Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ХАРАКТЕРИСТИКА ШИК-ПОЗИТИВНОГО МАТЕРИАЛА В КЛЕТКАХ НЕЙТРОФИЛОЦИТАРНОГО ПУЛА КОСТНОГО МОЗГА У ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ

Невзорова Н.В. 1 Брюхин Г.В. 1
1 ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития России», Челябинск
Проведён анализ влияния патологии печени матери различной этиологии на становление способности к накоплению питательного субстрата клетками нейтрофилоцитарного ростка красного костного мозга потомства. Объектом экспериментального исследования были выбраны самки крыс «Вистар», у которых по общепринятым методикам моделировалось поражение печени, по своим морфологическим, биохимическим и физиологических характеристикам аналогичное гепатитам А и В, а также их потомство первого поколения. В ходе работы исследовалось содержание накапливающих гликоген нейтрофильных предшественников разной степени зрелости у интактных и подопытных животных. Было выявлено снижение доли содержащих гликоген клеток нейтрофилоцитарного ряда у потомства матерей с поражением печени по сравнению с контрольными животными. По итогам исследования сделано заключение о неблагоприятном влиянии хронической патологии печени матери на становление способности к запасанию питательного субстрата нейтрофилами потомства.
костный мозг.
нейтрофилы
печень
плод
1. Брюхин Г.В., Вторушина Е.В. Роль токсического поражения печени матери в нарушении структурно-функционального становления яичников потомства в условиях эксперимента // Морфологические ведомости. - 2006. - №3-4. - С. 16‒18.
2. Брюхин Г.В., Сизоненко М.Л.. Особенности становления эндокринного компартмента мужских половых желез потомства самок крыс с хроническим поражением печени // Проблемы репродукции. - 2012. - №1. - С. 31-34.
3. Венгеровский А.И., Саратиков А.С. Механизм действия гепатопротекторов при токсических поражениях печени // Фармакология и токсикология. - 1988. - Т.51. - №1. - С. 89-92.
4. Иммунологические, цитохимические и биохимические методы исследования фагоцитирующих клеток. Методические рекомендации / под ред. Э.А. Имельбаевой. - Уфа: БГМИ, 1996. - 85 с.
5. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И.П. Западнюк, В.И. Западнюк, Е.А. Захария, Б.В. Западнюк. - 3-е изд., перераб. и доп. - Киев: Вища школа, 1983. - 383 с.
6. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск: Наука, 1983. - 254 с.
7. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. - М.: МедиаСфера, 2002. - 312 с.
8. Сааков Б.А., Поляк А.И. Моделирование воспалительного процесса в печени // Моделирование, методы изучения и экспериментальная терапия патологических процессов. - 1967. - С. 119-123.
9. Тотолян А.А., Фрейндлин И.С. Клетки иммунной системы. - СПб.: Наука, 2000. - 231 с.

На фоне продолжающегося демографического кризиса в России одной из актуальных проблем на сегодняшний день остается воспроизводство здорового потомства. В настоящее время отмечается увеличение числа женщин фертильного возраста с различными экстрагенитальными заболеваниями, среди которых особое место занимают болезни гепатобилиарной системы, в том числе хронические гепатиты, распространенность которых в мире год от года возрастает. Многочисленные экспериментальные и клинические исследования указывают на нарушение становления систем жизнеобеспечения у потомства матерей с хронической патологией гепатобилиарной системы, в том числе репродуктивной, иммунной, макрофагальной, пищеварительной и др. [1, 2].

Вместе с тем, является постулатом тот факт, что для функционирования всех без исключения систем органов необходимо их достаточное и полноценное кровоснабжение. Выполнение же кровью важнейших функций, а именно интегративной, транспортной, трофической, дыхательной, защитной, иммунной, в известной мере зависит от нормального протекания гемопоэза в красном костном мозге. Нарушение протекания нейтрофилоцитопоэза ведет к снижению и потере неспецифической резистентности организма [1].

В то же время, способность любой клетки адекватно ситуации выполнять свои функции напрямую зависит от достаточного получения этой клеткой питательных веществ и энергии. Наличие запаса питательных веществ определяет способность клетки при действии каких-либо раздражителей увеличивать свою активность, адекватно отвечая на стимуляцию [9]. Отмеченное выше предопределило выбор темы и цель исследования.

Целью настоящего исследования явился анализ роли хронического поражения печени матери в нарушении становления способности к накоплению питательного субстрата нейтрофилами красного костного мозга потомства.

Материал и методы исследования

В качестве объекта исследования в эксперименте были использованы белые лабораторные крысы (самки) «Вистар», всего 168 животных, в том числе взрослые самки (36 животных) и их разнополое потомст- во - 142 животных из 36 пометов в различные сроки постнатального периода (15-е, 30-е, 45-е, 60-е сутки). Сроки исследования согласуются с общепризнанным подразделением возрастных периодов у данной группы животных [5].

Исходя из цели настоящего исследования, все экспериментальные животные были разделены на 3 группы. Первую группу составили животные от интактных матерей - контрольная группа - 46 животных из 11 пометов. Во вторую группу вошло потомство от самок с хроническим экспериментальным поражением печени с помощью D(+)-галактозами- на - первая экспериментальная группа - 48 животных из 13 пометов. В третью группу вошло потомство самок с хроническим экспериментальным поражением печени с помощью фильтрата E. coli - вторая экспериментальная группа - 48 животных из 12 помётов.

Исследования проводились с учетом суточных и сезонных колебаний. Работа с экспериментальными животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» [5].

Модель хронического поражения печени путем введения D(+)-галактозамина. Поражение печени моделировалось путем внутрибрюшинного введения гепатотропного яда D(+)-галактозамина гидрохлорида (Sigma-G0500, США) на 0,9% растворе натрия хлорида в дозе 250 мг/кг массы тела животного. Экспериментальный гепатит, вызываемый введением D(+)-галактозамина, по своим морфологическим, иммунологическим и биохимическим характеристикам рассматривается рядом исследователей как адекватная модель вирусного гепатита В у человека [3].

Модель хронического поражения печени путем введения фильтрата E. coli.

Поражение печени моделировалось путем введения половозрелому животному (самке) в три участка печени - по одной инъекции с обеих сторон у основания мечевидного отростка и справа у края реберной дуги по срединно-ключичной линии - 0,2 мл фильтрата шестидневной культуры E. coli (штамм АТСС 25922) в разведении 1:4. Разрешающую инъекцию производили через 24 часа путём введения в хвостовую вену фильтрата шестидневной культуры E. coli из расчёта 0,3 мл/кг массы тела. По данным литературы, экспериментальный гепатит, вызываемый введением фильтрата шестидневной культуры E. coli, по своим морфологическим, иммунологическим и биохимическим характеристикам рассматривается как адекватная модель вирусного гепатита А у человека [8].

Хронические поражения печени верифицировали у лабораторных животных с помощью морфологических, биохимических и иммунологических методов [4, 9].

Морфологические и гистохимические методы исследования. Красный костный мозг получали из отпрепарированной от мышц бедренной кости забитого животного с отсеченными эпифизами путем нагнетания 0,9% раствора натрия хлорида с использованием шприца на 2 мл. Из полученного из бедренной кости костного мозга изготавливали мазки [4].

В мазках изучалась способность клеток к накоплению универсального питательного субстрата животной клетки - гликогена. С этой целью проводилась ШИК-реакция по Мак-Манусу, представляющая собой выявление гликогена методом Шифф-йодная кислота. Реакция основана на способности йодной кислоты окислять спиртовые группы, что при условии взаимодействия с реактивом Шиффа (фуксин-сернистая кислота) приводит к образованию кислото-стойкого красителя красно-фиолетового цвета.

ШИК-положительные вещества окрашиваются в красный цвет различных оттенков. Нейтральные мукополисахариды, содержащие гексозу, - пурпурно-красные, гликоген - темно-красный [4, 9].

Кроме того, количество накопленного клетками гликогена визуально оценивали полуколичественным методом с вычислением среднего гистохимического показателя (СГП) Астальди и Верга (1957) по формуле

СГП = (0·а + 1·б + 2·в + 3·г)/100,

где 0 - отсутствие гранул в клетке; 1 - гранулами занято < 25% площади цитоплазмы; 2 - гранулами занято 25-50% площади цитоплазмы; 3 - гранулами занято > 50% площади цитоплазмы.

Статистические методы исследования. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием лицензионного пакета прикладных программ «SPSS 17.0». При сравнительном анализе данных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни [7].

Результаты исследования и их обсуждение

Способность к накоплению гранул гликогена оценивалась на 15, 30, 45 и 60 день постнатального онтогенеза у нейтрофилов на различных стадиях развития. Из клеток митотического пула были рассмотрены миелобласты, миелоциты и метамиелоциты. Результаты исследования миелобластов контрольных и подопытных животных представлены в табл. 1. Отражена доля содержащих гранулы гликогена клеток от общего количества миелобластов.

Из табл. 1 видно, что количество накапливающих гликоген миелобластов на раннем сроке постнатального развития (на 15 день) в контроле и обеих опытных группах различается незначительно. С увеличением возраста животных увеличиваются и различия - на 30, 45 и 60 день количество содержащих гранулярный гликоген миелобластов в обеих опытных группах существенно ниже по сравнению с контролем.

Результаты оценки содержания гликогена в промиелоцитах представлены в табл. 2. Из табл. 2 следует, что для промиелоцитов сохраняется та же тенденция, что и для миелобластов: незначительные на раннем сроке постнатального онтогенеза различия с возрастом начинают усиливаться. Доля гликогенсодержащих промиелоцитов на 30, 45 и 60 день развития существенно ниже в обеих опытных группах по сравнению с контролем.

Таблица 1  Содержание гликогенсодержащих миелобластов в костном мозге экспериментальных животных (%)

Группа

 

Возраст, сутки

Контрольная

Опытная группа 1

Опытная группа 2

15

10,64 ± 0,38

11,37 ± 0,86

9,94 ± 0,64

30

16,65 ± 0,49

11,89 ± 0,56*

14,33 ± 0,56*

45

21,32 ± 0,54

17,45 ± 0,73*

18,46 ± 0,31*

60

14,47 ± 0,65

12,29 ± 0,34

11,59 ± 0,67*

Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).

Таблица 2  Содержание гликогенсодержащих промиелоцитов в костном мозге экспериментальных животных (%)

Группа

 

Возраст, сутки

Контрольная

Опытная группа 1

Опытная группа 2

15

15,52 ± 0,44

15,24 ± 0,63

14,67 ± 0,73

30

19,94 ± 0,26

17,74 ± 0,62*

16,65 ± 0,44*

45

23,35 ± 0,61

20,55 ± 0,27*

19,78 ± 0,66*

60

19,21 ± 0,37

17,35 ± 0,54*

17,01 ± 0,52*

Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).

Доля содержащих гранулы гликогена миелоцитов у подопытных и интактных крысят представлена в табл. 3. Среди миелоцитов количество гликогенсодержащих клеток на всех сроках развития снижено по сравнению с контролем. С возрастом различия в количестве накапливающих гликоген клеток у подопытных и контрольных крысят увеличиваются. Миелобласты, промиелоциты и миелоциты относятся к митотическому пулу предшественников нейтрофила. Эти клетки активно делятся, практически не несут другой функциональной нагрузки и не обладают характерной для нейтрофила синтетической и фагоцитарной активностью [6]. В связи с этим, эти клетки не остро нуждаются в накоплении питательных веществ. Однако даже на ранних стадиях нейтрофилоцитопоэза наблюдается снижение по сравнению с контролем количества гликогенсодержащих клеток в первой и второй опытных группах, причём по мере созревания клеток от миелобласта к миелоциту различия становятся всё более явными.

Таблица 3 Содержание гликогенсодержащих миелоцитов в костном мозге экспериментальных животных (%)

Группа

 

Возраст, сутки

Контрольная

Опытная группа 1

Опытная группа 2

15

17,53 ± 0,28

15,81 ± 0,33*

15,38 ± 0,27*

30

20,25 ± 0,31

18,11 ± 0,49*

17,73 ± 0,39*

45

22,48 ± 0,44

19,97 ± 0,35*

20,18 ± 0,67

60

20,64 ± 0,35

18,64 ± 0,37*

18,52 ± 0,25*

Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).

Эти результаты позволяют констатировать, что нарушение процессов синтеза и накопления гликогена в нейтрофильных предшественниках начинается на ранних стадиях нейтрофилоцитопоэза [6].

Три следующие стадии развития нейтрофила представляют собой немитотический пул нейтрофильных предшественников. Начиная с метамиелоцитаб начинается собственно процесс дифференцировки - синтез специфических ферментов, накопление оксифильной и азурофильной зернистости, становление фагоцитарной активности, повышение интенсивности окислительно-восстановительных процессов. Клетки способны участвовать в реакциях воспаления и адекватно отвечать на внешний стимул усилением интенсивности метаболизма [6].

В табл. 4 представлены данные по содержанию гликогена в метамиелоцитах крысят контрольной и опытных групп.

Таблица 4 Содержание гликогенсодержащих метамиелоцитов в костном мозге экспериментальных животных (%)

Группа

 

Возраст, сутки

Контрольная

Опытная группа 1

Опытная группа 2

15

38,61 ± 0,36

33,81 ± 0,47*

35,05 ± 0,43*

30

41,67 ± 0,24

34,56 ± 0,58*

34,93 ± 0,55*

45

45,30 ± 0,51

33,68 ± 0,23*

35,51 ± 0,38*

60

43,59 ± 0,45

35,21 ± 0,36*

37,64 ± 0,17*

Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).

Согласно таблице, доля содержащих гранулы гликогена метамиелоцитов в обеих опытных группах существенно ниже по сравнению с контролем на всех представленных сроках постнатального развития. Доля содержащих гликоген клеток среди палочкоядерных нейтрофилов контрольных и подопытных животных представлена в табл. 5. Доля содержащих включения гликогена нейтрофилов в обеих опытных группах существенно снижена по сравнению с контролем. Можно отметить, что разница между контролем и опытом по мере повышения степени дифференцировки клеток усиливается.

Таблица 5 Содержание гликогенсодержащих палочкоядерных нейтрофилов в костном мозге экспериментальных животных (%)

Группа

 

Возраст, сутки

Контрольная

Опытная группа 1

Опытная группа 2

15

64,33 ± 0,21

55,78 ± 0,38*

56,74 ± 0,35*

30

70,13 ± 0,53

54,86 ± 0,34*

57,89 ± 0,18*

45

71,54 ± 0,37

60,72 ± 0,56*

61,34 ± 0,57*

60

68,46 ± 0,52

55,26 ± 0,54*

60,61 ± 0,64*

Примечание. * Различия статистически достоверны ( < 0,05).

Наконец, результаты оценки доли гликогенсодержащих зрелых сегментоядерных нейтрофилов представлены в табл. 6. Содержание зрелых нейтрофилов с включениями гликогена в обеих опытных группах достоверно снижено на всех сроках постнатального онтогенеза по сравнению с контролем.

Таблица 6 Содержание гликогенсодержащих сегментоядерных нейтрофилов в костном мозге экспериментальных животных (%)

Группа

 

Возраст, сутки

Контрольная

Опытная группа 1

Опытная группа 2

15

71,42 ± 0,43

63,37 ± 0,19*

61,28 ± 0,26*

30

73,46 ± 0,61

65,44 ± 0,51*

64,32 ± 0,37*

45

70,45 ± 0,34

62,45 ± 0,31*

61,86 ± 0,64*

60

71,67 ± 0,39

61,34 ± 0,27*

62,35 ± 0,43*

Примечание. * Различия статистически достоверны (р < 0,05).

По результатам исследования содержания гликогена в клетках немитотического пула нейтрофильных предшественников можно заметить, что в процессе дифференцировки костномозговых нейтрофилов обеих подопытных групп, начиная с ранних стадий, имеет место нарушение синтеза и накопления гранул гликогена. Наиболее выраженное снижение запасов гликогена выявлено на более поздних стадиях нейтрофилоцитопоэза.

Эти результаты находятся в полном соответствии с изменением среднего гистохимического показателя, отражающего содержание гликогена в расчёте на одну клетку (рисунок).

Как видно из рисунка, средний гистохимический показатель миелобластов, промиелоцитов и миелоцитов крысят с поражением печени незначительно снижен по сравнению с контролем. В процессе дифференцировки костномозговых нейтрофилов экспериментальных животных содержание гранулярного гликогена в них увеличивается. При этом у подопытных крысят содержание данного энергетического субстрата существенно снижено по сравнению соответствующим контролем. Вероятно, клетки контрольных животных по мере созревания приобретают способность накапливать гликоген в значительных количествах, что необходимо для выполнения основных функций нейтрофилов, в том числе фагоцитарной и киллинговой. Вместе с тем, снижение содержания гликогена в нейтрофилах потомства матерей с хроническим поражением печени может обусловить угнетение их фагоцитарных свойств и, как следствие, депрессию неспецифической резистентности [9].

Средний гистохимический показатель накопления гликогена нейтрофилами экспериментальных животных

Заключение

Полученные результаты позволяют говорить о том, что экспериментальное хроническое поражение гепатобилиарной системы матери по своим морфологическим, биохимическим и физиологическим характеристикам аналогичное гепатитам А и В, негативно влияет на способность костномозговых нейтрофилов потомства синтезировать и накапливать гликоген, являющийся основным энергетическим субстратом клетки. У подопытных животных происходит уменьшение числа гликогенпозитивных клеток и содержания гранулярного гликогена в каждой клетке. Полученные результаты позволяют предположить, что у самок крыс с хроническим поражением печени рождается потомство с нарушением нейтрофилоцитопоэза.

Рецензенты:

  • Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации», г. Челябинск;
  • Кривохижина Л.В., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой патологической физиологии ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации», г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 03.08.2012.


Библиографическая ссылка

Невзорова Н.В., Брюхин Г.В. ХАРАКТЕРИСТИКА ШИК-ПОЗИТИВНОГО МАТЕРИАЛА В КЛЕТКАХ НЕЙТРОФИЛОЦИТАРНОГО ПУЛА КОСТНОГО МОЗГА У ПОТОМСТВА САМОК КРЫС С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ПОРАЖЕНИЕМ ПЕЧЕНИ // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 8-1. – С. 116-121;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30279 (дата обращения: 13.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074