Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

Исследование репаративных свойств фитогеля, содержащего экстракты чабреца и солодки

Володина Т.А. 1 Пеньевская Н.А. 1 Викторов С.И. 2 Огай М.А. 1 Майорова А.В. 3
1 ГБОУ ВПО Омская государственная медицинская академия
2 МУЗ «Городская больница №3»
3 РУДН, Москва
В статье приведены результаты изучения биологической активности фитогеля оригинального состава. В качестве биологических объектов эксперимента использовали культуру клеток Parametium caudatum и белых крыс линии Вистар. Для исследования были сконструированы пять композиций, которые отличались долевыми соотношениями каждого из компонентов. В тестах на культуре клеток Parametium caudatum по антиоксидантной и мембраностабилизирующей активности из пяти экспериментальных композиций выбрана оптимальная. Проведенные фармакологические и гистоморфологические исследования с использованием модели линейной кожной раны на самцах крыс линии Вистар показали, что фитогель обладает выраженными репаративными свойствами, способствующими более быстрому заживлению линейной раны, формированию и созреванию рубца, чем в контроле.
репарация
фитогель
1. Алексеева И.В. Разработка лекарственных форм для лечения ран / И.В. Алексеева // Фармация. – 2003. – № 2. – С. 43–46.
2. Воспроизведение потомства парамеций и млекопитающих при различных величинах окислительно-восстановительного потенциала среды/ Е.Б. Сабитова, К.М. Резников, А.Д. Брездынюк// Научные Ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. – 2012. – №4(123). – Вып.17/1. –С. 219–222.
3. Исследования по разработке состава мази для лечения раневого процесса / Т.Е. Рюмина, И.В. Алексеева, В.И. Панцуркин, Л.Н. Шмакова // Санкт-Петербургский научный Форум. – 2003: материалы III Междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых. – СПб., 2003. – Т. 2. – С. 46–47.
4. Кудрин, А.Н. Система экспресс-методов интегральной оценки биологической активности индивидуальных и комплексных препаратов на биологических объектах / А.Н. Кудрин, В.В. Ананин, В.Ю. Балабьян // Рос. Хим. журн. – 1997. – Т. 41. – № 5. – С. 114–123.
5. Опыт применения нового препарата при лечении раневого процесса / С.Х. Кичемасов, Е.К. Гуманенко, В.В. Воробьев, И.В. Алексеева и др. // Новые технологии в диагностике и лечении хирургической инфекции на основе доказательной медицины: материалы VI Всерос. конф. с междунар. участием «Раны и раневая инфекция». – М., 2003. – С. 55–57.

Несмотря на обилие имеющихся на фармацевтическом рынке лекарственных средств для местного лечения раневых и воспалительных процессов, приходится констатировать, что желаемая степень терапевтического эффекта до сих пор не достигнута [1, 4, 5]. В последнее десятилетие отмечается возрастающий интерес к средствам растительного происхождения, что объясняется наличием широкого спектра фармакологического действия, мягко и гармонично воздействующего на все системы организма при минимальном количестве побочных эффектов в условиях длительного применения, а также экономичностью.

Рациональное лечение ран – одна из наиболее острых и сложных проблем современной медицинской практики. На сегодняшний день ни один из методов лечения ран с использованием лекарственных средств не является универсальным, надежным, в полной мере удовлетворяющим клиницистов. Этиология и патогенез раневого процесса делают необходимым дифференцировать подход к созданию лекарственных форм для местного лечения раневой патологии [3,5].

Цель: изучить биологическую активность фитогеля оригинального состава.

Материалы и методы исследования

На первом этапе исследования были сконструированы 5 композиций из густых экстрактов чабреца, каштана, солодки, крапивы, масляного экстракта зверобоя и дигидрокверцетина. Композиции отличались долевыми соотношениями каждого из компонентов.

В качестве биологических объектов использовали культуру клеток Parametium caudatum и белых крыс линии Вистар. Parametium caudatum легко культивировать и при исследовании ее роста и размножения возможно быстро получить большой объем цифровой информации [2, 4]. Для культивирования парамеций использовали среду Лозина-Лозинского при рН водной среды 6,2–7,8 и температурном оптимуме 20–26 °С. Пищей для парамеций служили живые дрожжи – Rhadotorula gracilis с добавлением пшеничной муки. Для определения чувствительности парамеций на предметное стекло наносили две капли среды (число парамеций в каждой капле не менее 5 особей), одна капля служила контролем, ко второй тангенциально наносили каплю соответствующего объема 0,9 % раствора натрия хлорида. При этом парамеции считаются чувствительными в случае ускорения движения не более 4 особей из 5 по результатам 5 измерений. Двигательная активность парамеций во многом формируется на основе работы ионных каналов, встроенных в мембрану ресничек, и является характеристикой, отражающей функциональное состояние клетки [2]. При этом Parametium caudatum функционирует в направлении сохранения мембранного потенциала. В результате снижения мембранного потенциала клетки двигаются медленнее или вращаются на месте вокруг одного конца. Для оценки чувствительности по параметру – замедление движений – использовали 0,5 %-й раствор калия хлорида и проводили опыты по аналогичной методике. При этом парамеции считаются чувствительными в случае замедления движения не менее 4 особей из 5 по сравнению с контролем. Для изучения протективного (антиоксидантного и мембраностабилизирующего) действия исследуемых композиций оценивали их влияние на продолжительность периода активности инфузорий в среде с добавлением токсических веществ: 1 %-й раствор водорода пероксида (токсикант, который in vivo расщепляется до перекисных радикалов и повреждает преимущественно липидную часть мембраны) и 14 %-й этиловый спирт (токсикант, преимущественно повреждающий белковые структуры биомембраны). Под микроскопом оценивали состояние парамеций по следующим критериям: индифферентность – клетки совершают равномерные броуновские движения; биоактивность – движения клеток изменены: биоцидность-50 – погибло около 50 % клеток, биоцидность-100 – гибель 100 % клеток. Для подсчёта числа инфузорий использовали гемоцитометрический способ (камера Горяева).

Самцов крыс линии Вистар массой 180–200 г содержали в стандартных условиях по 3–4 особи в клетке с контролируемыми режимами температуры (24 °C) и освещения (в течение 12 ч), со свободным доступом к воде и пище. Все животные перед экспериментом проходили карантинный период продолжительностью 21 день. При проведении эксперимента на животных были соблюдены все этические правила и нормы по отношению к ним.

Раневой процесс воспроизводили на модели линейной кожной раны, которую наносили под комбинированным наркозом – ксилазина гидрохлорид (3 мг/кг), эфир диэтиловый. Кожу спины разрезали до собственной фасции. Длина разреза составила в среднем 25 мм. Затем на равном расстоянии от краев раны накладывали 1 шов, сближающий края раны. Для удобства последующего измерения размеров ран швы накладывались с таким расчетом, чтобы эпителий боковых краев раны не соприкасался, и в этом случае эпителизация происходила от конечных краев раны. Оценку ранозаживляющего действия проводили по характеру клинического течения (наличия нагноения, времени полного отторжения струпа, времени и динамике полного срастания краев раны) на 4, 8, 12, 16, 20 дни наблюдения. В исследовании использовали фитогель оригинального состава на основе чабреца, который наносили на рану 1 раз в день ежедневно в течение 20 дней.

Материал для гистологического исследования брали на 25 сутки после нанесения линейной раны. Образцы кожи брали таким образом, чтобы в поле зрения попадал, как участок поврежденной кожи, так и соседний неповрежденный участок. Эти участки рассматривались как интактные для сравнения с поврежденными.

Полнослойный фрагмент кожи иссекали в области раны, фиксировали в 10 %-м растворе нейтрального формалина и затем заливали в парафин по стандартной методике. Срезы толщиной 5–6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, а также пикрофуксином по Ван Гизону для выявления коллагеновых волокон.

Результаты исследования
и их обсуждение

Результаты изучения биологической активности пяти экспериментальных фитокомпозиций в остром (продолжительность сохранения двигательной активности парамеций после добавления клеточных ядов) и хроническом (темп роста парамеций) опытах представлены в табл. 1.

Таблица 1

Экспресс-оценка биологической активности экспериментальных фитокомпозиций в остром и хроническом опытах

Объект
исследования

Количество парамеций в 0,05 мл через 3 суток (при исходном 4–5 в 0,05мл)

Размер парамеций (мкм)

Характер движения (биологическая активность)

Время остановки парамеций в 14 % этаноле, мин

Время остановки парамеций в 1 %-м р-ре H2O2, мин

Композиция №1

 > 100

148 ± 11

-*

13,3 ± 0,4

3,4 ± 0,1

Композиция №2

 > 100

142 ± 9

-*

14,1± 0,1

5,2 ± 0,2

Композиция №3

 > 100

147 ± 9

-*

15,3 ± 0,5

5,8 ± 0,3

Композиция №4

 > 200

151 ± 16

-*

17,8 ± 0,7

7,1 ± 0,5

Композиция №5

 > 100

146 ± 11

-*

15,9 ± 0,4

4,6 ± 0,2

Контроль

40–50

145 ± 11

-*

8,9 ± 0,3

2,4 ± 0,1

Примечание. * – отсутствие биологической активности, инфузории совершают хаотичные броуновские движения.

Клетки парамеций в опытных группах (культуральная среда: очищенная вода с добавлением испытуемой комбинации) по размеру и форме не отличались от клеток контрольной группы (культуральная среда: очищенная вода). Кроме того, инфузории в среде, содержащей четвертую фитокомпозицию, отличались значительно более высокой подвижностью, чем в контроле. Результаты хронического опыта свидетельствует, что экспериментальные композиции являются экологически благоприятными для выбранной биологической модели. Также установлено, что фитокомпозиции существенно и статистически значимо (р < 0,05) удлиняли период сохранения двигательной активности инфузорий от момента добавления токсиканта до их остановки.

Таким образом, предварительный скриниг на Parametium caudatum показал что, наиболее благоприятной для используемой биологической модели оказалась композиция №4, под воздействием которой заметно повышалась двигательная активность и частота деления клеток парамеций, в результате чего к третьим суткам их количество превосходило контроль в 5 раз. Кроме того, композиция № 4 оказывала максимальные мембраностабилизирующий и антиоксидантный эффекты, что проявлялось в статистически значимам удлинении времени остановки движения парамеций под воздействием спирта этилового (в 2 раза) и перекиси водорода (в 3 раза).

В дальнейшем экспериментальная композиция № 4 была использована для создания фитогеля, репаративные свойства которого были изучены на модели линейной кожной раны у крыс (табл. 2). Все животные были разделены на три группы: контрольная группа (без лечения), опытная группа (лечение фитогелем) и группа сравнения (лечение мазью
«левомеколь»).

Таблица 2

Влияние разработанного фитогеля на время заживления линейной кожной раны

Исследуемый объект

Средний линейный размер раны, мм

исходный

на 4 день

на 8 день

на 12 день

на 16 день

на 20 день

Контрольная группа

(n = 7)

26,6 ± 1,3

22,9 ± 0,6

17,8 ± 1,7

5,3 ± 0,5

3,1 ± 0,6

1,3 ± 0,7

Группа сравнения (n = 7)

28,0 ± 1,0

22,0 ± 1,1

17,6 ± 1,1

4,3 ± 0,7

2,7 ± 0,5

0

Опытная группа (n = 7)

25,1 ± 1,4

19,8 ± 1,4

15,2 ± 1,1

2,7 ± 0,5

1,4 ± 0,5

0

Визуальные наблюдения показали, что заживление линейной раны было более интенсивным в группе животных, подвергавшихся лечению фитогелем. Уже на 12 послеоперационные сутки происходило значительное уменьшение раневой поверхности и отечности у опытных животных, по сравнению с контрольной группой, не подвергавшейся никакому воздействию. Средний размер линейной раны в опытной группе статистически значимо (р < 0,05) был почти в 2 раза меньше, чем в контроле. В группе сравнения, как и в контроле, наблюдали уменьшение размера линейной раны, однако при данном количестве животных различия статистически незначимы (4,3мм и 5,3 мм). Как известно, 15–20 сутки соответствуют третьей фазе заживления ран – фазе формирования рубца и его эпителизации. По нашим наблюдениям, на 20 сутки в опытной группе и группе сравнения животных раны были очищены от струпа, рубец полностью эпителизирован и покрыт волосяным покровом в отличие от контроля, где и на 22 сутки еще сохранялся струп. В контрольной группе полное заживление ран наблюдалось к 24 суткам.

На 25 день были взяты образцы для гистологического исследования. Результаты гистоморфологического исследования представлены на рис. 1–4. Макроскопически к 25 дню отмечалось полное заживление ран во всех группах. Поверхности линейных ран очищены от струпа. Кожные рубцы на данный день после операции были различимы с трудом, особенно в опытной группе.

рис_38.tif

Рис. 1. Срез кожи крыс до повреждения (окраска гематоксилин-эозином,
увеличение ×400)

На рис. 2 представлена окраска среза кожи крысы контрольной группы (без лечения) по Ван Гизону. В интактной зоне коллагеновые волокна отличаются значительной толщиной и расположены рыхло. В области заживления линейной раны наблюдается формирование грануляционной ткани, в которой коллагеновые волокна заметно тоньше, достаточно плотно прилегают друг к другу, менее интенсивно окрашены. Сохраняется большое количество капиллярных сосудов, в которых содержатся эритроциты. Наличие сосудов свидетельствует о незрелости образовавшегося рубца.

рис_39.tif

Рис. 2. Срез кожи крысы контрольной группы (без лечения), окраска по Ван Гизону
(увеличение ×800), фрагмент рубца (справа)

Микроскопически к 25 дню в опытной группе имела место полная эпителизация раневой поверхности (рис. 3). В контроле (рис. 4) микроскопически видны легкая борозда и незавершенная регенерация эпителия в зоне консолидации краев раны. В контрольной группе, в отличие от опытной, под эпителием и в структуре рубца отмечались очагово-диффузные воспалительные инфильтраты.

рис_40.tif рис_41.tif

Рис. 3. Фитогель, окраска по Ван Гизону и гематоксилин-эозином

Площадь зоны рубца и количество сосудов капиллярного типа в ней в срезах кожи животных контрольной группы (рис. 4) были значительно больше, чем у животных опытной группы (рис. 3). Отмечены различия в глубине проникновения рубцовой ткани. В опытной группе (несмотря на одинаковую глубину нанесения раны) к 25 дню рубец заканчивался на уровне волосяных фолликулов, тогда как в контроле грануляционная ткань распространялась глубоко в дерму до границы с подкожно-жировой клетчаткой.

рис_42.tif рис_43.tif

Рис. 4. Контрольная группа (без лечения), окраска по Ван Гизону и гематоксилин-эозином

В контроле на границе рубца с неповрежденной тканью сохранялась сосудистая зона грануляционной ткани, что свидетельствует о незавершенности формирования рубца. Кроме того, на границе проникновения рубца в дерму имела место зона воспаления (васкулиты). Количество клеточных элементов преобладает над волокнистыми. В опытной группе признаков воспаления нет, отмечается запустевание сосудов, в структуре рубцовой ткани отмечается преобладание волокнистых элементов над клеточными, что говорит о завершении созревания рубца.

Число структурных образований, характерных для нормальной кожи (волосяных фолликулов и сальных желез), было заметно больше в опытной группе по сравнению с контрольной.

Выводы

1. Наиболее благоприятной в экологическом отношении для Parametium caudatum оказалась фитокомпозиция № 4, которая оказывала максимальные мембраностабилизирующий и антиоксидантный эффекты.

2. Фитогель оригинального состава на основе композиции № 4 обладает репаративными свойствами, не уступающими препарату сравнения.

3. Воздействие фитогеля приводило к изменению динамики морфологических характеристик процесса регенерации кожных ран. Согласно макроскопическим и гистологическим критериям зрелости рубца (степень эпителизации, соотношения клеточных и волокнистых элементов соединительной ткани, степень выраженности и инволюции сосудистого компонента грануляционной ткани и др.), фитогель способствует более быстрому заживлению линейной раны (регенерации кожи), формированию и созреванию рубца.

Рецензенты:

Степанова Э.Ф., д.фарм.н., профессор, профессор кафедры технологии лекарств ПятГФА, г. Пятигорск;

Шевченко А.М., д.фарм.н., профессор кафедры технологии лекарств ПятГФА,
г. Пятигорск.

Работа поступила в редакцию 25.09.2012.


Библиографическая ссылка

Володина Т.А., Пеньевская Н.А., Викторов С.И., Огай М.А., Майорова А.В. Исследование репаративных свойств фитогеля, содержащего экстракты чабреца и солодки // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 11-2. – С. 472-477;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=30561 (дата обращения: 18.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074