Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Чумакова С.П. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Проведено исследование состава липидной фазы мембраны эритроцитов и их деформируемости у больных ишемической болезнью сердца с умеренным и выраженным постперфузионным гемолизом (30 и 15 человек соответственно) до и после искусственного кровообращения (ИК). Показано, что развитие умеренного гемолиза сочетается с нормальной деформируемостью эритроцитов, избыточным содержанием в их мембране до операции холестерола (ХС), лизофосфатидилхолина (ЛФХ) и недостатком фосфатидилинозитола (ФИ), уровень которого после ИК нормализуется при увеличении доли фосфатидной кислоты (ФК). Формирование выраженной гемоглобинемии ассоциировано с низкой деформируемостью эритроцитов и некоторым увеличением доли ХС в цитолемме до операции при нормальном соотношении фракций фосфолипидов (вследствие высокого содержания молодых форм эритроцитов), что после ИК сменяется увеличением доли ЛФХ и ФК, дефицитом ФИ и фосфатидилхолина в мембране. Низкая деформируемость эритроцитов у больных с выраженным гемолизом не связана с нарушением структуры липидной фазы их мембраны, но ассоциирована с напряжением эритропоэза.

Статья в формате PDF

360 KB

гемолиз

эритроциты

деформируемость эритроцитов

фосфолипиды

мембрана

искусственное кровообращение

1. Воробьев А.И. Руководство по гематологии: в 3 т. – 3-е изд. переработанное и дополненное. – М.: Ньюдиамед, 2003. – Т. 3. – 416 с.

2. Дементьева И.И., Морозов Ю.А., Чарная М.А. Интраоперационное повышение концентрации свободного гемоглобина в плазме крови (гемолиз) в кардиохирургии // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. – 2008. – № 6. – С. 60–63.

3. Дуткевич И.Г. Тактика экстренной диагностики и лечения гемолитических гемотрансфузионных осложнений // Вестник хирургии. – 2007. – Т. 166, № 6. – С. 77–80.

4. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. – Минск: Беларусь, 2000. – Т. 2. – 495 с.

5. Фильтрационное исследование деформируемости эритроцитов / И.Л. Лисовская, В.М. Витвицкий, Ф.И. Атауллаханов и др. // Гематология и трансфузиология. – 1993. – Т. 38, № 2. – С. 12–15.

6. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. – Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. – 202 с.

7. Рождественская М.А. Определение гемоглобина в плазме консервированной крови // Актуальные вопросы переливания крови. – 1955. – № 4. – С. 55.

8. Сторожок С.А., Санников А.Г., Захаров Ю.М. Молекулярная структура мембран эритроцитов и их механические свойства. – Тюмень: Изд-во Тюм. ун-та, 1997. – 140 с.

9. Факторы внутрисосудистого гемолиза у кардиохирургических больных после операций с искусственным кровообращением / С.П. Чумакова, О.И. Уразова, В.В. Новицкий и др. // Вестник РАМН. – 2012. – № 7. – С. 15–19.

10. Canonne J., Froidure-Nicolas S., Rivas S. Phospholipases in action during plant defense signaling // Plant Signal Behav. – 2011. – Vol. 6, № 1. – Р. 13–18.

11. Dodge J.T., Mitchell C., Hanahan D.J. et al. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin-free ghost of human erythrocytes // Archives Biochem Biophys. – 1963. – Vol. 100, № 1. – P. 119–130.

12. Folch J., Lees M., Sloane-Stanley A.G. A simple method for the isolation and purification of total lipid from animal tissues // J. Biol. Chem. – 1957. – Vol. 226, Suppl. 1. – P. 497–509.

13. Peng X., Frohman M.A. Mammalian phospholipase D physiological and pathological roles // Acta Physiol (Oxf). – 2012. – Vol. 204, № 2. – Р. 219–26.

14. Vercaеmst L. Hemolysis in cardiac surgery patients undergoing cardiopulmonary bypass: A review in search of a treatment algorithm // The J. of Extra Corporeal Technology. – 2008. – Vol. 40, № 4. – Р. 257–267.

В настоящее время искусственное кровообращение (ИК) является одной из наиболее часто применяемых методик в кардиохирургии, поскольку обеспечивает неподвижность операционного поля и дает возможность использования микрохирургической техники. Между тем длительная циркуляция крови в аппарате ИК сопровождается травмой ее форменных элементов и развитием внутрисосудистого гемолиза, чрезмерная выраженность которого чревата формированием почечной дисфункции, легочной гипертензии, гиперкоагуляции и полиорганной недостаточности в послеоперационном периоде [2, 14].

В процессе экстракорпоральной перфузии клетки красной крови подвергаются влиянию ряда агрессивных факторов ИК (механическому повреждению, гипероксии, температурному градиенту и др.). Среди последних ведущей признана механическая травма эритроцитов, испытывающих как мощную сдвиговую деформацию в турбулентном потоке крови вблизи ветвления магистралей, фиксации канюль и соединения модулей, так и умеренные сдвиговые нагрузки при ламинарном движении крови в магистралях и оксигенаторе [2, 9, 14]. В этих условиях способность эритроцитов обратимо изменять свою форму при сохранении клеточного объема (деформируемость) может во многом определять их гемолитическую стойкость, которая в свою очередь зависит от структуры липидной фазы мембраны эритроцитов и функционального состояния их цитоскелета [8]. Несмотря на общепринятую концепцию основополагающего вклада перфузиологического обеспечения в интенсивность интраоперационного гемолиза [2, 14], индивидуальные особенности структурно-функционального статуса эритроцитов у кардиохирургических больных могут быть значимым фактором, модулирующим выраженность постперфузионной гемоглобинемии.

Цель исследования: определить особенности структуры липидной фазы мембраны эритроцитов и ее роль в изменении деформируемости клеток у больных ишемической болезнью сердца, оперированных с применением идентичного перфузионного оборудования и проявляющих различную степень выраженности постперфузионного гемолиза.

Материал и методы исследования

В исследование вошло 45 больных (39 мужчин и 6 женщин) в возрасте от 50 до 66 лет, страдающих ишемической болезнью сердца (ИБС) с многососудистым поражением и перенесших операцию коронарного шунтирования с использованием ИК. Реваскуляризация миокарда проводилась в условиях нормотермии (36,07 ± 0,18 °С) и кристаллоидной кардиоплегии (Кустодиол, Германия). Экстракорпоральная перфузия осуществлялась на аппаратах ИК производства «Stokert» (Германия), оснащенных роликовыми насосами, с применением одноразовых мембранных оксигенаторов «Quadrox» (Швеция). Критериями исключения из исследования считали проведение у пациентов продленного после операции ИК, выполнение сочетанных операций, отказ от исследования.

В соответствии с обозначенной целью исследования проводили в двух группах пациентов, сформированных в зависимости от концентрации свободного гемоглобина в плазме крови после операции: с умеренным гемолизом (гемоглобинемия менее 40 мг/дл, 26 мужчин и 4 женщины) и с выраженным гемолизом (гемоглобинемия свыше 40 мг/дл, 13 мужчин и 2 женщины). Концентрация свободного гемоглобина в плазме крови 40 мг/дл была выбрана в качестве критерия распределения больных на группы, учитывая, что при гемоглобинемии свыше этого уровня наблюдаются клинические проявления внутрисосудистого гемолиза (прежде всего, желтуха) [3]. Больные двух групп сравнения были сопоставимыми по возрасту (в среднем 58,14 ± 1,29) и полу (87 % мужчин и 13 % женщин), функциональному классу стенокардии (III-IV) и продолжительности ИБС (4,81 ± 0,73 лет), но отличались по длительности ИК: при умеренном гемолизе 108,27 ± 7,51 мин, при выраженном 139,80 ± 13,17 мин (р < 0,05). В контрольную группу вошли 12 практически здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту с группами больных ИБС, не страдающие патологией кардиоваскулярной системы, а также заболеваниями других систем органов в стадии обострения.

Материалом исследования служила гепаринизированная (50 ед./мл) венозная кровь. Из цельной крови готовили тонкие мазки, которые суправитально окрашивали 1,2 % раствором бриллиантового крезилового синего для подсчета количества ретикулоцитов [4]. Исследование уровня свободного гемоглобина в плазме крови проводили с помощью бензидинового метода [7]. Деформируемость эритроцитов определяли методом измерения начальной скорости фильтрации 2 % взвеси эритроцитов в ресуспендирующей среде (раствор Рингера + глюкоза 1 мг/мл + альбумин 5 мг/мл + HEPES, рН = 7,4) через ацетатцеллюлозную мембрану типа МФАС–П с диаметром пор 2,4–4,5 мкм (ЗАО НТЦ «Владипор», г. Владимир) и диаметром диска 14 мм, регистрируя время образования 200 мкл фильтрата и рассчитывая индекс ригидности эритроцитов [5]. Мембраны эритроцитов выделяли путем гипоосмотического лизиса [11], липидный экстракт получали по методу J. Folch и соавт. [12]. Определяли общее содержание фосфолипидов (ФЛ) по содержанию липидного фосфора [4] и уровень общего холестерола в выпаренных экстрактах ферментативным методом с помощью коммерческого набора Новохол А («Вектор-Бэст», г. Новосибирск). Фосфолипидный спектр мембраны эритроцитов изучали с помощью тонкослойной хроматографии, разделяя фракции ФЛ в системе хлороформ : метанол : вода (32:12,5:2) на пластинках «Silufol UV254». Идентификацию фракций осуществляли с использованием стандартов «Sigma». Все исследования проводили двукратно: непосредственно до операции и через 1 ч после завершения ИК.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета программ «Statistica 8.0» и «Excel 2007». Для каждой выборки вычисляли – среднее арифметическое и m – ошибку среднего. Для проверки гипотезы о нормальном законе распределения использовался тест Шапиро–Уилка. Проверку гипотезы о равенстве средневыборочных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента для зависимых и независимых выборок и непараметрических критериев Манна−Уитни (для независимых выборок) и Вилкоксона (для зависимых выборок). Различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенных исследований было показано, что концентрация свободного гемоглобина в плазме крови и содержание ретикулоцитов в крови у больных ИБС обеих групп сравнения превышали контрольные значения не только после операции, но и до ее проведения (табл. 1). Последнее, видимо, отражает дисфункцию эритроцитов на фоне атеросклероза, ведущую к их ускоренной гибели и компенсаторной активации эритропоэза [6]. При этом установленные изменения в наибольшей степени выявлялись у пациентов с выраженным постперфузионнным гемолизом, чем в альтернативной группе больных. После операции у пациентов обеих групп сравнения уровни гемоглобинемии и ретикулоцитов в крови еще более возрастали по отношению к исходным значениям (см. табл. 1). Примечательно, что многократное увеличение первого показателя у больных с выраженной гемоглобинемией сочеталось лишь с некоторым повышением численности ретикулоцитов в крови, в то время как в альтернативной группе пациентов данные параметры изменялись в равной степени. Поскольку поступление ретикулоцитов в кровь всего через несколько часов после начала операции связано с наличием в костном мозге некоторого резерва этих клеток, дозревающих после энуклеации оксифильных нормобластов [1], то недостаточность данной реакции у больных с выраженной гемоглобинемией свидетельствует о дооперационном истощении костномозгового резерва молодых форм эритроцитов.

Таблица 1

Содержание ретикулоцитов в крови и свободного гемоглобина в плазме крови, а также деформируемость эритроцитов, количество холестерола и фосфолипидов в их мембране у больных ишемической болезнью сердца до и после операции с искусственным кровообращением ()

Примечание. Здесь и в табл. 2: pк – уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых доноров, p1 – по сравнению с показателями у кардиохирургических больных до операции, p2 – по сравнению с показателями у больных с умеренным гемолизом.

Следует отметить, что длительность ИК хотя и является важным фактором, определяющим степень интраоперационной гемоглобинемии [2, 14], массивный лизис эритроцитов у больных с выраженным гемолизом нельзя объяснить только большей продолжительностью экстракорпоральной перфузии: последняя лишь на 30 % превышала таковую у пациентов с умеренной гемоглобинемией, в то время как уровень постперфузионной гемоглобинемии отличался в 2,5 раза. Возможно, до операции у больных ИБС с выраженным гемолизом имеет место качественный дефект эритроцитов, опосредующий снижение их гемолитической стойкости в условиях экстракорпорального кровообращения. Известно, что внутрисосудистое разрушение клеток крови во время ИК обусловлено турбулентным потоком крови и экстремальной по величине сдвиговой деформацией, действием струйных сил, сил гидродинамического удара, поверхностного натяжения, влиянием высокого гидростатического давления в насосах аппарата ИК и отрицательного давления в коронарном отсосе, которые проявляются в разной степени на различных участках экстракорпорального контура [14]. При этом поведение эритроцитов в потоке крови определяется их механической резистентностью и деформируемостью [8].

Как было показано в предыдущих исследованиях, механическая резистентность эритроцитов у больных с выраженным гемолизом соответствует норме и, следовательно, не может быть причиной повышенного разрушения клеток во время ИК [9]. Между тем деформируемость клеток красной крови у пациентов с выраженной гемоглобинемией оказалось пониженной: индекс ригидности эритроцитов (величина обратная деформируемости) превышал таковой у здоровых доноров и больных с умеренным гемолизом (см. табл. 1). Очевидно, недостаточная способность эритроцитов изменять свою форму при умеренных скоростях потока крови, близких к физиологическим, которая in vivo реализуется преимущественно в сосудах микроциркуляторного русла [8], а in vitro – в оксигенаторе и фильтрах, обусловливает деструкцию клеток красной крови во время ИК. Причиной низкой деформируемости эритроцитов могут быть структурные аномалии цитоскелета или бислоя липидов эритроцитарной мембраны, в частности, высокое соотношение ХС/ФЛ [8].

Содержание ХС и соотношение ХС/ФЛ в мембране эритроцитов у больных ИБС обеих групп исследования оказалось повышенным как до, так и после операции (см. табл. 1), что вполне характерно для заболеваний, сопряженных с атеросклерозом [6]. Однако у больных с выраженным гемолизом глубина обнаруженных девиаций была меньшей, чем в альтернативной группе пациентов. Это, вероятно, объясняется более молодой популяцией циркулирующих эритроцитов у данной категории больных, у которых в дооперационном периоде был зарегистрирован ретикулоцитоз (см. табл. 1). Данное явление лежит и в основе нормального соотношения различных фракций ФЛ в эритроцитарной мембране до операции в изучаемой когорте пациентов (табл. 2), что само по себе удивительно при наличии клинически верифицированного атеросклероза коронарных артерий. Между тем, у больных с умеренной гемоглобинемией отмечалось высокое относительное содержание лизофосфатидилхолина (ЛФХ) при низком уровне фосфатидилинозитола (ФИ) в дооперационном периоде, что сочеталось с отчетливой тенденцией к увеличению доли ФС на фоне незначительного дефицита фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭА) (см. табл. 2). Подобные изменения удельного содержания различных фракций ФЛ в эритроцитарной мембране свидетельствуют о типовой реакции клеток на повреждение при патологиях различного генеза [6].

Таблица 2

Относительное содержание отдельных фракций фосфолипидов в мембране эритроцитов у больных ишемической болезнью сердца до и после операции с искусственным кровообращением ()

Несмотря на то, что общее содержание ФЛ в мембране эритроцитов у больных ИБС было пониженным вне зависимости от выраженности постперфузионного гемолиза и этапа исследования (см. табл. 1), фосфолипидный спектр мембраны после операции существенно изменялся (см. табл. 2): при умеренной гемоглобинемии нормализовалось содержание ФИ, аналогичная тенденция отмечалась для ЛФХ, но возрастала доля фосфатидной кислоты; при выраженном гемолизе уровень ФИ и ФХ снижались на фоне увеличения доли ЛФХ и фосфатидной кислоты (ФК).

Учитывая неспособность эритроцитов к синтезу липидов и пути метаболизма мембранных ФЛ в клетке, можно предположить, что развитие умеренной гемоглобинемии ассоциировано с активацией фосфолипаз С и D, продуктом деятельности которых является ФК [6, 10, 13]. Формирование выраженной гемоглобинемии помимо аналогичной реакции, сопровождается активацией фосфолипазы А2, осуществляющей деградацию ФЛ с образованием лизофракций [6, 10]. Поскольку фосфолипаза А2 преимущественно гидролизует ФХ, а фосфолипаза D обладает исключительной специфичностью к этому ФЛ [10, 13], то сочетанная активация данных ферментов опосредует послеоперационное снижение уровня ФХ в эритроцитарной мембране у больных с выраженным гемолизом. Кроме того, потенцирующее действие в деградации ФХ оказывает свободнорадикальная модификация его молекул, которые богаты ненасыщенными двойными связями и выступают в роли главного субстрата в процессах липопероксидации [6, 13]. Гипероксия, неизбежно возникающая при ИК, приводит к активации ПОЛ, которая способствует пероксидации ФЛ в мембране эритроцитов и, как показано ранее, характерна только для выраженной гемоглобинемии [9, 14]. ФЛ, имеющие в составе гидропероксиды жирных кислот, особенно активно гидролизуются фосфолипазой А2 [6, 10].

Уменьшение доли ФИ после ИК у пациентов с выраженным гемолизом, очевидно, связано с активацией фосфолипазы С, гидролизующей ФИ с образованием инозитолтрифосфата и диацилглицерола, метаболизируемого далее до ФК [10]. У больных с умеренным гемолизом снижение ФИ после ИК не отмечается в силу либо меньшей активности фермента, либо более интенсивного поступления в кровоток молодых форм эритроцитов (ретикулоцитов, табл. 1), содержащих большое его количество.

Сопоставляя незначительные нарушения в структуре мембраны эритроцитов у больных с выраженным гемолизом (небольшое увеличение ХС/ФЛ-коэффициента и нормальное соотношение отдельных фракций ФЛ) с почти двукратным увеличением индекса ригидности клеток, приходится констатировать, что дефекты липидной фазы эритроцитарной мембраны не обусловливают низкую деформируемость клеток красной крови у данной категории пациентов. Вероятно, основную роль в нарушении механизмов обратимой трансформации клетки играет несостоятельность цитоскелета. Белки цитоскелета, как и остальные протеины эритроцитов, синтезируются только в ходе эритропоэза, активация которого сопровождается сокращением генерационного времени эритрокариоцитов, необходимого для наработки всех компонентов клетки [1]. Очевидно, высокая напряженность эритропоэза до операции у больных с выраженным гемолизом (ретикулоцитоз при сокращении костномозгового резерва ретикулоцитов) определяет дефицит белков цитоскелета и низкую деформируемость эритроцитов.

Выводы

1. Вне зависимости от выраженности постперфузионного гемолиза и этапа периоперационного периода структура мембраны эритроцитов у больных ИБС характеризуется дефицитом общих ФЛ, а также высоким содержанием ХС и повышенным соотношением ХС/ФЛ, наиболее выраженными у больных с умеренной гемоглобинемией (до операции), у которых после ИК ХС/ФЛ-коэффициент снижается, а при выраженном гемолизе – возрастет.

2. Развитию умеренного гемолиза предшествуют значительные изменения фосфолипидного спектра мембраны эритроцитов до операции с избыточным содержанием ЛФХ и дефицитом ФИ, уровень которого после ИК нормализуется при аналогичной тенденции ЛФХ. Формирование выраженной гемоглобинемии ассоциировано с нормальным соотношением фракций ФЛ в эритроцитарной мембране до операции (вследствие высокого содержания молодых форм эритроцитов), что после ИК сменяется увеличением доли ЛФХ, дефицитом ФИ и ФХ в цитолемме. Содержание ФК в мембране эритроцитов после операции возрастает независимо от выраженности гемолиза.

3. Больным с выраженной гемоглобинемией свойственна низкая деформируемость эритроцитов (в отличие от нормального показателя пациентов с умеренным гемолизом), которая не связана с нарушением структуры липидной фазы мембраны эритроцитов, но ассоциирована с высокой напряженностью эритропоэза, которая может сопровождаться дефицитом белков цитоскелета.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ в рамках проекта «Механизмы нарушений гемолитической стойкости эритроцитов к факторам экстракорпоральной перфузии» (соглашение № 12-04-31655/12 от 16.10.2012).

Рецензенты:

Петрова И.В., д.б.н., профессор кафедры биофизики и функциональной диагностики, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск;

Дмитриева А.И., д.м.н., заведующая диагностическим отделением ОГБУЗ «Томский областной онкологический диспансер», г. Томск.

Работа поступила в редакцию 18.01.2013.

Библиографическая ссылка