Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Абаленихина Ю.В. 1 Фомина М.А. 1 Чурилов Г.И. 1 Иванычева Ю.Н. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова Минздрава России»

Изучено влияние ультрадисперсных порошков меди в дозе 10-4 мг/кг и 1 мг/кг на окислительную модификацию белков тимуса крыс. Установлено, что в условиях данной модели дозозависимо повышается окислительная модификация протеинов с преобладанием процессов фрагментации белковых молекул. Согласно полученным данным соотношение альдегид-динитрофенилгидразонов и кетон-динитрофенилгидразонов зависит от изменения уровня свободной меди в организме в сторону преобладания первичных маркеров окислительного стресса. Воздействие меди в ультрадисперсной форме сопровождается сайт-специфическим окислительным повреждением белков в области остатков триптофана. Глубокие окислительные повреждения белков в условиях данной модели способствуют снижению возможности обновления белков ткани тимуса, что, вероятно, связано со снижением активности клеточных протеазных систем.

Статья в формате PDF

393 KB

окислительная модификация белков

тимус

ультрадисперсные порошки меди

1. Глущенко Н.Н., Богословская О.А., Ольховская И.П. Сравнительная токсичность солей и наночастиц металлов и особенность их биологического действия // Нанотехнологии и информационные технологии – технологии XXI века: материалы Международной научно-практической конференции. – М., 2006. – С. 93–95.

2. Губский Ю.И. Токсикологические последствия окислительной модификации белков при различных патологических состояниях // Современные проблемы токсикологии. – 2005. – Т. 8, № 3 – С. 20–27.

3. Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток. – СПб.: Медицинская пресса, 2006. – 400 с.

4. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека. Метод её определения / Е.Е. Дубинина, С.О. Бурмистров, Д.А. Ходов, И.Г. Поротов // Вопросы мед. химии. – Т. 41, № 1. – 1995. – С. 24–26.

5. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты. – М.: МАИК, 2001. – 343 с.

6. Муравлева Л.Е. Окислительная модификация белков: проблемы и перспективы исследования // Фундаментальные исследования. – 2010. – № 1. – С. 74–78.

7. Никитина Ю.В., Мухина И.В. Изменение окислительных процессов в ткани головного мозга в раннем онтогенезе // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. – 2009. – № 6(1). – С. 124–131.

8. Толочко З.С., Спиридонов В.К. Окислительная модификация белков в крови крыс при повреждении капсаицин-чувствительных нервов и изменении уровня оксида азота // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. – 2010. – Т. 96, № 1. – С. 77–84.

9. Amado R., Aeschbach R., Neukom H. Dytirosine: in vitro production and characterization // Methods Enzymol. – 1984. – Vol. 107. – P. 377–388.

10. Aust S.D., Morehouse L.A., Thomas C.E. Role of metals in oxygen radical reactions // Free Radic. Biol. Med. – 1985. – Vol. 1, № 1. – P. 3–25.

11. Dalle-Donne I. Protein carbonyl groups as biomarkers of oxidative stress // Clinica Chimica Acta. – 2003. – № 329. – Р. 23–38.

12. Stadtman E.R. Metal ion-catalyzed oxidation of proteins: biochemical mechanism and biological consequences // Free Radic. Biol. Med. – 1990. – Vol. 9, № 4. – P. 315–325.

13. Stadtman E.R. Role of oxidized amino acid in protein breakdown and stability // Methods in Enzymol. – 1995. – Vol. 258. – P. 379–393.

14. Teale F.W.J. Ultraviolet fluorescence of proteins in neutral solution // Biochem. J. – 1960. – Vol. 76, № 2. – P. 381–388.

Новым направлением в современной науке стало исследование окислительной модификации белков (ОМБ) при патологических и адаптационных процессах. На сегодняшний день ОМБ признана одним из наиболее ранних и стабильных показателей поражения различных тканей организма при свободно-радикальной патологии [5, 6, 11].

Многочисленные экспериментальные исследования посвящены изучению окисления белков за счет ОН˙, который может образовываться при участии металлов переменной валентности [10, 12]. В настоящее время металл-катализируемое окисление рассматривается как посттранскрипционная окислительная модификация белков, которая может играть важную роль в тканях при физиологических условиях и при различных патологических состояниях. Окисление аминокислотных остатков происходит в присутствии металлов переменной валентности (железо, медь), кислорода и Н2О2 и затрагивает ту часть белковой молекулы, которая участвует в связывании металла [3].

Вышеперечисленные факты дают основание рассматривать ионы меди в качестве индукторов ОМБ. В свете данной проблемы большой интерес вызывают биопрепараты нового поколения – микроэлементы в виде ультрадисперсных порошков металлов (УДПМ), активными компонентами которых является медь и другие микроэлементы в ультрадисперсном состоянии. Установлено, что нанокристаллические порошки меди улучшают физиологическое состояние животных, однако большая удельная поверхность наноматериалов и ее особые свойства могут усилить механизмы, связанные с токсическим действием металла на живые организмы [1], именно поэтому вызывает интерес изучение влияния УДП меди на биохимические показатели.

Цель представленного исследования: изучить окислительную модификацию белков тимуса крыс в условиях применения нанопорошков меди как модулятора биохимических процессов.

Материалы и методы исследования

Исследование проводили на 18 конвенциональных крысах-самках линии Wistar массой 280–320 г.

Животным экспериментальных групп в течении 14 дней перорально вводили УДП меди (размер частиц 10–15 нм): группе 1 (n = 6) в дозе 10–4 мг/кг, а группе 2 (n = 6) в дозе 1 мг/кг. Контрольной группе животных (n = 6) в те же сроки осуществляли пероральное введение физиологического раствора. Содержание животных в виварии соответствовало «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 06.04.1993. Все манипуляции с животными, в том числе и выведение из эксперимента, осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приказ Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г.).

Немедленно после выведения животного из эксперимента ткань тимуса помещали в холодный 0,25 М раствор сахарозы в соотношении 1/100 и гомогенизировали в течение 40 с при 900 об/мин в гомогенизаторе Potter S. Описанные процедуры проводили при температуре не выше 4 °С.

Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 1000 g для осаждения не полностью разрушенных клеток и ядер. Надосадочную жидкость центрифугировали 15 мин при 14000 g для удаления митохондрий, а затем полученный супернатант – дополнительно при 20000 g в течение 30 мин для получения чистой цитоплазматической (неседиментируемой) фракции, в которой и определяли окислительную модификацию белков.

Окислительную модификацию белков оценивали по методу R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [3] после осаждения нуклеиновых кислот 10 %-м раствором стрептомицина сульфата. Оптическую плотность альдегид-динитрофенилгидразонов (АДНФГ) и кетон-динитрофенилгидразонов (КДНФГ) регистрировали на спектрофотометре СФ-2000 при следующих длинах волн: 356 и 430 нм (АДНФГ), 370 и 530 нм (КДНФГ) [4, 8]. Степень окислительной модификации белков выражали в единицах оптической плотности, отнесенных на 1 г ткани.

Содержание битирозина и окисленного триптофана определяли флуориметрическим методом. Окислительная модификация тирозиновых остатков белков измерялась по образованию битирозина, который обладает характерной флуоресценцией [9]. Окисление триптофановых остатков сопровождается снижением флуоресценции, характерной для триптофана [14].

Статистический анализ данных проводили по U-критерию Манна‒Уитни.

Результаты исследования и их обсуждение

Окислительная деструкция белков является одним из признаков окислительного стресса. Уровень продукции карбонильных производных в тимусе крыс экспериментальных групп был сопоставим и превышал соответствующие значения спонтанной окислительной модификации белков интактной группы животных.

Важно отметить, что статистически значимое дозозависимое увеличение динитрофенилгидразонов при λ = 430 и 530 нм для обеих экспериментальных групп, что свидетельствует о преимущественном образовании динитрофенилгидразонов основного характера. На длине волны 356 нм статистически значимые различия имеются для группы животных, которым вводили УДП меди в дозе 1 мг/кг, данный факт свидетельствует о преобладании образования альдегидных форм.

В ранних стадиях окислительного стресса преобладают АДНФГ (маркеры фрагментации белков), в поздних – КДНФГ (маркеры агрегации белков) [2, 8]. Из приведенных результатов следует, что в контрольной группе незначительно преобладают вторичные маркеры окислительного стресса. Тот факт, что в модифицированных группах белков выявлено преобладание АДНФГ над КДНФГ при введении УДП меди как в дозе 10–4 мг/кг, так и в дозе 1 мг/кг, свидетельствует о том, что при данных дозировках процесс окислительного стресса не переходит в развитую стадию и носит обратимый характер. Также следует отметить, что преобладание альдегидных форм может свидетельствовать о наличии процесса фрагментации белков с образованием низкомолекулярных фрагментов.

Примером результата фрагментации в условиях данной модели служат конечные продукты разрыва пятичленной структуры индольного кольца триптофана в результате его гидроксилирования. Об этом процессе свидетельствует прямая достоверная зависимость между вводимой дозой меди в ультрадисперсной форме и резким снижением флуоресценции триптофановых остатков (таблица).

Показатели окислительной модификации белков в гомогенате тимуса крыс контрольной и экспериментальных групп (М ± s)

Примечание: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05);

▲ – статистически значимые отличия от группы 1 (р < 0,05).

Таким образом, воздействие УДП меди сопровождается сайт-специфическим окислительным повреждением белков в области остатков триптофана. Представленные данные свидетельствуют о глубоких окислительных повреждениях белков при данной экспериментальной модели, подтверждением этого является зарегистрированная нами в гомогенате тимуса высокая концентрация практически нерепарируемых стабильных модификаций триптофана в белках, сопровождающееся выраженными и достоверными изменениями их флуоресценции.

Образование битирозина в экспериментальных условиях незначительно снижалось (см. таблицу). Представленный факт подтверждает литературные данные о том, что ароматические аминокислоты редко входят в состав металл-связывающей поверхности белков, поэтому они меньше подвергаются воздействию металл-катализируемого окисления [13]. Кроме этого, незначительный уровень битирозина свидетельствует об отсутствии процессов агрегации и преобладании фрагментации белков.

Таким образом, можно говорить о напряжении процессов окислительной деструкции белков в тимусе крыс под влиянием меди в ультрадисперсном состоянии. Все это сопровождается изменениями интенсивности обменных процессов организма и, следовательно, отражается на возможности обновления белков тканей.

Оценка резервно-адаптационного потенциала производилась путем подсчета соотношения количества карбонильных производных белков при спонтанном и металл-катализируемом окислении протеинов. Полученную величину АДНФГинд. и КДНФГинд. принимали за 100 %, т.е. за максимально возможное значение для данной группы животных. Рассчитывали процентное соотношение для АДНФГ и КДНФГ основного и нейтрального характера [7]. График зависимости полученных значений от вводимой дозы УДП меди представлен на рис. 1, 2.

Рис. 1. Отношение значений альдегид-динитрофенилгидразонов, полученных при спонтанном окислении, к значениям, полученным при индуцированном окислении белка:* – статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05); ▲ – статистически значимые отличия от группы 1 (р < 0,05)

Из представленных рис. 1, 2 следует, что для АДНФГ и КДНФГ основного и нейтрального характера наблюдается одинаковая тенденция: достоверное увеличение соотношения относительно контрольной группы животных по мере увеличения вводимой дозы порошков меди в ультрадисперсной форме, при этом между экспериментальными группами также имеются статистически значимые различия. Следовательно, введение УДП меди дозозависимо приводит к накоплению модифицированных форм белков, что может иметь результатом истощение резервно-адаптационных возможностей клетки. Полученная зависимость отражает снижение возможности обновления белков ткани тимуса, что приводит к накоплению поврежденных, имеющих слабую функциональную активность белков, либо связано со снижением активности клеточных протеазных систем.

Рис. 2. Отношение значений кетон-динитрофенилгидразонов, полученных при спонтанном окислении, к значениям, полученным при индуцированном окислении белка: * – статистически значимые отличия от контрольной группы (р < 0,05); ▲ – статистически значимые отличия от группы 1 (р < 0,05)

Таким образом, изучив показатели окислительной модификации белков тимуса крыс, мы пришли к выводу, что пероральное введение УДП меди в дозе 10–4 мг/кг и 1 мг/кг вызывает дозозависимое повышение образования динитрофенилгидразонов преимущественно основного характера. Согласно нашим данным соотношение АДНФГ и КДНФГ зависит от изменения уровня свободной меди в организме в сторону преобладания первичных маркеров окислительного стресса (АДНФГ). В целом патологическое влияние УДП меди в условиях данной экспериментальной модели связано с образованием окисленных форм триптофана, преобладанием процессов фрагментации белковых молекул, результатом чего является изменение физико-химического состояния белков, нарушение их функций, что в конечном итоге способствует истощению резервно-адаптационных возможностей обновления белков тимуса.

Рецензенты:

Емельянова А.С., д.б.н., профессор кафедры технологии производства и переработки продукции животноводства ФГБОУ ВПО «Рязанский государственный агротехнический университет имени П.А. Костычева», г. Рязань;

Мажайский Ю.А., д.с-х.н., профессор, главный научный сотрудник Государственного научного учреждения «Всероссийский НИИ гидротехники и мелиорации имени А.Н. Костякова», Мещерский филиал, г. Рязань.

Работа поступила в редакцию 07.12.2012.

Библиографическая ссылка