Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ШАЛФЕЯ КЛЕЙКОГО (SALVIA GLUTINOSA L.)

Карпеченко К.А. 1 Землянухина О.А. 1 Вепринцев В.Н. 1 Карпеченко Н.А. 1 Карпеченко И.Ю. 1 Кондратьева А.М. 1 Калаев В.Н. 2 Лепешкина Л.А. 2 Серикова В.И. 2
1 ФГУП «Научно-исследовательский институт лесной генетики и селекции», Воронеж
2 ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», Ботанический сад им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского государственного университета, Воронеж
Изучены особенности микроклонального размножения редкого вида региональной флоры шалфея клейкого (Salvia glutinosa L.). Подобраны условия для введения шалфея клейкого в стерильную пробирочную культуру in vitro. Определены тип первичного экспланта, способ стерилизации, солевой и гормональный состав сред. Отработана методика избавления вторичных эксплантов от остаточной эндогенной инфекции путем депонирования их в растворе антибиотика. Оптимизированы минеральный и гормональный состав сред для регенерации имеющихся меристем первичного экспланта, поддержания, мультипликации шалфея in vitro и индукции корнеобразования. Определены сроки, необходимые для прохождения всех этапов развития шалфея клейкого в культуре in vitro: от первичного экспланта до укорененного регенеранта в питательной среде. Полученные растения не витрифицированы, обладают хорошим ростом и развитием вегетативных органов, корней и пригодны для адаптации к почвенным условиям ботанического сада.
шалфей клейкий
введение in vitro
микроклональное размножение
культура тканей
корнеобразование
1. Бутова Г.П., Табацкая Т.М., Скробова Л.Л. Использование методов культуры ткани для размножения и генетического улучшения селекционного материала лесных древесных растений Центральный научно-исследовательский институт лесной генетики и селекции // Генетика и селекция в лесоводстве. – М., 1991. – С. 41–49.
2. Маевский П.Ф. Флора средней полосы европейской части России. – 10-е изд. – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2006. – 600 с.
3. Флора СССР. Т. XXI. Губоцветные (вторая часть) [под ред. В.Л. Комарова]. – М.-Л.: Изд-во Ботанического института академии наук СССР, 1954. – 366 с.
4. Lloyd G., McCown B. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia by use of shoot-tip culture // Proc. Int. Plant Prop. Soc. – 1981. – Vol. 30. – P. 421–437.
5. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. – 1962. – Vol. 15. – P. 473–497.

Шалфей клейкий (Salvia glutinosa L.) - лекарственное и декоративное растение семейства Губоцветные (Lamiaceae). Общий ареал вида охватывает Среднюю и Атлантическую Европу, Западное и Восточное Средиземноморье, Крым, Кавказ и Европейскую часть Средней полосы России [3]. В Центральном Черноземье указывается для Воронежской, Липецкой и Тамбовской областей. Это опушечно-лесной длиннокорневищный травянистый многолетник, 50-120 см высотой, мезофит, микотроф, эвтроф, светолюбивый, теневыносливый [2]. Цветет в августе-октябре. Размножается семенами. Шалфей клейкий содержит эфирное масло, имеющее зеленоватый цвет и обладающее сильным, напоминающим мускат, не очень приятным запахом [3].

В ботаническом саду им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета культивируется с 2003 года. Выращен из семян репродукции ботанического сада им. акад. О.В. Фомина Киевского госуниверситета. Шалфей клейкий представлен в коллекции «Систематикум флоры Центрального Черноземья» и экспозиции «Дубравы Центрального Черноземья», где редко дает самосев.

В культуре in vitro растения шалфея клейкого образуют многочисленные стебли до 150 см высотой. Внутри куста стебли обычно прямые, по краю - слабоветвящиеся, имеют железистое опушение. Ширина листьев 7,5-12,0 см. Длина соцветий от 13 до 40 см. Цветки в мутовках по 2-6, венчики длиной 3,0-3,5 см, желтые, с красноватым тонким узором на губах и точками с серповидно изогнутой верхней губой (рис. 1).

Рис. 1. Шалфей клейкий на экспозиции «Дубравы Центрального Черноземья» ботанического сада Воронежского госуниверситета

Шалфей клейкий является редким и охраняемым растением. Занесен в Красные книги Республики Башкортостан, Республики Татарстан, Калужской, Московской, Пензенской, Самарской, Саратовской, Тверской и Тульской областей [3]. Нарушение его местообитаний (вырубка лесов, рекреация, лесные пожары) ставит под угрозу существование устойчивых популяций этого вида в регионе. В ботаническом саду Воронежского госуниверситета разрабатываются методы его размножения, которые позволят получить посадочный материал для репатриации растений шалфея клейкого в природные фитоценозы.

Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей введения в культуру in vitro шалфея клейкого. Согласно источникам литературы клональное размножение шалфея клейкого ранее не проводилось.

Материалы и методы исследования

Для введения в стерильную пробирочную культуру in vitro использовали осенние побеги растений, культивируемых в ботаническом саду Воронежского госуниверситета. В качестве первичного экспланта был выбран стеблевой сегмент, содержащий пазушные почки, из которых после введения происходило развитие побегов (рис. 2). Стерилизацию проводили по следующей схеме: побег вводимого растения аккуратно мыли под проточной водой мягкой губкой с ПАВ содержащим моющим средством. Затем обрезали листья на половину длины черешка и нарезали побег на сегменты, удобные для дальнейшей отмывки [1]. Полученные таким образом участки стебля с междоузлиями помещали в стеклянную емкость, заливали водопроводной водой, добавляли каплю ПАВ содержащего моющего средства, накрывали марлей и качали на качалке 10 минут. После этого материал ставили под проточную воду, не снимая марли, на 20 минут. По истечении этого времени в емкость с побегами заливали дистиллированную воду и снова качали 10 минут. Следующие этапы проводили в стерильных условиях: материал подвергали обеззараживанию в стерилизующих растворах, после чего троекратно по 5 минут отмывали в стерильной дистиллированной воде на качалке.

Для обеззараживания первичных эксплантов поверхностную стерилизацию проводили тремя способами. В первом случае материал помещали на 25 минут в раствор гипохлорита натрия (коммерческий отбеливатель «Белизна») и стерильной дистиллированной воды в соотношении 1:3 соответственно. Второй способ отличается тем, что в растворе гипохлорита натрия той же концентрации, что и в предыдущем варианте, экспланты находились 20 минут, после чего их погружали в 70%-й спирт на 10 секунд. В третьем случае использовали 4% раствор гипохлорита натрия, содержащий 0,04%-й мертиолята и стерилизовали 20 минут.

 

Рис. 2. Побегообразование из пазушных почек на первичных эксплантах шалфея клейкого

После поверхностной стерилизации все экспланты помещали в пенициллиновые пузырьки на полную по макросолям среду Мурасиге и Скуга [5] с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП).

Для мультипликации образовавшиеся из пазушных почек регенеранты в ламинаре отделяли от первичного экспланта и помещали на половинную по макросолевому составу среду WPM с добавлением 0,2 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л гиббереловой кислоты (ГА3).

В некоторых случаях от эндогенной инфекции, проявившейся после отделения регенерантов от первичных эксплантов, удавалось избавиться обработкой их раствором бензилпенициллина натриевой соли (1000000 ед./500 мл воды: содержимое одного пузырька антибиотика в 500 мл стерильной дистиллированной воды) в течение 15 минут.

Результаты исследования и их обсуждение

В культуру in vitro шалфей клейкий вводили осенними побегами, срезанными с растений, культивируемых в условиях открытого грунта в ботаническом саду Воронежского государственного университета. Исходный материал для введения в стерильную культуру in vitro отличался высоким уровнем внешней и внутренней естественной инфекции. Возможно это связано с тем, что растения были срезаны в осенний период. Поэтому были опробованы три способа стерилизации. Наблюдения показали, что стерилизующий раствор с 4%-м гипохлоритом натрия и мертиолятом малоэффективен, так как все вводимые побеги в довольно короткий срок (5-6 суток) пропали от развития внутренней бактериальной инфекции. Экспланты, введенные с использованием метода стерилизации гипохлорит натрия со спиртом, выглядели лучше всего, но в базальной части также была инфекция. Метод стерилизации с использованием только гипохлорита натрия в большой концентрации дольше всего не давал проявляться колониям бактерий, что позволило получить регенеранты из пазух листьев и отделить их от первичных эксплантов (рис. 3).

Рис. 3. Регенеранты, отделенные от первичного экспланта шалфея клейкого

Таким образом, типом первичного экспланта был выбран стеблевой сегмент, содержащий почку и около сантиметра стебля вверх и вниз от почки. Вводимые экспланты помещали в вертикальном положении на полную по солевому составу среду WPM с добавлением 1 мг/л 6-БАП. На этой среде из пазушных почек быстро начинали развиваться побеги - регенеранты, поэтому она оптимальна для развития уже имеющихся меристем. Отметим, что долгое содержание на гормональной среде как первичных эксплантов, так и полученных из них регенерантов не целесообразно. При длительном культивировании растения становятся витрифицированными (обводненными) и могут потерять способность к размножению и корнеобразованию, а впоследствии погибнуть. В результате от пятнадцати первичных эксплантов было получено всего три регенеранта, вследствие чего оказалось актуально увеличение их количества с помощью микрочеренкования. Отделенные побеги помещали в пенициллиновые пузырьки со средой WPM половинной по макросолевому составу (1/2 WPM) с добавлением 0,2 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ГА3, поскольку она подходит для мультипликации и вытягивания образующихся адвентивных побегов. Для избавления их от эндогенной инфекции, проявившейся после отделения регенерантов, качали на качалке в растворе бензилпенициллина и пересаживали на свежую среду того же состава.

Депонирование in vitro проводили с периодическими пересадками на свежую среду, чтобы избежать высыхания и изменения состава среды вследствие жизнедеятельности растений [4].

Следующей после размножения стояла задача корнеобразования. При регулярной пересадке эксплантов на свежую среду корни образовывались в базальной части либо из небольшого каллуса, либо непосредственно на месте среза (рис. 4). Укоренение in vitro наблюдалось не ранее, чем через месяц поддержания стерильной культуры.

Рис. 4. Корнеобразование у шалфея клейкого в культуре in vitro

Полученные укорененные in vitro растения шалфея клейкого пригодны для переведения в условия in vivo. Сначала они должны пройти период адаптации к почвенным условиям в закрытом грунте, после чего смогут расти в открытом грунте. К преимуществам такого способа размножения можно отнести возможность размножения круглый год, поддержание и сохранение в виде растущей культуры в трудные периоды, простоту передачи и обмена растениями между лабораториями и конечными получателями продукции, возможность быстрого и масштабного тиражирования культур, получение чистого безвирусного исходного растительного материала для дальнейших интродукционных работ.

Заключение

В результате проведенного нами исследования был разработан метод микроклонального размножения редкого вида региональной флоры - шалфея клейкого. В процессе работы был подобран режим стерилизации, оптимизирован солевой и гормональный состав питательных сред для депонирования, мультипликации и корнеобразования эксплантов шалфея клейкого. Получены укоренившиеся в культуре in vitro растения, пригодные для адаптации к эдафическим условиям.

Работа выполнена в рамках и при поддержке государственного контракта на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» № 16.518.11.7099.

Рецензенты:

  • Свистова И.Д., д.б.н., профессор кафедры биологии растений и животных естественно-географического факультета ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет», г. Воронеж;
  • Мелькумова Е.А., д.б.н., профессор кафедры ботаники, защиты растений, биохимии, микробиологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I», г. Воронеж.

Работа поступила в редакцию 06.04.2012.


Библиографическая ссылка

Карпеченко К.А., Землянухина О.А., Вепринцев В.Н., Карпеченко Н.А., Карпеченко И.Ю., Кондратьева А.М., Калаев В.Н., Лепешкина Л.А., Серикова В.И. ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ШАЛФЕЯ КЛЕЙКОГО (SALVIA GLUTINOSA L.) // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 5-1. – С. 158-162;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29866 (дата обращения: 23.10.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074