Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

КЛАСТЕРО-КИНЕТИЧЕСКАЯ ГИПОТЕЗА ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

Зимин Ю.В. 1 Уланова А.А. 1 Соловьева А.Г. 1
1 ФГБУ «ННИИТО» Минздравсоцразвития России, Нижний Новгород
Энзимология XXI века вплотную подошла к изучению свойств ферментов в составе сложных мультиэнзимных комплексов клетки с помощью кинетических методов исследования. В работе предлагается новая кластеро-кинетическая гипотеза ферментативного катализа, в которой кинетический энзимокла́стер рассматривается как динамическое объединение нескольких гомо- (гетеро-) конформеров фермента, образующееся в процессе катализа, которое может рассматриваться как самостоятельная единица, обладающая определёнными свойствами. В процессе кинетики ферментативной реакции происходят постоянные динамические кластеро-кинетические переходы белка-фермента из одной формы в другую. Исследования проводили на очищенных препаратах алкогольдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы, определяли каталитическую активность ферментов и рассчитывали интегративные кинетические показатели. Установлено, что изменения микроокружения ферментов приводят к трансформации их конформеров, что в свою очередь сказывается на образовании энзимокластеров, которые проявляют различные кинетические свойства.
ферменты
кинетика
кластер
1. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. – М.: Мир, 1990. – 350 с.
2. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: ВШ, 1980. – 272 с.
3. Keung W.M., Ho Y.W., Fong W.P. Isolation and characterization of shrew liver alcohol dehydrogenase // Comp. Biochem. and Physiol. B. – 1989. – Vol. 93, № 1. – P. 169–173.
4. Koivusalo M., Baumann M., Votila L. Evidence for the identity of glutathione – derendent formaldehyde dehydrogenase and class III alcohol dehydrogenase // FEBS Lett. – 1989. – Vol. 257, № 1. – P. 105–109.
5. Roos G., Geerlings P., Messens J. Enzymatic catalysis: the emerging role of conceptual density functional theory // J. Phys. Chem. B. – 2009. – № 113. – P. 13465–13475.
6. Urushadze Z. About a Real Conceptual Framework for Enzyme Catalysis // Bull. Georg. Natl. Acad. Sci. – 2006. ‒ Vol. 173, № 2. – P. 421–424.

Основной задачей энзимологии с момента ее возникновения является построение единой теории ферментативного катализа [1, 5, 6].

Нами предлагается кинетический подход к кластерной организации ферментативного катализа. Основным положением данной гипотезы является то, что в процессе ферментативного катализа изменяется кластерно-кинетическая организация фермента в среде.

Кинетический энзимокла́стер (англ. cluster - скопление) - динамическое объединение нескольких гомо- (гетеро-) конформеров фермента в процессе катализа, которое может рассматриваться как самостоятельная единица, обладающая определёнными свойствами.

Предполагается, что для любых ферментов как минимум существуют два основных ферментативных конформера: каталитический и агрегационный (рис. 1). Каталитический конформер характеризуется тем, что при объединении субъединиц в единое целое все активные центры фермента остаются активными. В противоположность ему агрегационный конформер характеризуется такой пространственной организацией, при которой часть активных центров фермента экранируются (см. рисунок). В целом, каждый энзимокластер представлен взаимодействием различного отношения каталитических и агрегационных конформеров между собой. В результате получаются три кинетических варианта энзимокластера:

  1. При равном количестве каталитических и агрегационных конформеров у фермента практически не проявляются кооперативные свойства его субъединиц (коэффициент кооперативности (Kn) = 1).
  2. Когда количество каталитических конформеров больше, чем агрегационных, у фермента имеет место положительная кооперативность взаимодействия субъединиц (Kn > 1).
  3. Если больше агрегационных конформеров, чем каталитических, то фермент обладает отрицательной кооперативностью (Kn < 1).

В процессе кинетики ферментативной реакции происходят постоянные динамические кластеро-кинетические переходы белка-фермента из одной формы в другую, которые можно экспериментально выявить.

Схема образования энзимокластера: a - каталитический конформер; б - агрегационный конформер; в - энзимокластер

Целью исследования явилось применение кластеро-кинетической гипотезы ферментативного катализа для объяснения особенностей кинетических свойств некоторых оксидоредуктаз (алкогольдегидрогеназы (АДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ)).

Материал и методы исследования

Исследования проводили на очищенном препарате АДГ из печени лошади («Sigma», США) и очищенном препарате ЛДГ из мышцы свиньи (фирмы Reanal). Определяли каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в прямой (АДГпр) и обратной реакциях (АДГобр), активность лактатдегидрогеназы в прямой (ЛДГпр) и обратной реакции (ЛДГобр). Рассчитывали интегративные кинетические характеристики: Кt (показатель сродства фермента к субстрату), Vmax (максимальная скорость реакции фермента), Kn (коэффициент кооперативности) [2, 3, 4]. Статистический анализ результатов исследований выполнен с использованием программы Statistica 6.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенных исследований кинетических свойств очищенных ферментов установлено, что сродство энзимокластера ЛДГ к субстратам реакции, максимальная скорость и каталитическая эффективность в целом выше, чем у энзимокластера АДГ (табл. 1).

Таблица 1 Кинетические показатели ферментов

 

Лактатдегидрогеназа

Алкогольдегидрогеназа

Кинетические показатели

ЛДГпр

ЛДГобр

АДГпр

АДГобр

Kt1

1,62 ± 0,02

2,23 ± 0,04

p = 0,0021

5,33 ± 0,06

7,04 ± 0,07

p = 0,0035

Vmax1

10,33 ± 0,23

22,41 ± 0,24

p = 0,0008

3,64 ± 0,12

98,13 ± 0,26

p = 0,0002

Kn1

0,81 ± 0,03

0,85 ± 0,02

1,12 ± 0,03

0,94 ± 0,02

Примечание: p - различия статистически значимы между показателями прямой и обратной реакций.

Из табл. 1 видно, что сродство к субстратам реакции выше для ЛДГпр по сравнению с ЛДГобр. Максимальная скорость реакции в 2 раза больше для обратной лактатдегидрогеназной реакции по сравнению с прямой. Таким образом, Kt1 ЛДГпр < Kt1 ЛДГобр, а Vmax1 ЛДГобр > Vmax1 ЛДГпр. В данном случае имеет место кластеро-кинетический механизм ферментативной реакции по типу псевдоактивации ЛДГ. Следует отметить, что у ЛДГ проявляется отрицательная кооперативность ее субъединиц, которая указывает на образование агрегационных конформеров данного фермента.

Для АДГпр и АДГобр наблюдается схожая кинетическая зависимость, только с другими значениями сродства к субстратам реакции и Vmax. Для алкогольдегидрогеназы кластеро-кинетический механизм ферментативной реакции представлен по типу псевдоактивации. При этом АДГпр имеет положительную кооперативность взаимодействующих субъединиц фермента, а АДГобр - отрицательную. Можно предположить, что прямая алкогольдегидрогеназная реакция связана с каталитическими конформерами фермента, а обратная - преимущественно с агрегационными конформерами.

Несомненно, что определяющим фактором изменения кинетических характеристик оксидоредуктаз является физико-химическое состояние среды, в которой происходит ферментативная реакция.

Для изменения физико-химических условий проведения ферментативной реакции оксидоредуктаз в среду буфера добавлялись сразу два фермента (ЛДГ, АДГ) и определялась каталитическая активность каждого в отдельности (табл. 2).

Таблица 2 Кинетические показатели ферментов (в среде одновременно присутствуют два фермента в равных количествах)

 

ЛДГ и АДГ (1:1)

АДГ и ЛДГ (1:1)

Кинетические показатели

ЛДГпр

ЛДГобр

АДГпр

АДГобр

Kt2

1,29 ± 0,04

8,83 ± 0,06*

p = 0,0034

4,67 ± 0,03

4,5 ± 0,02*

Vmax2

4,88 ± 0,05*

31,9 ± 0,24*

p = 0,0004

2,54 ± 0,26

31,83 ± 0,18*

p = 0,0001

Kn2

0,78 ± 0,01

0,95 ± 0,02

p = 0,0078

0,91 ± 0,01

0,91 ± 0,02

Примечание: p - различия статистически значимы между показателями прямой и обратной реакций; * - различия статистически значимы по сравнению с показателями очищенного фермента при наличии в растворе одного фермента (p ≤ 0,05).

Из табл. 2 следует, что присутствие в растворе одновременно двух ферментов в равном количестве оказывает влияние на кинетические свойства как ЛДГ, так и АДГ. Для ЛДГпр кинетика ферментативной реакции изменяется по типу неконкурентного ингибирования, когда Kt1 ЛДГпр = Kt2 ЛДГпр, а Vmax2 ЛДГпр < Vmax1 ЛДГпр. Кинетика лактатдегидрогеназы в обратной реакции представлена по типу двухпараметрической рассогласованной активации, Kt2 ЛДГобр > Kt1ЛДГ обр, а Vmax2 ЛДГобр > Vmax 1ЛДГобр. Кинетические показатели прямой алкогольдегидрогеназной реакции практически не изменяются при наличии в растворе одновременно двух ферментов. Для АДГобр кинетика ферментативной реакции представлена по типу бесконкурентного ингибирования, где Kt 2АДГобр < Kt1 АДГобр, а Vmax2 АДГобр < Vmax1 АДГ (см. табл. 1, 2).
При этом присутствие в среде одновременно двух ферментов существенно сказывается на их отрицательной кооперативности в процессе образования энзимо- кластеров.

В итоге можно сделать заключение, что изменение микроокружения фермента, в частности оксидоредуктаз (алкогольдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы), приводит к трансформации их конформеров (каталитических и агрегационных), что в свою очередь сказывается на образовании энзимокластера, проявляющего различные кинетические свойства. Данный кинетический подход, несомненно, важен для дальнейшего развития исследований в области современной энзимологии, особенно при изучении свойств ферментов, входящих в состав сложной гетерогенной системы клетки.

Рецензенты:

  • Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;
  • Веселов А.П., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биохимии и физиологии растений, декан биологического факультета ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.

Работа поступила в редакцию 05.07.2012.


Библиографическая ссылка

Зимин Ю.В., Уланова А.А., Соловьева А.Г. КЛАСТЕРО-КИНЕТИЧЕСКАЯ ГИПОТЕЗА ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 9-3. – С. 559-562;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30308 (дата обращения: 22.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074