Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Пруткина Е.В. 1 Цыбиков Н.Н. 1 Исакова Н.В. 1 Сепп А.В. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия», Чита

У 52 больных различными формами гриппа A/H1N1: неосложненным трахеобронхитом, пневмонией средней степени тяжести и тяжелой пневмонией, приведшей к развитию острого респираторного дистресс-синдрома, методом иммуноферментного анализа определяли содержание α-дефензинов, эластазы, миелопероксидазы, белка теплового шока 70 в плазме крови и в нейтрофилах. Показано, что при неосложненном гриппе в плазме крови уровень всех веществ нарастал. При пневмонии в плазме крови концентрация α-дефензинов, эластазы, миелопероксидазы увеличивалась, а HSP-70 оставался таким же, как при неосложненном гриппе. Кроме того, при развитии пневмонии в нейтрофилах, по сравнению со здоровыми, количество эластазы снижалось, а остальных веществ нарастало. При развитии острого респираторного дистресс-синдрома в плазме крови дополнительного прироста уровня медиаторов не происходило, а в нейтрофилах содержание эластазы уменьшалось, HSP-70 − не изменялось, дефензинов и миелопероксидазы − увеличивалось.

Статья в формате PDF

311 KB

медиаторы нейтрофилов

HSP-70

острый респираторный дистресс-синдром

грипп A/H1N1

1. Аверьянов А.В. Нейтрофильная эластаза и болезни органов дыхания / А.В. Аверьянов, А.Э. Поливанова // Пульмонология. – 2006. – №5. – С. 74–79.

2. Галкин А.А. Роль адгезии в активации нейтрофилов и цитотоксическом взаимодействии нейтрофилов с эндотелием / А.А. Галкин, В.С. Демидова // Успехи современной биологии. – 2011. – Т. 131, №1. – С. 62–78.

3. Катионные противомикробные пептиды как молекулярные факторы иммунитета / В.Н. Кокряков и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2006. – №2. – С. 98–105.

4. Маргулис Б.А. Двойная роль шаперонов в ответе клетки и всего организма на стресс / Б.А. Маргулис, И.В. Гужова // Цитология. – 2009. – Т.51, №3. – С. 219–228.

5. Острый респираторный дистресс-синдром: практическое руководство / под ред. Б.Р. Гельфанда, В.Л. Кассиля. – М.: Литтера, 2007. – 232 с.

6. Повреждение эндотелия у больных пневмонией во время эпидемии гриппа А(H1N1) и возможность ее коррекции [Электронный ресурс] / В.В. Горбунов и др. // Забайкальский медицинский вестник. – 2011. – №2. – С. 104-111. – Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv (дата обращения 13.12.2011).

7. Enhanced expression of 70-kilidalton heat shock protein limits cell division in a sepsis-induced model of acute respiratory distress syndrome / Z. Bromberg et al. // Crit. Care Med. – 2008. – Vol. 36(1). – P. 246–255.

8. Hoffman A. Circuitry of nuclear factor kB signaling / A. Hoffman, D. Baltimore // Immunological Rev. – 2006. – Vol. 210. – P. 171–186.

9. HSP-70 stimulates cytokine production through a CD14-dependant pathway, demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine / A. Asea et al. // Nat. Med. – 2000. – Vol.6. – P. 435–442.

10. Human defensins / J.J. Schneider et al. // J. Mol. Med. – 2005. – Vol. 83, №8. – P. 587–595.

11. Prodefensins are matrix proteins of specific granules in human neutrophils / F. Mikkel et al. // J. Leucos. Bilol. – 2005. – Vol. 78. – P. 785–793.

Одной из особенностей эпидемии гриппа A/H1N1 в 2009-2010 гг. был большой удельный вес поражения нижних дыхательных путей. В свою очередь, отличительной чертой вирусной пневмонии при пандемическом гриппе стало частое развитие острого респираторного дистресс-синдрома (ОРДС), в том числе у молодых пациентов, без выраженной сопутствующей патологии [6].

Несмотря на активное изучение ОРДС в последние годы, не решены многие вопросы этиологии и патогенеза синдрома, что приводит к разногласиям в классификации, трудностям в диагностике и лечении. Пневмонии различного генеза являются наиболее частой «прямой легочной» причиной развития ОРДС. Остается неясным, почему в одних случаях воздействие инфекционного агента ограничивается развитием пневмонии, в других - сопровождается повреждением альвеолярно-капиллярной мембраны [5]. Основным звеном развития ОРДС является выраженная адгезия нейтрофилов к эндотелию сосудов малого круга кровообращения, их аккумуляция в капиллярах и ткани легких на фоне развития синдрома системной воспалительной реакции. В то же время существуют наблюдения развития дистресс-синдрома и у больных с нейтропенией [5, 6].

В свою очередь, именно с адгезией связан феномен гиперактивации полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ), при которой происходит нерегулируемое высвобождение микробицидных соединений не в фагосому, а в экстраклеточное пространство. При этом мобилизуются как кислородзависимые бактерицидные системы нейтрофила, так и агрессивные медиаторы азурофильных гранул (эластаза, миелопероксидаза, катионные белки и др.) [2].

Особый интерес представляют катионные пептиды - дефензины (HNP-3) - ключевые молекулы врожденного иммунитета: они проявляют микробицидную активность против широкого спектра вирусов и бактерий. Кроме того, дефензины обладают рядом неоднозначных дополнительных эффектов: являются модуляторами воспаления, а также оказывают токсическое действие в отношении как трансформированных, так и неизмененных собственных клеток [3, 10].

В очаге воспаления различные клетки легких, ПМЯЛ и другие форменные элементы крови активируют аутопротективный стресс-ответ, значимым механизмом которого является накопление индуцибельного белка теплового шока HSP-70. Ранее HSP-70 считался типичным внутриклеточным протеином, однако в последнее время доказано его существование в экстрацелюллярной среде, где помимо своих протективных свойств он может стимулировать синтез провоспалительных цитокинов [4, 9].

Учитывая, что ПМЯЛ обладают неоднозначными эффектами, выяснить вклад этих клеток в развитие дистресс-синдрома может детальное изучение взаимоотношений их биологически активных веществ как основы повреждения легких. Во время прошедшей эпидемии гриппа A/H1N1 появилась уникальная возможность последовательно проследить взаимодействия медиаторов нейтрофилов на всех этапах развития процесса: от неосложненного гриппа к пневмонии, вплоть до ОРДС, что явилось целью нашей работы.

Материал и методы исследования

В исследование были включены 52 больных, находившихся на лечении в стационарах г. Читы во время эпидемии гриппа 2009-2010 гг., обоего пола, в возрасте от 19 до 40 лет. Работа проводилась с одобрения локального этического комитета, после получения информированного согласия пациентов. Диагноз гриппа A/H1N1 был верифицирован путем обнаружения вируса в назофарингиальных мазках (методом ПЦР) либо в случае нарастания в сыворотке крови титра антител к его антигенам. Для сравнения исследовались три группы: 1-я - больные гриппом тяжелого течения в форме трахеобронхита без осложнений (n = 16); 2-я - больные гриппом, осложненным внебольничной полисегментарной пневмонией средней степени тяжести (n = 20); 3-ю группу составили больные гриппом, осложненным тяжелой пневмонией, приведшей к развитию ОРДС I-II стадий (n = 16). ОРДС диагностировали в соответствии с критериями, рекомендованными Американо-Европейской Согласительной Конференцией, его стадии выделяли по методике J.F. Murray [5]. У 14 из 16 больных последней группы наступил летальный исход от нарастающей острой дыхательной недостаточности, у всех погибших диагноз был подтвержден морфологическим исследованием. По результатам аутопсий вирусная пневмония выявлялась у 75 % умерших, вирусно-бактериальная - у 24,5 %, наиболее частой причиной ко-инфекции был Staphylococcus aureus. В качестве контроля использовалась кровь доноров соответствующего возраста (n = 16).

Объектом исследования служила плазма крови, которая забиралась на 2-5 сутки болезни. У части здоровых и пациентов дополнительно определялось внутриклеточное содержание медиаторов. Для этого из крови испытуемых нейтрофильные гранулоциты выделялись на двойном градиенте плотности фиколл-верографина: 1,077/1,097 г/мл; чистота фракции составляла 92-94 %. Выделенные нейтрофилы разделяли на аликвоты по 10 ± 5 тысяч клеток в 0,2 мл физиологического раствора и путем замораживания-оттаивания из них получали лизаты, в которых определяли искомые вещества. Получение клеток и плазмы проводились параллельно из одних порций крови. Концентрации исследуемых веществ определяли методом иммуноферментного анализа фирменными наборами по протоколам производителей: HNP-3, эластазы и миелопероксидазы (МРО) - «Hycult biotech», Нидерланды; индуцибельного HSP-70 - «Assay Designs», США.

Статистическая обработка проведена с использованием пакета программ BIOSTAT. При сравнении групп использовался критерий Манна-Уитни, различия считали значимыми при р ≤ 0,05. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного (25-й и 75-й персентили) интервала - указан в скобках.

Результаты исследования и их обсуждение

На этапах развития воспалительного процесса, вызванного гриппозной инфекцией, динамика содержания медиаторов нейтрофилов в плазме крови отличалась: изменения HNP-3 имели не линейный характер, уровень эластазы и МРО нарастал (табл. 1). Развитие тяжелого несложненного гриппа сопровождалось более чем вдвое увеличением содержания в крови α-дефензинов (р = 0,000). При присоединении пневмонии концентрация HNP-3 уменьшалась (р = 0,045), но оставалась выше, чем у здоровых (р = 0,006). В случае развития ОРДС количество HNP-3 было таким же, как у пациентов с пневмонией (р = 0,85).

Концентрация нейтрофильной эластазы уже при неосложненном гриппе была почти вдвое выше, чем у здоровых лиц (р = 0,002), а при развитии пневмонии она увеличивалась в 4 раза (р = 0,000). При этом формирование на фоне тяжелой пневмонии ОРДС I-II стадий не сопровождалось дополнительным ростом уровня фермента (р = 0,81). Содержание МРО в плазме крови также увеличивалось в ряду: здоровые - больные неосложненным гриппом (р = 0,004) - пациенты с пневмонией (р = 0,01), при развитии ОРДС оно оставалось таким же, как и у больных пневмонией средней степени тяжести (р = 0,68). При этом степень прироста концентрации МРО была меньшей, чем эластазы: не превышала 50 % от содержания медиатора у здоровых. Уровень индуцибельного HSP-70 в крови больных был значительно выше (в 6-7 раз), чем у здоровых, но между собой группы по количеству протеина не различались.

Таблица 1

Концентрация медиаторов нейтрофилов и HSP-70 в плазме крови
на этапах развития заболевания (Ме (25-й 75-й))

Примечание:

р - значение различий по сравнению со здоровыми;

р1 - значение различий по сравнению с больными неосложненным гриппом;

р2 - значение различий по сравнению с больными пневмонией средней степени тяжести;

* - значимые различия.

Полученные результаты, на наш взгляд, свидетельствуют о следующих процессах. Как известно, нейтрофильные лейкоциты являются первым эшелоном защиты организма от инфекции, трансформированных и поврежденных клеток. Интенсивная адгезия и гиперактивация нейтрофилов приводит к активному высвобождению медиаторов во внеклеточное пространство [2], поэтому возможен зафиксированный нами рост их концентрации в системном кровотоке.

Учитывая отсутствие различий в концентрации медиаторов в плазме крови между пациентами с неосложненной пневмонией и больными ОРДС, возникло предположение о возможных различиях их внутриклеточного содержания. Для подтверждения гипотезы в этих группах параллельно с исследованием плазмы определялся уровень медиаторов в лизатах ПМЯЛ. Динамика внутриклеточных соотношений исследуемых веществ в процессе развития заболевания отличалась от таковой в плазме крови: концентрация HNP-3 и МРО увеличивалась; эластазы, напротив, резко снижалась. Продукция индуцибельного HSP-70 в нейтрофилах больных пневмонией, по сравнению со здоровыми, нарастала (р = 0,04), но при развитии ОРДС оставалась на уровне пациентов с неосложненной пневмонией (р = 0,90) (табл. 2).

Зарегистрированные нами изменения внутриклеточного содержания биологически активных веществ, вероятно, доказывают участие в развитии пневмонии и дистресс-синдрома следующих механизмов. Прежде всего, вызывает вопрос сама возможность повышения интрацелюлярной концентрации медиаторов в нейтрофильных гранулоцитах, так как они поступают в кровеносное русло предельно дифференцированными клетками. Известно, что азурофильные гранулы образуются первыми в процессе созревания ПМЯЛ, еще на стадии промиелоцита, но в ряде работ показано, что способность к синтезу дефензинов у зрелых нейтрофилов сохраняется [11]. В доступной нам литературе мы не обнаружили данных о синтезе МРО в сегментоядерном нейтрофиле, но зафиксированный прирост внутриклеточной концентрации этого фермента доказывает такую возможность. С другой стороны, при развитии системного воспалительного ответа описано усиление синтеза противомикробных пептидов в макрофагах посредством активации провоспалительными цитокинами транскрипционного фактора NF-кВ [5, 8]. NF-кВ универсален, он присутствует и в ПМЯЛ [11], поэтому схожий механизм активации синтетических процессов, вероятно, возможен и в них.

Таблица 2

Концентрация медиаторов в лизатах нейтрофилов (Ме (25-й; 75-й))

Примечания:

р - значение различий по сравнению со здоровыми;

р1 - значение различий по сравнению с больными пневмонией средней степени тяжести;

* - значимые различия.

При высокопатогенном гриппе A/H1N1 даже в случаях относительно локального процесса (неосложненный грипп в форме трахеобронхита) мы наблюдали повышение общего микробицидного потенциала плазмы крови: нарастал уровень всех исследуемых медиаторов, причем самым значительным было увеличение дефензинов (в 2,5 раза). Можно предположить, что при этой форме заболевания уничтожение вируса гриппа совершалось за счет синергического действия, в том числе исследуемых веществ [1-3]. Безусловно, при указанных процессах происходило воздействие медиаторов ПМЯЛ и на собственные структуры, но, учитывая, что у этих пациентов не было осложнений, оно уравновешивалось, в том числе активацией синтеза различными клетками индуцибельного HSP-70.

Легочная гемоциркуляция уникальна, так как здесь сосредоточен основной пул маргинальных нейтрофилов, и их эмиграция идет преимущественно из капилляров [2], что происходило при неосложненной пневмонии и в большей степени при ОРДС. Одним из механизмов повреждения ткани легких при пневмонии являлся дополнительный, по сравнению с неосложненным гриппом, прирост в плазме крови концентраций эластазы и МРО, причем последний фермент в нейтрофилах продолжал синтезироваться, увеличивая их «аутоагрессивные возможности». Резкое снижение внутриклеточной эластазы (почти в шесть раз) при одновременном самом выраженном росте ее концентрации в плазме, скорее всего, связано с активным выходом фермента из клеток. При развитии пневмонии уменьшение HNP-3 в плазме с параллельным ростом их внутриклеточного содержания, вероятно, запускало следующие звенья патогенеза. С одной стороны, уничтожение возбудителя нейтрофилами путем фагоцитоза, скорее всего, не страдало, но при такой динамике плазменной концентрации дефензинов ослабевал общий микробицидный потенциал, что приводило к активному размножению вируса. С другой стороны, действие HNP-3 не ограничивается только противомикробными свойствами. Дефензины являются мощными хемоаттрактантами для моноцитов, а также обеспечивают эффекторную фазу адаптивного иммунитета посредством рекрутирования Т-лимфоцитов [3, 10]. Эластаза и МРО, напротив, разрушая собственные структуры, фрагментируя при взаимодействии α₁-антитрипсин [1], увеличивают в очаге концентрацию низкомолекулярных пептидов, привлекающих сюда новые генерации ПМЯЛ. В итоге уменьшение содержания в крови HNP-3 на фоне прироста эластазы и МРО, возможно, приводило к нарушению смены клеточных субпопуляций в очаге воспаления легочной паренхимы, увеличению степени ее нейтрофильной инфильтрации. В свою очередь, причина уменьшения плазменной концентрации дефензинов с одновременным увеличением их внури нейтрофилов при развитии пневмонии не ясна и требует дальнейшего исследования.

Избыточная аккумуляция ПМЯЛ в легочных капиллярах и паренхиме приводит не только к уничтожению возбудителей инфекции, но и повреждению компонентов сурфактанта, базальной мембраны альвеол, эндотелиоцитов. Нарушение целостности альвеолярно-капиллярной мембраны на ранних этапах ОРДС происходило при отсутствии роста в крови концентрации медиаторов азурофильных гранул (их дополнительного увеличения не было). С другой стороны, «агрессивный потенциал» нейтрофилов продолжал повышаться (в большей степени за счет HNP-3), поэтому полностью исключить участие этого механизма в нарушении целостности аэрогематического барьера в последующем невозможно. Скорее всего, этот феномен объясняет случаи развития ОРДС при нормальном уровне лейкоцитов и даже нейтропении [5]. Вероятно, при инициации ОРДС возникал дефицит как локальных легочных, так и общих механизмов, защищающих от избыточной вторичной альтерации медиаторами нейтрофилов, что требует дополнительного изучения.

Отсутствие прироста уровня индуцибельного HSP-70 (как в крови, так и в ПМЯЛ) также вносило свой вклад в развитие дистресс-синдрома. На экспериментальной модели сепсис-индуцированного ОРДС показано: дополнительное введение животным HSP-70 приводит к уменьшению выработки провоспалительных цитокинов, препятствует активации ПМЯЛ и подавляет их миграцию в легочную ткань [7]. Наше наблюдение демонстрирует, что при развитии на фоне пневмонии дистресс-синдрома «желаемого» увеличения синтеза HSP-70 и его протективных эффектов не развивается.

Выводы

1. Развитие пневмонии и ОРДС I-II стадий на фоне гриппа A/H1N1 сопровождается ростом цитотоксических возможностей нейтрофилов за счет синтеза HNP-3 и МРО, причем при ОРДС эти процессы более выражены.

2. Одним из механизмов формирования пневмонии на фоне гриппа является уменьшение содержания в плазме крови HNP-3 при одновременном повышении нейтрофильной эластазы и МРО.

3. При развитии ОРДС в плазме крови концентрация медиаторов азурофильных гранул нейтрофилов остается такой же, как и при пневмонии средней степени тяжести.

4. При формировании ОРДС уровень индуцибельного HSP-70 и в плазме крови, и в нейтрофилах остается таким же, как и при среднетяжелой пневмонии.

Рецензенты:

Бишарова Г.И., д.м.н., профессор, директор Читинского филиала ГУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН», г. Чита;

Патеюк А.В. д.м.н., профессор кафедры основ медицины ФГБОУ ВПО «Забайкальский государственный университет», г. Чита.

Работа поступила в редакцию 27.12.2011.

Библиографическая ссылка