Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,441

ЗАВИСИМОСТЬ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ НОВОГО ФОТОАКТИВИРУЕМОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО КРАСИТЕЛЯ ОТ ПАРАМЕТРОВ СРЕДЫ

Шапошников М.Н. 1 Чудаков Д.Б. 1 Генералов А.А. 1 Савина А.А. 1 Зайцев С.Ю. 1
1 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»
В работе представлены исследования зависимости спектральных свойств нового фотоактивируемого флуоресцентного красителя (ФФК-813) от параметров среды (вязкости и pH) а также выявление концентрационного тушения флуоресценции. Показано, что имеется степенная зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости, соответствующая уравнению Фёрстера-Гофмана; например в растворах глицерин-вода при увеличении вязкости в 1000 раз интенсивность флуоресценции возрастает в 2,5 раза. рН также оказывает влияние на спектральные свойства красителя, особенно на интенсивность его флуоресценции, которая в 1,5-2 раза больше у катионной формы по сравнению с цвиттерионной. Явление концентрационного тушения наблюдалось уже при концентрациях от 6,310-5 М (30 мкг/мл), это даёт возможность оценить значения оптимальных концентраций для окрашивания биологических объектов изучаемым красителем. Используя концентрацию красителя 5 мкг/мл (1,0610-5 М) получена микрофотография монослоя клеток А431, на которой интенсивность флуоресценции между визуально яркими и темными внутриклеточными структурами отличалась в среднем в 5 – 10 раз. Неодинаковую яркость разных субклеточных органелл при окрашивании клетки можно объяснить не только различной селективностью связывания красителя, но и с помощью неоднородности параметров внутриклеточной среды.
флуоресцентные красители
фотоактивация
вязкость
pH
тушение флуоресценции
окрашивание клеток
флуоресцентная микроскопия
1. Красовицкий Б.М. Органические люминофоры / Б.М. Красовицкий, Б.М. Болотин; под ред. Б.М. Красовицкого. - М.; Химия, 1984. - С. 262-266.
2. Сетлоу Р. Молекулярная биофизика / Р. Сетлоу, Э. Поллард; под ред. Д.А. Франк-Каменецкого. - М.: Мир, 1964. - С. 140-141.
3. Новые флуоресцентные красители для окрашивания клеток животных / М.Н. Шапошников, Е.В. Свирщевская, А.А. Генералов, С.Ю. Зайцев // Современная ветеринарная медицина. - М., 2011. - №1. - С. 24-25.
4. Akers W. A molecular rotor as viscosity sensor in aqueous colloid solutions / W. Akers, M.A. Haidekker // Journal of Biomechanical Engineering. - 2004. - Vol. 126. - P. 340-345.
5. Belov V. N. Rhodamines NN: a novel class of caged fluorescent dyes / V.N. Belov, C.A., Wurm V.P. Boyarskiy // Angew. Chem. Int. Ed. - 2010. - V. 49. - P. 3520-3523.
6. Lord S.J. Photophysical Properties of Acene DCDHF Fluorophores: Long-Wavelength Single-Molecule Emitters Designed for Cellular Imaging / S.J. Lord, L. Zhikuan, H. Wang, K.A. Willets, P. J. Schuck, H.D. Lee, S.Y. Nishimura, R.J. Twieg, W.E. Moerner // J. Phys. Chem. - 2007. - Vol. 111. - Р. 8934-8941.
7. Penzkofer A. Fluorescence quenching of rhodamine 6G in methanol at high concentration / A. Penzkofer, Y. Lu // Chemical Physics. - 1986. - Vol 103. - P. 399-405.
8. The photophysics of rhodamine B / M.J. Snare, F.E. Treloar, K.P. Ghiggino, P.J. Thistlethwaite // Journal of Photochemistry. - 1982. -Vol 18. - P. 335-346.

Создание и исследование ФФК является важным и актуальным направлением на пересечении ряда областей биохимии, физико-химической биологии и биотехнологии [1, 3, 4, 6, 8].

Для многих флуорофоров (молекулярных роторов) характерна сильная зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости. Для её описания обычно используют уравнение Фёрстера-Гофмана [4, 6]:

lgI = x×lg η + C, (1)

где I - интенсивность флуоресценции; х - константа, меньше либо равная единице; η - вязкость; С - постоянная. Из уравнения, зная интенсивность флуоресценции, находят вязкость после калибровки параметров флуорофора по разным вязкостям в системе, где его планируют использовать.

Спектральные свойства красителей родаминового ряда также зависят от вязкости (хотя молекулярными роторами они не являются) и рН [8]. Фотоактивируемые флуо­ресцентные красители родаминового ряда в этом плане интересны потому, что, облучая окрашенные клетки узким лазерным пучком длиной волны около 400 нм, можно активировать строго ограниченное число молекул ФФК, переведя их во флуоресцентную форму лишь в ограниченном объёме клетки [3]. Данные по влиянию вязкости и рН на флуоресценцию этих красителей можно будет использовать для исследования параметров внутриклеточной среды в различных клеточных структурах [1, 6], что имеет немалое значение для изучения биохимических процессов [2].

Для родаминовых красителей характерно явление концентрационного тушения [7]. Для практического применения красителей важно знать, при каких концентрациях оно начинает оказывать заметное влияние на спектральные свойства.

Целью данной работы являлось изучение влияние параметров микроокружения и концентрационного тушения на спект­ральные свойства ФФК-813 (его открытой формы, называемой Род-813).

Материалы и методы исследования

Исследуемый краситель (ФФК-813) синтезирован Беловым В.Н. в Макс-Планк Институте биофизической химии (ФРГ), как описано ранее [5].

Для исследования ФФК-813 был растворён в ДМФА до концентрации 10 мг/мл. Далее разбавляли водой до концентрации 200 мкг/мл и подвергали фотоактивации в стандартной кювете для снятия спектра из набора Spectra Suite действием ртутной лампы (100 Вт), помещаемой на расстоянии 3 см от кюветы на 5 минут. Данной операцией переводили краситель из нефлуоресцентной во флуоресцентную форму, как показано на рис. 1, а, и получали маточный раствор:

Рис. 1. а - структурные формулы ФФК-813 и флуоресцентного красителя Род-813, схема фотореакции;
б - протонирование и депротонирование Род-813; в ̶ структурные формулы родамина В и родамина 6Ж

Для получения спектров Род-813 при рН = 3, 7 и 11 использовали маточный раствор Род-813, дистиллированную воду и 0,01 Н растворы KOH и HCl.

Для исследования зависимости спектральных свойств от вязкости были приготовлены по 975 мкл растворов глицерина в воде в различных концентрациях, к которым добавляли 25 мкл маточного раствора.

Для исследования концентрационного тушения были измерены спектральные свойства Род-813 в растворах убывающих концентраций, приготовленных из маточного путём последовательно повторяемого разбавления его дистиллированной водой.

Для каждого случая были измерены как спектр поглощения, так и флуоресценции на спектрометре «Ocean Optics USB 4000-FL». Измерения проводились в стандартных пластиковых кюветах. Спектр поглощения измеряли с помощью источника света Ocean «Optics PX-2», излучающего в диапазоне 220-750 нм, свет от которого наводился на кювету при помощи оптоволоконного кабеля P400-1-SR; для возбуждения флуоресценции применяли светодиод с длиной волны света 514 нм, который устанавливали в кюветодержатель прибора в неподвижном положении.

Все спектры получены в сравнении с контролями, в качестве которых служили дистиллированная вода или растворы глицерина соответствующей концентрации. В экспериментах по концентрационному тушению для каждой концентрации снимали по 5 спектров поглощения и флуоресценции, в этом случае данные были обработаны путём подсчёта доверительных интервалов по методике Стьюдента.

Для окрашивания монослоя линии клеток А 431 (эпидермоидная карцинома человека) краситель сначала растворяли в ДМФА, а затем разводили в воде до концентрации 200 мкг/мл, также как для спектральных измерений. Раствор красителя добавляли в ячейку планшета с предварительно выращенным на покровном стекле монослоем клеток до конечной концентрации раствора 5 мкг/мл. Клетки инкубировали с красителем 30 мин в СО2-инкубаторе, затем дважды отмывали свежей средой культивирования. Покровное стекло вынули из ячейки, положили на предметное стекло клетками между стекол и немедленно микроскопировали. Данный препарат необходимо быстро исследовать, до того как испарится питательная среда между стекол. На лазерном конфокальном инвертированном микроскопе «Nikon Eclipse TE2000», используя лазеры 405 (для фотоактивации) и 543 нм, микроскопировали полученный клеточный препарат.

Результаты исследования и их обсуждение

Влияние рН. Спектры поглощения и флуоресценции растворов Род-813 концентрацией 5 мкг/мл при рН = 3, 7 и 11 изображены на рис. 2. При рН = 3 интенсивность поглощения и флуоресценции была больше, чем при рН = 7 и 11, причём прирост интенсивности флуоресценции при рН = 3 по сравнению с нейтральной и щелочной средой был больше, чем прирост поглощения, что указывает на больший квантовый выход Род-813 при кислом рН. При рН = 3 длина волны максимума поглощения была явно меньше (549 нм), чем при рН = 7 и 11 (554 и 553 нм). Разница между значениями длин волн максимума абсорбции при рН = 7 и 11 и между значениями длин волн максимумов флуоресценции для всех рН (значения максимумов находились в интервале 575-576 нм) сопоставима с приборной погрешностью (около 1 нм) и не является достоверной. Согласно структурной формуле Род-813, это соединение должно находиться при рН = 3 в катионной форме, а при рН = 11 - в цвиттерионной (рис. 1, б). Исходя из полученных данных, спектр цвиттериона смещён батохромно, что противоречит данным работы [8] для родамина В (формула на рис. 1, в). Но родамин В, в отличие от Род-813, имеет карбоксильную группу при сопряжённой системе (а у Род-813 она отделена от сопряжённой системы метиленовой группой), и, значит, протонирование-депротонирование данной группы Род-813 не окажет такое же влияние на спектральные свойства, какое оказывала в родамине В. В случае точечного детектирования флуоресценции в живых клетках этот эффект необходимо учитывать. Уменьшение внутриклеточного рН увеличивает интенсивность флуоресценции в клеточных препаратах.

Рис. 2. Спектр поглощения (1а) и флуоресценции (1б) при рН = 3; поглощения (2а) и флуоресценции (2б) при рН = 7; поглощения (3а) и флуоресценции (3б) при рН = 11

Концентрационное тушение. График на рис. 3 и данные, представленные в таблице, свидетельствуют в пользу того, что, как и родамину 6Ж (формула на рис. 1, в) [7], исследованному нами красителю присуще явление концентрационного тушения.

 

Рис. 3. Зависимость интенсивности флуоресценции ФФК-813 от его концентрации в дистиллированной воде

Линейная зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации для Род-813 наблюдается вплоть до значений около (3 - 5)·10-5 М (14-25 мкг/мл), далее рост замедляется; наибольшая интенсивность флуоресценции наблюдается при концентрациях около 6,3·10-5 М (30 мкг/мл). Далее она резко падает (рис. 3). Примерно до этих же концентраций наблюдается прямая пропорциональность между концентрацией и оптической плотностью, а далее наблюдается отклонение от закона Бугера-Ламберта-Бэра, что свидетельствует об образовании ассоциатов, ответственных за эффект концентрационного тушения [7]. Начиная с концентрации 10-4 М (47 мкг/мл) максимум спектра флуоресценции сдвигается батохромно и в исследованном диапазоне концентраций доходит далее до 625 нм, что объясняется перекрыванием π-электронных облаков молекул, сопровождающемся увеличением степени делокализации электронов, а в сопряжённых системах это всегда приводит к батохромному сдвигу максимума флуоресценции. Труднее объяснить гипсохромный сдвиг спектра поглощения. Возможно, он вызван тем, что в ассоциатах может быть затруднён перенос зарядов от элетронодонорной к электроноакцепторной группе, часто сопровождающий процесс возбуждения [4, 6], что может приводить к затруднённости самого процесса возбуждения, необходимости большей энергии поглощаемого кванта для него. Ясно, что при окрашивании красителем ФФК-813 живых клеток нецелесообразно использовать количества красителя, создающие его конечную концентрацию в окрашиваемом материале более чем 6,3·10-5 М (25-30 мкг/мл).

Спектральные свойства Род-813 при разных концентрациях красителя

Концентрация ФФК, моль/л (мкг/мл)

Измеренная оптическая плотность

Длина волны максимума поглощения, нм

Интенсивность флуоресценции, отн. ед.×10-3

Длина волны максимума флуоресценции, нм

3,985×10-6 (1,9)

0,127 ± 0,004

551,6 ± 0,5

24,3 ± 1,1

574,7 ± 0,0

6,315×10-6 (3,0)

0,154 ± 0,008

552,1 ± 0,3

28,8 ± 1,5

574,7 ± 0,0

1×10-5 (4,7)

0,199 ± 0,006

551,83 ± 0,18

36,1 ± 0,9

574,7 ± 0,0

1,586×10-5 (7,5)

0,274 ± 0,003

551,71 ± 0,14

46,0 ± 1,0

575,5 ± 0,0

2,514×10-5 (12)

0,398 ± 0,002

551,8 ± 0,5

58,7 ± 1,2

575,8 ± 0,0

3,983×10-5 (19)

0,606 ± 0,003

551,8 ± 0,2

72 ± 2

577,1 ± 0,0

6,313×10-5 (30)

0,921 ± 0,006

552,07 ± 0,12

79 ± 2

578,5 ± 0,0

1×10-4 (47)

1,46 ± 0,10

552,4 ± 1,0

76 ± 2

580,5 ± 0,0

1,586×10-4 (75)

1,622 ± 0,005

544,0 ± 0,8

53,1 ± 1,9

584,1 ± 0,0

2,514×10-4 (118)

1,78 ± 0,08

530,5 ± 1,1

30 ± 3

602 ± 4

3,983×10-4 (187)

1,83 ± 0,22

530,5 ± 1,2

19 ± 4

622 ± 3

4,474×10-4 (200)

Нет данных

Нет данных

13 ± 1,9

624,8 ± 0,3

Влияние вязкости. Влияние вязкости на интенсивность флуоресценции определяли в растворах глицерина разной концентрации. Поскольку коэффициент экстинкции красителя от вязкости не зависит, но фактически оптическая плотность в этих растворах менялась из-за разной растворимости соединения, то учитывалась эффективная интенсивность, рассчитанная как

где Ifl - приборная интенсивность флуоресценции; D - измеренное поглощение; Dnom - номинальное поглощение, наблюдавшееся в воде.

 

Рис. 4. Зависимость логарифма интенсивности флуоресценции ФФК-813 от вязкости водных растворов с разной концентрацией

Согласно уравнению (1) зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости должна иметь вид прямой в логарифмических координатах, что и видно из рис. 4. При этом тангенс наклона полученной прямой, то есть постоянная «х», равная 0,141. Константа С = 4,179. Не очень большая величина х говорит об умеренной зависимости интенсивности флуоресценции от вязкости. При увеличении вязкости в 1000 раз интенсивность флуоресценции возрастает в 2,5 раза. Окрашенные клетки линии А 431 представлены на микрофотографии с горизонтальной линией, по которой построен профиль интенсивности флуоресценции (рис. 5). Взяв из полученного спектра значения максимумов интенсивности флуоресценции и разделив на минимум, получаем в среднем от 5 до 10, т.е. во столько раз интенсивность флуоресценции ярких частей клеток отличаются от темных. Из вышеописанных экспериментов следует, что такая разница связана не только с селективностью окрашивания красителя определённых структур, но и с различными свойствами микроокружения (вязкости, рН).

 

Рис. 5. Микрофотография монослоя живых клеток A 431 окрашенных ФФК-813 концентрацией 5 мкг/мл (1,06×10-5М), после фотоактивации (размер кадра 36 на 36 мкм, сверху) и соответственно спектр интенсивности флуоресценции по горизонтальной линии (внизу)

Выводы

рН среды влияет на интенсивность флуоресценции Род-813, которая в 1,5-2 раза больше у катионной формы по сравнению с цвиттерионной. Зависимость интенсивности флуоресценции от вязкости подчиняется уравнению Фёрстера-Гофмана, при увеличении вязкости в 1000 раз интенсивность флуоресценции возрастает в 2,5 раза.

Для красителя характерно концентрационное тушение с образованием малофлуоресцирующих ассоциатов, начиная с концентраций от 6,3×10-5 М (30 мкг/мл), что необходимо учитывать при его практическом использовании для окрашивания клеток.

В разных участках живых клеток, окрашенных с помощью ФФК-813, интенсивность флуоресценции отличается между визуально яркими и темными внутриклеточными структурами в среднем от 5 до 10 раз, что обусловлено не только различной селективностью связывания красителя, но и неоднородностью параметров внутриклеточной среды.

Рецензенты:

  • Белопухов С.Л., д.с.-х.н., к.х.н., профессор, заведующий кафедрой физической и коллоидной химии, Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, ФГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева», г. Москва;
  • Клопов М.И., д.б.н., профессор кафедры химии, Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, ГБОУ ВПО «Российский государственный аграрный заочный университет», г. Балашиха.

Работа поступила в редакцию 23.07.2012.


Библиографическая ссылка

Шапошников М.Н., Чудаков Д.Б., Генералов А.А., Савина А.А., Зайцев С.Ю. ЗАВИСИМОСТЬ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ НОВОГО ФОТОАКТИВИРУЕМОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО КРАСИТЕЛЯ ОТ ПАРАМЕТРОВ СРЕДЫ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 9-2. – С. 322-327;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30222 (дата обращения: 13.04.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074