Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Махнева Н.В. 1 Белецкая Л.В. 2

---

1 ГУ Московский областной научно-клинический исследовательский институт им. М.Ф. Владимирского, Москва

2 ФГУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития России, Москва

Кадгерины представляют собой разнообразную группу кальций-зависимых гликозилированных протеинов. Аномалия экспрессии или дисфункция этих молекул, приводят к серьезным деструктивным последствиям. При аутоиммунных буллезных дерматозах выявлено нарушение степени экспрессии кадгеринового комплекса вплоть до его исчезновения из нормальной локализации и появление извращенной его экспрессии в зоне базальной мембраны эпидермиса. Выявленные изменения экспрессии и локализации кадгеринов свидетельствуют о том, что под действием этиологических и патогенетических факторов происходит переключение функции одних генов на другие гены, т.е. при подавлении одних и активации других. Полученные сведения могут быть использованы в качестве дополнительных диагностических маркеров в дифференциальной диагностике аутоиммунных буллезных дерматозов.

Статья в формате PDF

475 KB

кадгериновый комплекс

непрямой метод иммунофлюоресценции

аутоиммунные буллезные дерматозы

1. Махнева Н.В., Белецкая Л.В. Способ диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов: патент России № 2352947.2009. Бюл. № 11.

2. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия. – М.: Медицина, 1995. – 224 с.

3. Mice lacking desmocollin 1 show epidermal fragility accompanied by barrier defects and abnormal differentia-

tion / M. Chidgey, C. Brakebusch, E. Gustafsson, A. Cruchley, C. Haill, S. Kirk, A. Mernitt, A. North, C. Tselepis, J. Hewitt //

J. Cell Biol. – 2001. – Vol. 155, № 5. – P. 821–832.

4. Expression of cadherin cell adhesion molecules during human skin development: morphogenesis of epidermis, hair follicles and eccrine sweat ducts / M. Fujita, F. Furukawa, K. Fujii, Y. Horiguchi, M. Takeichi, S. Imamura // Arch. Dermatol. Res. – 1992. – Vol. 284, № 3. –

P. 159–166.

5. Getsios S., Huen A.C., Green K.L. Working out the strength and flexibility of desmosomes // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2004. – Vol. 5, № 4. – P. 271–281.

6. Kottke M., Delva E., Kowalczyk A.P. The desmosome: cell science lessons from human diseases // J. Cell Sci. – 2006. – Vol. 119, Pt. 5. – P. 797–806

7. Immunohistochemical examination of P-cadherin in bullous and acantholytic skin diseases / A. Kovacs, E. Schmidt, A. Begany, J. Hunyadi, A. Szegedi // Acta Derm.Venereol. – 2004. – Vol. 84, № 2. – P. 116–119.

8. Postnatal lethality of P-cadherin/desmoglein3 double knockout mice: demonstration of a cooperative effect of theses cell adhesion molecule in tissue homeostasis of stratifird squamous epithelia / J.M. Lenox, P.J. Koch, M.G. Mahoney, M. Lieberman, J.R. Stanley, G.L. Radice // J. Invest. Dermatol. – 2000. – Vol. 114, № 5. – P. 948–952.

9. Nicolas J.F., Staquet M.J. Molecules de l’adherence cellulaire et pathologie cutanee //Ann. Dermatol. Venereol. – 1995. – Vol. 122, № 1–2. – P. 50–57.

10. Mutations in ATP2C1, encoding a Ca2+pump, cause Darier disease / A. Sakuntabhai, V. Ruiz-Perez, S. Carter, N. Jacobsen, S. Burge, S. Monk, M. Smith, C.S. Munro, M. O’Donovan et al. // Nat. Genet. – 1999. – Vol. 21, № 3. – P. 271–277.

Кадгерины представляют собой наиболее разнообразную группу кальций-зависимых гликозилированных протеинов. Они участвуют главным образом в межклеточных взаимодействиях, обеспечивающих адгезию между двумя идентичными молекулами, которые экспрессированы на поверхности двух клеток одного и того же типа [2, 5]. Цитоплазматический домен этих молекул играет важную роль в связи с протеинами цитоскелета, способствуя сохранению формы клеток [6]. Кроме физического контакта, который обеспечивают кадгерины между двумя клетками, они способствуют передаче ряда сигналов через структуры цитоскелета, контролируя рост и дифференцировку клеток [5]. В коже молекулы адгезии обеспечивают сложную организацию, вовлекая эпителий, дерму, сосуды, нервы, железы. И любые изменения, связанные с аномалией экспрессии или дисфункцией этих молекул, могут привести к серьезным деструктивным последствиям [2, 3, 9].

Целью исследования явилось определение степени экспрессии кадгеринового комплекса при аутоиммунных буллезных дерматозах и возможности использования полученных данных в качестве дополнительного диагностического маркера при данных заболеваниях.

Материал и методы исследования

Работа выполнена на основании клинического обследования и изучения биопсийного материала кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами.

Изучение степени экспрессии кадгеринового комплекса проведено непрямым методом иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител (МкАТ) мыши против кадгеринового комплекса, anti-pan cadherin (SIGMA, США) на 47 биоптатах клинически интактных участков кожи и биоптатах пораженных участков кожи 45 больных, из которых 23 больных аутоиммунной пузырчаткой (11 больных вульгарной пузырчаткой, 9 - себорейной пузырчаткой, один больной вегетирующей пузырчаткой, один - листовидной пузырчаткой, один - пранеопластической пузырчаткой), 16 больных буллезным пемфигоидом, 2 - линейным IgA-зависимым буллезным дерматозом, 4 - приобретенным буллезным эпидермолизом. В качестве контроля использовали криостатные срезы разных видов тканей. Срезы кожи практически здоровых лиц, больных, страдающих дилатационной кардиомиопатией, срезы почек человека и срезы сердца быка. При этом экспрессия кадгеринового комплекса была выявлена в межклеточных пространствах базального и шиповатого слоев эпидермиса (рисунок a), волосяного фолликула, в стенке артериол дермы, во вставочных пластинках кардиомиоцитов, в местах межклеточных контактов почечных канальцев и клубочков.

Под местной анестезией 2,0 %-м раствором новокаина проводилась биопсия кожи (из пораженных и клинически не пораженных участков) размером 0,5×0,5 см. Кусочки тканей замораживали при -20 °С. Серийные криостатные срезы толщиной 4-5 мкм готовили в микротом-криостате (-20 °С) и использовали в фиксированном виде (в 100 %-м холодном (4 °С) ацетоне в течение 10 мин). Затем срезы промывали физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS), pH 7,0-7,4, в течение 3-5 мин. При нанесении МкАТ на срезы препараты выдерживали в течение 18 ч при 4 °С во влажной камере. После промывки в течение 3-5 мин PBS (pH 7,0-7,4) срезы обрабатывали люминесцирующей сывороткой против иммуноглобулинов мыши ((НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Г.Гамалеи АМН РФ; ИМТЕК, Москва) в течение 50-60 мин во влажной камере в термостате при 37,0-37,2 °С, вновь промывали PBS 3-5 мин и заключали под покровное стекло в 60 %-й нейтральный глицерин. Исследовали препараты с помощью люминесцентного микроскопа LEITZ LABORLUX S (LEIKA). Препараты фотографировали на пленку РФ-3 с объективом х40 и окуляр-гомалем х3.

Часть срезов использовали в нефиксированном виде с целью обнаружения фиксированного иммуноглобулина в межклеточных пространствах и в зоне базальной мембраны эпидермиса при аутоиммунной пузырчатке и аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения (буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз) соответственно. Криостатные срезы, фиксированные 96° этанолом, окрашивали гематоксилином и эозином с целью морфологического контроля.

Результаты исследования и их обсуждение

При исследовании как клинически интактных, так и пораженных участков кожи 23 больных с различными формами пузырчатки выявлено нарушении экспрессии кадгеринового комплекса. Так, во всех исследованных 11 случаях вульгарной пузырчатки, наряду с участками нормальной экспрессии кадгеринов в межклеточных пространствах, выявлено их исчезновение из этой локализации или маскировка при одновременной экспрессии кадгерин-положительного материала в роговом слое и/или на поверхности кожи (рисунок б). Кроме того, в 5 случаях дополнительно обнаружена перицитоплазматическая или перинуклеарная экспрессия в отдельных клеточных элементах базального и шиповатого слоев с одновременной реакцией в зоне базальной мембраны эпидермиса. Подобную иммуногистохимичскую картину наблюдали в случаях вегетирующей (1) и паранеопластической (1) пузырчатки. Если в случае вегетирующей пузырчатки отмечена только перинуклеарная экспрессия кадгеринов в отдельных клеточных элементах, то в случае паранеопластической пузырчатки - дополнительно участками и в зоне базальной мембраны эпидермиса. Кроме того, в том и другом случаях отмечено скопление кадгерин-положительного материала в роговом слое и секвестрация его на поверхность кожи.

Интересно, что экспрессия кадгеринового комплекса при вульгарной пузырчатке отмечалась преимущественно (в 8 случаях из 11) в межклеточных пространствах базального и шиповатого слоев эпидермиса. При этом интенсивность свечения при иммуногистохимической реакции была различной, от выраженной экспрессии кадгеринового комплекса до полного ее отсутствия в местах начала формирования внутриэпидермального пузыря. В случаях образования внутриэпидермального надбазального пузыря обнаружено парадоксальное явление: усиление экспрессии кадгеринов в супрабазальных слоях, составляющих покрышку пузыря.

Во всех 9 исследованных случаях себорейной пузырчатки в клинически интактных участках, а также в очагах поражения кожи выявлена четкая картина нарушения экспрессии кадгеринов: от различной степени экспрессии их в межклеточных пространствах базального и шиповатого слоев до полного исчезновения со скоплением специфического материала в роговом слое и секвестрацией его на поверхность кожи. При этом в месте формирования внутриэпидермального пузыря, как и в случае вульгарной пузырчатки, отмечена выраженная экспрессия кадгеринов в супрабазальных слоях эпидермиса, составляющих его покрышку. Кроме того, в 5 случаях из 9 дополнительно обнаружена перинуклеарная экспрессия в отдельных клеточных элементах, а в 3 других случаях - в зоне базальной мембраны эпидермиса.

В местах формирования внутриэпидермальных пузырей отмечено поражение межклеточных соединений на более протяженных участках эпидермиса с участием всех его слоев и образованием как надбазальных (глубоких), так и поверхностных (на уровне зернистого слоя) внутриэпидермальных пузырей. Интересно, что у одного и того же больного можно наблюдать одновременно формирование пузырей на разных уровнях слоев эпидермиса. При этом усиление экспрессии кадгеринов выявлялось в цитоплазме кератиноцитов верхних слоев эпидермиса, а в некоторых случаях (3 случая) одновременно и участками в зоне базальной мембраны эпидермиса.

При одновременном исследовании клинически интактных и пораженных участков кожи двух больных себорейной пузырчаткой выявлена идентичная иммуноморфологическая картина - ослабление экспрессии кадгеринового комплекса на поверхности клеток базального и шиповатого слоев с перицитоплазматической или перинуклеарной экспрессией в отдельных клеточных элелементах и секвестрацией специфического материала на поверхность кожи. Причем в одном случае выявлена экспрессия в зоне базальной мембраны эпидермиса.

В случае листовидной пузырчатки отмечено исчезновение экспрессии молекул адгезии кадгеринов в широких зонах эпидермиса, несмотря на морфологическую патологию классической локализации поверхностного внутриэпидермального пузыря с выраженной экспрессией в нем кадгеринового комплекса.

При исследовании криостатных срезов кожи больных буллезным пемфигоидом во всех 16 исследованных случаях выявлено нарушение экспрессии кадгеринового комплекса. Так, в большинстве случаев (в 14 из 16) наряду с участками сохранения кадгеринов на поверхности клеток эпидермиса, выявлено исчезновение или маскировка молекул адгезии с проявлением их экспрессии в зоне базальной мембраны эпидермиса и перинуклеарной зоне отдельных клеточных элементов со скоплением кадгерин- положительного материала под роговым слоем и секвестрацией на поверхность кожи. Экспрессия кадгеринового комплекса в зоне базальной мембраны эпидермиса отмечена в 10 случаях из 14, а в месте образования подэпидермального пузыря также - на его покрышке и дне. При этом наиболее выраженная экспрессия наблюдалась на покрышке подэпидермального пузыря (рисунок в). В двух случаях буллезного пемфигоида экспрессии кадгеринового комплекса не было отмечено ни в одной из структур эпидермиса.

а                                   б

в                                                      г                              д

Экспрессия кадгеринового комплекса. Обработка моноклональными антителами
к pan-cadherin. Непрямой метод иммунофлюоресценции. х400:
a - криостатный срез практически здорового человека. Экспрессия кадгеринового комплекса в десмосомах межклеточных пространств (стрелка) эпидермиса; б - e: криостатные срезы клинически интактных участков кожи больных аутоиммунными буллезными дерматозами. Участки нормальной экспрессии кадгеринов перемежаются с участками подавления (стрелка) их экспрессии в десмосомах межклеточных пространств при аутоиммунной пузырчатке (b); в - буллезный пемфигоид. Выраженная экспрессия кадгеринов на покрышке (стрелка) подэпидермального пузыря; г - линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз. Реакция в зоне базальной мембраны эпидермиса (стрелка) с секвестрацией специфического материала
на поверхность кожи; д - приобретенный буллезный эпидермолиз. Выраженная реакция
на дермальной части (стрелка) подэпидермального пузыря

В двух исследованных случаях линейного IgA-зависимого буллезного дерматоза отмечена перинуклеарная экспрессия молекул адгезии в некоторых кератиноцитах и в зоне базальной мембраны эпидермиса с секвестрацией кадгерин-положительного материала на поверхность кожи (рисунок г). Подобную иммуногистохимическую картину наблюдали и в 4 исследованных случаях приобретенного буллезного эпидермолиза. При этом в месте расслоения дермо-эпидермального соединения экспрессия молекул адгезии выявлена как на эпидермальной, так и на дермальной частях. Наиболее выраженная иммуногистохимическая реакция отмечена на дне подэпидермального пузыря (рисунок д).

Заключение

При различных аутоиммунных буллезных дерматозах (аутоиммунная пузырчатка, буллезный пемфигоид, линейный IgA-зависимый буллезный дерматоз, приобретенный буллезный эпидермолиз) происходит нарушение экспрессии белков кадгеринового комплекса вплоть до его исчезновения и проявления в тех структурах эпидермиса, где в норме он отсутствует [1]. Отсутствие экспрессии кадгеринового комплекса в межклеточных пространствах эпидермиса свидетельствует о вовлечении его в иммунопатологический процесс при аутоиммунных буллезных дерматозах. При этом кадгериновый комплекс при аутоиммунной пузырчатке является непосредственно антигеном-мишенью для аутоантител. При аутоиммунных буллезных дерматозах с поражением дермо-эпидермального соединения кадгерины вовлекаются опосредованно с одновременной извращенной их экспрессией в зоне базальной мембраны эпидермиса. Последнее явление было выявлено в большинстве случаев (72,7 %) аутоиммунных буллезных дерматозов с поражением дермо-эпидермального соединения и в ряде случаев (26,1 %) различных форм аутоиммунной пузырчатки, включая паранеопластический генез. Следует отметить, что при буллезном пемфигоиде и приобретенном буллезном эпидермолизе в месте образования подэпидермального пузыря экспрессия кадгеринового комплекса выявлена как на покрышке пузыря, так и на его дне. Однако выраженная иммуногистохимическая реакция наблюдалась в месте локализации антигена-мишени. Вероятно, под действием патогенетических факторов происходит переключение экспрессии генов одних клеток на гены других (при подавлении одних и активации других). Кроме того, при аутоиммунной пузырчатке вопреки логическому мышлению обнаружено парадоксальное явление усиления экспрессии кадгеринового комплекса в местах формирования внутриэпидермального пузыря. Возможно, это связано с компенсаторным эффектом этих функционально близких молекул адгезии, т.е. исчезновение одних молекул и появление других [8]. Подобное явление наблюдали и другие авторы при различных буллезных дерматозах [7]. Для объяснения такого необычного явления выдвигают несколько гипотез. Одна из них заключается в ассоциации синтеза кадгеринов с нарушенной пролиферацией и дифференцировкой клеток [4, 7], другая - с нарушением концентрации кальция в кератиноцитах или мутацией генов, кодирующих кальциевые насосы, ответственные за акантолиз [7, 10].

Под влиянием различных факторов, в том числе аутоантител, происходит диссоциация интра- и экстрацеллюлярных доменов кадгеринов. При этом экстрацеллюлярные домены кадгеринов отрываются от поверхности клеток в ходе акантолиза, но цитоплазматический домен остается на мембране, сохраняя связь с цитоскелетом, скрепляемый катенином. В ходе иммуногистохимических исследований этот цитоплазматический/внутриклеточный домен кадгерина является вполне достаточным для связывания антител, результатом чего оказываются положительные реакции в нетипичной локализации.

Таким образом, данное исследование позволило установить не только вовлечение кадгеринового комплекса в иммунопатологический процесс при аутоиммунных буллезных дерматозах, но и выявить особенности его экспрессии при данных заболеваниях. Последнее можно использовать в качестве дополнительного диагностического маркера для дифференциальной диагностики аутоиммунных буллезных дерматозов, в частности буллезного пемфигоида и приобретенного буллезного эпидермолиза. Такая диагностика аутоиммунных буллезных дерматозов в ранние сроки заболевания позволяет провести адекватную терапию с уменьшением риска продолжения углубления патологического процесса у больных, страдающих аутоиммунным буллезным дерматозом.

Рецензенты:

Сускова В.С., д.м.н., профессор, зав. лабораторией иммунодиагностики и иммунокоррекции ФГУ «ФНЦТИО им. академика В.И. Шумакова» Минздравсоцразвития России, г. Москва;

Снарская Е.С., д.м.н., профессор кафедры кожных и венерических болезней факультета послевузовского профессионального образования врачей ГОУ ВПО «Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития РФ, г. Москва.

Работа поступила в редакцию 28.11.2011.

Библиографическая ссылка