 0,001) (табл.1). У больных ССД с поражением сердечно-сосудистой системы отмечены наиболее высокие уровни антител к СОД (c2 = 4,58; р = 0,032) и каталазе (c2 = 3,57; р = 0,048).

Больным ССД была проведена капилляроскопия сосудов ногтевого ложа, по результатам которой были выявлены характерные изменения: у 22 пациентов (55 %) - значительные нарушения (уменьшение количества капилляров, их деформация, наличие нескольких аваскулярных зон), у 10 (25 %) умеренные, у 8 (10 %) - невыраженные. Кроме того, все больные с высоким содержанием антител к СОД имели высокую (II-IV) степень синдрома Рейно, сопровождающегося выраженной ишемией и, следовательно, гипоксией тканей, в результате чего отмечается усиление пероксидации мембранных структур и апоптоза клеток [1].

Таким образом, иммунные механизмы оказывают существенное влияние на выраженность реакций свободнорадикального окисления при ревматических заболеваниях. Активные формы кислорода могут оказывать патогенное воздействие на биомолекулы и структуры клетки непосредственно, либо инициируя процессы перекисного окисления липидов, приводя к повреждению белков, липидов, нуклеиновых кислот и придавая им свойства аутоантигенов. Образование аутоантител к таким структурам является ключевым звеном патогенеза системных ревматических заболеваний и происходит задолго до развития выраженных клинических проявлений [4, 5].

Выводы

Показатели ферментативной активности и содержания антител к ферментам-прооксидантам (КО) и ферментам антиоксидантной защиты организма (ЦП, СОД и КАТ) могут использоваться в диагностике ранних клинических проявлений РА, СКВ и ССД, а также в качестве дополнительного критерия оценки эффективности проводимой терапии.

Рецензенты:

Краюшкин С.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой амбулаторной и скорой медицинской помощи ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздравразвития, г. Волгоград;

Борис Ф.Н., д.м.н., профессор, зав. кафедрой госпитальной терапии ВБОУ ВПО «Кировская ГМА» Минздравсоцразвития России, г. Киров.

Работа поступила в редакцию 29.09.2011.

Библиографическая ссылка