Шалфей клейкий (Salvia glutinosa L.) - лекарственное и декоративное растение семейства Губоцветные (Lamiaceae). Общий ареал вида охватывает Среднюю и Атлантическую Европу, Западное и Восточное Средиземноморье, Крым, Кавказ и Европейскую часть Средней полосы России [3]. В Центральном Черноземье указывается для Воронежской, Липецкой и Тамбовской областей. Это опушечно-лесной длиннокорневищный травянистый многолетник, 50-120 см высотой, мезофит, микотроф, эвтроф, светолюбивый, теневыносливый [2]. Цветет в августе-октябре. Размножается семенами. Шалфей клейкий содержит эфирное масло, имеющее зеленоватый цвет и обладающее сильным, напоминающим мускат, не очень приятным запахом [3].
В ботаническом саду им. проф. Б.М. Козо-Полянского Воронежского госуниверситета культивируется с 2003 года. Выращен из семян репродукции ботанического сада им. акад. О.В. Фомина Киевского госуниверситета. Шалфей клейкий представлен в коллекции «Систематикум флоры Центрального Черноземья» и экспозиции «Дубравы Центрального Черноземья», где редко дает самосев.
В культуре in vitro растения шалфея клейкого образуют многочисленные стебли до 150 см высотой. Внутри куста стебли обычно прямые, по краю - слабоветвящиеся, имеют железистое опушение. Ширина листьев 7,5-12,0 см. Длина соцветий от 13 до 40 см. Цветки в мутовках по 2-6, венчики длиной 3,0-3,5 см, желтые, с красноватым тонким узором на губах и точками с серповидно изогнутой верхней губой (рис. 1).
Рис. 1. Шалфей клейкий на экспозиции «Дубравы Центрального Черноземья» ботанического сада Воронежского госуниверситета
Шалфей клейкий является редким и охраняемым растением. Занесен в Красные книги Республики Башкортостан, Республики Татарстан, Калужской, Московской, Пензенской, Самарской, Саратовской, Тверской и Тульской областей [3]. Нарушение его местообитаний (вырубка лесов, рекреация, лесные пожары) ставит под угрозу существование устойчивых популяций этого вида в регионе. В ботаническом саду Воронежского госуниверситета разрабатываются методы его размножения, которые позволят получить посадочный материал для репатриации растений шалфея клейкого в природные фитоценозы.
Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей введения в культуру in vitro шалфея клейкого. Согласно источникам литературы клональное размножение шалфея клейкого ранее не проводилось.
Материалы и методы исследования
Для введения в стерильную пробирочную культуру in vitro использовали осенние побеги растений, культивируемых в ботаническом саду Воронежского госуниверситета. В качестве первичного экспланта был выбран стеблевой сегмент, содержащий пазушные почки, из которых после введения происходило развитие побегов (рис. 2). Стерилизацию проводили по следующей схеме: побег вводимого растения аккуратно мыли под проточной водой мягкой губкой с ПАВ содержащим моющим средством. Затем обрезали листья на половину длины черешка и нарезали побег на сегменты, удобные для дальнейшей отмывки [1]. Полученные таким образом участки стебля с междоузлиями помещали в стеклянную емкость, заливали водопроводной водой, добавляли каплю ПАВ содержащего моющего средства, накрывали марлей и качали на качалке 10 минут. После этого материал ставили под проточную воду, не снимая марли, на 20 минут. По истечении этого времени в емкость с побегами заливали дистиллированную воду и снова качали 10 минут. Следующие этапы проводили в стерильных условиях: материал подвергали обеззараживанию в стерилизующих растворах, после чего троекратно по 5 минут отмывали в стерильной дистиллированной воде на качалке.
Для обеззараживания первичных эксплантов поверхностную стерилизацию проводили тремя способами. В первом случае материал помещали на 25 минут в раствор гипохлорита натрия (коммерческий отбеливатель «Белизна») и стерильной дистиллированной воды в соотношении 1:3 соответственно. Второй способ отличается тем, что в растворе гипохлорита натрия той же концентрации, что и в предыдущем варианте, экспланты находились 20 минут, после чего их погружали в 70%-й спирт на 10 секунд. В третьем случае использовали 4% раствор гипохлорита натрия, содержащий 0,04%-й мертиолята и стерилизовали 20 минут.
Рис. 2. Побегообразование из пазушных почек на первичных эксплантах шалфея клейкого
После поверхностной стерилизации все экспланты помещали в пенициллиновые пузырьки на полную по макросолям среду Мурасиге и Скуга [5] с добавлением 1 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП).
Для мультипликации образовавшиеся из пазушных почек регенеранты в ламинаре отделяли от первичного экспланта и помещали на половинную по макросолевому составу среду WPM с добавлением 0,2 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л гиббереловой кислоты (ГА3).
В некоторых случаях от эндогенной инфекции, проявившейся после отделения регенерантов от первичных эксплантов, удавалось избавиться обработкой их раствором бензилпенициллина натриевой соли (1000000 ед./500 мл воды: содержимое одного пузырька антибиотика в 500 мл стерильной дистиллированной воды) в течение 15 минут.
Результаты исследования и их обсуждение
В культуру in vitro шалфей клейкий вводили осенними побегами, срезанными с растений, культивируемых в условиях открытого грунта в ботаническом саду Воронежского государственного университета. Исходный материал для введения в стерильную культуру in vitro отличался высоким уровнем внешней и внутренней естественной инфекции. Возможно это связано с тем, что растения были срезаны в осенний период. Поэтому были опробованы три способа стерилизации. Наблюдения показали, что стерилизующий раствор с 4%-м гипохлоритом натрия и мертиолятом малоэффективен, так как все вводимые побеги в довольно короткий срок (5-6 суток) пропали от развития внутренней бактериальной инфекции. Экспланты, введенные с использованием метода стерилизации гипохлорит натрия со спиртом, выглядели лучше всего, но в базальной части также была инфекция. Метод стерилизации с использованием только гипохлорита натрия в большой концентрации дольше всего не давал проявляться колониям бактерий, что позволило получить регенеранты из пазух листьев и отделить их от первичных эксплантов (рис. 3).
Рис. 3. Регенеранты, отделенные от первичного экспланта шалфея клейкого
Таким образом, типом первичного экспланта был выбран стеблевой сегмент, содержащий почку и около сантиметра стебля вверх и вниз от почки. Вводимые экспланты помещали в вертикальном положении на полную по солевому составу среду WPM с добавлением 1 мг/л 6-БАП. На этой среде из пазушных почек быстро начинали развиваться побеги - регенеранты, поэтому она оптимальна для развития уже имеющихся меристем. Отметим, что долгое содержание на гормональной среде как первичных эксплантов, так и полученных из них регенерантов не целесообразно. При длительном культивировании растения становятся витрифицированными (обводненными) и могут потерять способность к размножению и корнеобразованию, а впоследствии погибнуть. В результате от пятнадцати первичных эксплантов было получено всего три регенеранта, вследствие чего оказалось актуально увеличение их количества с помощью микрочеренкования. Отделенные побеги помещали в пенициллиновые пузырьки со средой WPM половинной по макросолевому составу (1/2 WPM) с добавлением 0,2 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ГА3, поскольку она подходит для мультипликации и вытягивания образующихся адвентивных побегов. Для избавления их от эндогенной инфекции, проявившейся после отделения регенерантов, качали на качалке в растворе бензилпенициллина и пересаживали на свежую среду того же состава.
Депонирование in vitro проводили с периодическими пересадками на свежую среду, чтобы избежать высыхания и изменения состава среды вследствие жизнедеятельности растений [4].
Следующей после размножения стояла задача корнеобразования. При регулярной пересадке эксплантов на свежую среду корни образовывались в базальной части либо из небольшого каллуса, либо непосредственно на месте среза (рис. 4). Укоренение in vitro наблюдалось не ранее, чем через месяц поддержания стерильной культуры.
Рис. 4. Корнеобразование у шалфея клейкого в культуре in vitro
Полученные укорененные in vitro растения шалфея клейкого пригодны для переведения в условия in vivo. Сначала они должны пройти период адаптации к почвенным условиям в закрытом грунте, после чего смогут расти в открытом грунте. К преимуществам такого способа размножения можно отнести возможность размножения круглый год, поддержание и сохранение в виде растущей культуры в трудные периоды, простоту передачи и обмена растениями между лабораториями и конечными получателями продукции, возможность быстрого и масштабного тиражирования культур, получение чистого безвирусного исходного растительного материала для дальнейших интродукционных работ.
Заключение
В результате проведенного нами исследования был разработан метод микроклонального размножения редкого вида региональной флоры - шалфея клейкого. В процессе работы был подобран режим стерилизации, оптимизирован солевой и гормональный состав питательных сред для депонирования, мультипликации и корнеобразования эксплантов шалфея клейкого. Получены укоренившиеся в культуре in vitro растения, пригодные для адаптации к эдафическим условиям.
Работа выполнена в рамках и при поддержке государственного контракта на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» № 16.518.11.7099.
Рецензенты:
-
Свистова И.Д., д.б.н., профессор кафедры биологии растений и животных естественно-географического факультета ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет», г. Воронеж;
- Мелькумова Е.А., д.б.н., профессор кафедры ботаники, защиты растений, биохимии, микробиологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет имени императора Петра I», г. Воронеж.
Работа поступила в редакцию 06.04.2012.
Библиографическая ссылка
Карпеченко К.А., Землянухина О.А., Вепринцев В.Н., Карпеченко Н.А., Карпеченко И.Ю., Кондратьева А.М., Калаев В.Н., Лепешкина Л.А., Серикова В.И. ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ШАЛФЕЯ КЛЕЙКОГО (SALVIA GLUTINOSA L.) // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 5-1. – С. 158-162;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29866 (дата обращения: 18.04.2024).