Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МОЛЕКУЛЫ ИНУЛИНАЗЫ С МАТРИЦЕЙ СИНТЕТИЧЕСКИХ ИОНИТОВ

Холявка М.Г. 1 Ковалева Т.А. 1 Артюхов В.Г. 1 Карпов С.И. 1 Середин П.В. 1 Богачев М.И. 2
1 ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»
2 ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный электротехнический университет «ЛЭТИ»
Установлено, что катиониты ВИОН КН-1, КУ-2, КУ-2-8чС, PUROLITE и аниониты ВИОН АН-1, ЭДЭ-10П, АВ-16-ГС, АВ-17-2П, АН-12П, АМ 21А, IMAC-HP могут применяться в качестве носителей для иммобилизации инулиназы. Выявлено, что для препарата инулиназы, выделенного из Helianthus tuberosus, оптимальным оказался катионит КУ-2, сорбция на котором позволила сохранить около 80 % первоначальной активности энзима. Показано, что адсорбция инулиназы на катионитах КУ-2 и КУ-2-8чС происходит преимущественно за счет электростатических связей положительно заряженных аминокислотных остатков фермента с сульфогруппой катионита, а также за счет образования водородных связей. Продемонстрировано, что связывание энзима с матрицами анионитов марок ЭДЭ-10П и АН-12П осуществляется в основном за счет электростатических связей отрицательно заряженных аминокислотных остатков инулиназы со вторичными и третичными аминогруппами носителей. Установлено, что при адсорбции инулиназы из Helianthus tuberosus на всех исследуемых ионитах происходит уменьшение количества нерегулярных участков в белковой глобуле, причем какой-либо корреляции между процентом сохранения активности иммобилизованного препарата по сравнению со свободным и структурными перестройками спиралей, слоев и неупорядоченных участков не наблюдается. Выдвинуто предположение о том, что механизмы взаимодействия инулиназы с матрицей катионитов и анионитов принципиально отличаются друг от друга: в процессе адсорбции принимают участие разные участки белковой глобулы, что обусловливает отличающиеся по своей природе конформационные перестройки в молекуле энзима.
инулиназа
иммобилизация
катиониты
аниониты
ИК-спектроскопия
1. Абелян В.А. Иммобилизация микробной инулиназы на различных носителях / В.А. Абелян, Л.С. Манукян // Прикладная биохимия и микробиология. – 1992. – Т. 28, № 3. – С. 356–361.
2. Бруцкус Т.К. Иониты. Каталог / Т.К. Бруцкус, Е.В. Замбровская, И.В. Самборский. – Черкассы, 1975. – 36 с.
3. Инфракрасная спектроскопия ионообменных материалов / В.А. Углянская [и др.]. – Воронеж: Изд-во Воронежского государственного университета, 1989. – 208 с.
4. Лурье А.А. Сорбенты и хроматографические носители. – М. : Химия, 1972. – 320 с.
5. Отто М. Современные методы аналитической химии: в 2 т. Т.1. – М.: Техносфера, 2003. – 416 с.
6. Сливкин А.И. Физико-химические и биологические методы оценки качества лекарственных средств / А.И. Сливкин, В.Ф. Селеменев, Е.А. Суховерхова. – Воронеж: Изд-во Воронежского государственного университета, 1999. – 368 с.
7. Холявка М.Г. Исследование структурно-функциональных свойств гомогенных и гетерогенных биокатализаторов на основе инулиназы: автореф. дис. ... канд. биол. наук. – Воронеж: ВГУ, 2010. 24 с.
8. Adsorption of the inulinase from Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 on Streamline DEAE resin / Y. Makino [et al.] // Brazilian Journal of Chemical Engineering. – 2005. – Vol. 22, № 4. – P. 539–545.
9. Allais J. Continuous production of ethanol with Zymomonas mobilis growing on Jerusaleum artichoke juice / J. Allais, E. Torres // Biotechnol. and Bioeng. – 1987. – Vol. 29, № 6. – P. 778–782.
10. Bienzyme amperometric biosensor using gold nanoparticle-modified electrodes for the determination of inulin in foods / J. Manso [et al.] // Anal. Biochem. – 2008. – Vol. 375, № 2. – P. 345–353.
11. Immobilization of recombinat inulase II from a genetically modified Escherichia coli strain / D. Letca [et al.] // Roum. Biotechnol. Lett. – 2004. – Vol. 9, № 5. – P. 1879–1886.
12. Kalil S.J. Ion exchange expanded bed chromatography for the purification of an extracelular inulinase from Kluyveromyces marxianus / S.J. Kalil, F. Maugeri, M.I. Rodrigues // Process Biochemistry. – 2005. – Vol. 40. – P. 581–586.
13. Letca D. Production of di-D-Fructofuranose 1,2´:2,3´ Dianhydride (DFA III) using Recombinant Inulase II: dissertation / D. Letca. – Bukarest, 2004. – 175 c. – URL: http://deposit.d-nb.de/cgi-bin/dokserv?idn = 970064837&dok_var = d1&dok_ext = pdf &filename = 970064837.pdf (дата обращения: 1.12.2012).
14. Process for producing the potential food ingredient DFA III from inulin: screening, genetic engineering, fermentation and immobilisation of inulase II / U. Jahnz [et al.] // Int. J. Pharm. – 2003. – Vol. 256, № 1. – P. 199–206.
15. Production, thermal stability and immobilisation of inulinase from Fusarium oxysporum / A.K. Gupta [et al.] // J. Chem. Technol. Biotechnol. – 1990. – Vol. 47, № 3. – P. 245–257.
16. Silva F.R. Adsorption of inulinases in ion-exchange columns / F.R. Silva, C.C. Santana // Appl. Biochem. Biotechnol. – 2000. – Vol. 84. – P. 1063–1078.
17. Sucrose hydrolysis by gelatin-immobilized inulinase from Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus / F.C. de Paula [et al.] // Food Chem. – 2008. – Vol. 111. – P. 691–695.

Особое значение в настоящее время приобретают исследования процесса иммобилизации инулиназы (КФ 3.2.1.7), которая может применяться в производстве углеводных продуктов диетического назначения. Ферменты, связанные с носителями за счет химических или физических взаимодействий, имеют ряд существенных технологических преимуществ по сравнению с их растворимыми предшественниками:

1) иммобилизованные энзимы представляют собой гетерогенные катализаторы, которые легко отделить от реакционной среды, что позволяет остановить реакцию, использовать катализатор повторно, а также получить продукт, не загрязненный ферментом;

2) гетерогенные катализаторы позволяют проводить процесс непрерывно (например, в проточных реакторах) и регулировать скорость катализируемой реакции (или выход продукта) скоростью потока;

3) иммобилизация позволяет направленно изменять свойства фермента: его специфичность, особенно в отношении макромолекулярных субстратов; зависимость активности от pH среды; стабильность к денатурирующим воздействиям.

Большое внимание исследователи уделяют проблемам подбора и модификации носителей, разработке методов иммобилизации, изучению кинетических аспектов катализа гетерогенными ферментными препаратами. Актуальным вопросом является исследование механизма образования комплекса инулиназа-носитель.

Y. Makino et al. (2005) осуществили адсорбцию инулиназы из Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 на анионите Streamline DEAE [1].

A.K. Gupta et. al. (1990) показали, что инулиназа из Fusarium oxysporum, включенная в полиакриламидный гель, сохраняет более 45 % исходной активности при температуре 45 °С и рН 6,2 (оптимумы нативного энзима соответственно 37 °С и рН 6,0) [2].

S.J. Kalil et al. (2005) изучали адсорбцию инулиназы из Kluyveromyces marxianus на катионообменной смоле Streamline S.P., В.А. Абелян и Л.С. Манукян (1992) – на матрице полисахаридных носителей, которые изготавливали на основе крахмала, инулина, а также смеси этих полимеров с β-циклодекстрином. J. Allais et. al. (1987) осуществили иммобилизацию инулиназы на хитине с помощью глутарового альдегида и получили биокатализатор для производства этанола из инулинсодержащего сырья [3–5].

Инулиназу из Arthrobacter species успешно сорбировали на анионообменных смолах. Аналогичную операцию провели для рекомбинантных белков из Escherichia coli/pMSiftOptR и Escherichia coli/pMSiftOptWT. При иммобилизации инулиназы из Escherichia coli/pMSiftOptR на Duolite A561, Duolite A568, Amberlite IRA67 и Amberlite IRA 94S выявлялся следующий процент сохранения активности: 4,5; 20,6; 1,7 и 19,8 % соответственно. При сорбции фермента из Escherichia coli/pMSiftOptWT – 4,2; 19,3; 1,6 и 19,0 % [6, 7].

Были попытки включить инулиназы из Escherichia coli/pMSiftOptRM и Arthrobacter ureafaciens ATCC 21124 в альгинатный гидрогель. F.R. Silva и C.C. Santana (2000) осуществили адсорбцию инулиназы (из препарата Fructozyme) в ионообменной колонке, используя два типа носителей – катионит и анионит. Иммобилизованная на желатине инулиназа из Kluyveromyces marxianus var. bulgaricus применялась для гидролиза сахарозы с целью получения фруктозных сиропов [8–10].

J. Manso et al. (2008) создали биосенсор на основе иммобилизованных фруктозодегидрогеназы и инулиназы на золотых наночастицах цистеамина для определения содержания инулина в пище. Минимальная концентрация инулина, определяемая биосенсором – 6,6∙10–7 моль/л. Сенсор проявлял высокую селективность по отношению к другим углеводам [11].

Изучение путей стабилизации инулиназы методом иммобилизации, а также выявление условий получения и применения гетерогенных биокатализаторов и биосенсоров на ее основе дадут возможность расширить наши представления о процессе ферментативного гидролиза полисахаридов и усовершенствовать существующие технологические пути получения фруктозы, так как реализация перспектив применения ферментов в различных областях науки и техники связана с получением именно иммобилизованных на нерастворимых носителях энзимов.

В связи с вышесказанным целью работы было исследование механизма взаимодействия молекулы инулиназы с матрицей ряда синтетических ионитов и выяснение типа связей между названными системами.

Материалы и методы исследования

Объектом исследований являлась инулиназа, выделенная из клубней Helianthus tuberosus на кафедре биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета Методики выделения и очистки этого фермента, определения активности и содержания белка, подготовки носителей и иммобилизации инулиназы подробно описаны в [12].

К соединениям, применяемым в качестве носителей белков, предъявляются высокие требования: с одной стороны, молекула фермента должна находиться в комфортных условиях, не претерпевая при этом никаких структурно-функциональных изменений, с другой – она должна быть прикреплена к матрице необратимо. Иммобилизованные ферменты, используемые в пищевой и фармацевтической промышленности, кроме вышеперечисленных парамет­ров, должны отвечать жестким санитарно-гигиеническим нормам. Поэтому в качестве носителей для иммобилизации инулиназы мы применяли катиониты ВИОН КН-1, КУ-2, КУ-2-8чС, PUROLITE и аниониты ВИОН АН-1, ЭДЭ-10П, АВ-16-ГС, АВ-17-2П, АН-12П, АМ 21А, IMAC-HP. Необходимо отметить, что некоторые из них были отходами производства, проработавшими в условиях осветления сахара-рафинада, циклах очистки воды или при получении аминокислот, и не могли быть полностью регенерированы и далее использоваться в промышленной технологии.

Регистрацию ИК-спектров осуществляли с помощью спектрометра Bruker Vertex-70 (Германия). Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5 % с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Для создания гетерогенных ферментных препаратов промышленного назначения целесообразнее применять не гомогенные, а частично очищенные фракции, поэтому мы использовали инулиназу из Helianthus tuberosus со степенью очистки 14,0.

Каталитическая активность фермента определяется степенью мобильности белковой молекулы. Даже при небольших изменениях конформации полипептидной цепи у энзимов способность к катализу резко изменяется. Адсорбционное присоединение фермента к носителю приводит к ослаблению функциональных свойств катализатора по сравнению с нативным белком. Уменьшение активности иммобилизованных препаратов также может быть обусловлено экранированием доступа молекул субстрата к активному центру фермента.

Для препарата инулиназы, выделенного из Helianthus tuberosus, оптимальным оказался катионит КУ-2, сорбция на котором позволила сохранить около 80 % первоначальной активности энзима (рис. 1).

pic_109.tif

Рис. 1. Процент сохранения активности иммобилизованной инулиназы из Helianthus tuberosus

Для исследования структурных изменений в молекуле инулиназы и изучения механизма адсорбции фермента на ионообменных смолах и волокнах синтетического происхождения использовали метод ИК-спектроскопии.

Мы попытаемся выявить структурные перестройки, происходящие в ходе процесса адсорбции как в молекуле фермента, так и в матрице носителей. Для начала рассмотрим сульфостирольный катонит КУ-2, который относится к сульфокатионитам полимеризационного типа, получаемым сульфированием гранульного сополимера стирола с дивинилбензолом. Катионит имеет гелевую структуру, содержит только один вид функциональных групп – сульфогруппу –SO3H. Очень интенсивным в спектре водородной формы катионита КУ-2 является поглощение в области 1250–1125 см–1, обусловленное валентными колебаниями функциональной группы – SO3H (рис. 2). Наблюдается и ряд других полос поглощения: 3500–3300 см–1 обусловлены валентными колебаниями группы –OH в –SO3H и –OH в H2O; 2930–2850 см–1 – асимметричными и симметричными колебаниями групп > CH– и –CH2–; 1640–1615 см–1 – колебаниями бензольного кольца с различным типом замещения и деформационными колебаниями –OH гидратной воды; 1605–1500 см–1 – валентными колебаниями связи C = C бензольного кольца; 1460–1420 см–1 – деформационными колебаниями групп > CH– и –CH2–; 1350–1330 см–1 – валентными колебаниями S = O в –SO3H; 1220–1120 и 1050–1000 см–1 – валентными колебаниями сульфогруппы; 907–900 см–1 – асимметричными колебаниями связи S = O в –SO3H; 830, 780 см–1 – внеплоскостными деформационными колебаниями CH дизамещенного бензольного кольца; 625, 570 см–1 – колебаниями C–S сульфогруппы, связанной с бензольным кольцом (n- и o-замещение) [15].

Так как ряд полос поглощения ионита КУ-2 перекрывается с полосами поглощения препарата инулиназы из Helianthus tuberosus, то для того чтобы оценить изменения, происходящие в структуре носителя, мы анализировали не ИК-спектр ионита с иммобилизованным ферментом, а дифференциальный спектр, полученный путем вычитания значений коэффициента поглощения α для инулиназы из значений α для носителя с иммобилизованным на нем энзимом (рис. 3). Аналогичной обработке мы подвергали ИК-спектры других ионитов.

pic_110.tif

Рис. 2. ИК-спектр инулиназы из Helianthus tuberosus в свободном состоянии (1) и при иммобилизации на КУ-2 (3): 2 – спектр катионита КУ-2. Здесь и на рис. 3–11 α – коэффициент поглощения инулиназы

pic_111.tif

Рис. 3. ИК-спектр катионита КУ-2 до (1) и после (2) иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus

На полученном таким образом спектре мы наблюдали наличие новых пиков (по сравнению с ИК спектром КУ-2): 1165–1135 и 898 см–1, указывающих на то, что некоторое количество сульфогрупп находится в недиссоциированном состоянии [15]. Насыщение сульфокатионитов ионами аминокислот должно приводить к вырождению колебаний группы –SO3H и расщеплению максимума в области 1220 см–1, что мы и видим на ИК-спектре. Происходит изменение формы и интенсивности пика в области 3500–3300 см–1, что, вероятно, указывает на образование небольшого количества водородных связей между поверхностными аминокислотами молекулы инулиназы и матрицей носителя.

Можно с высокой долей вероятности утверждать, что адсорбция инулиназы на КУ-2 происходит за счет электростатических связей положительно заряженных аминокислотных остатков фермента с сульфогруппой катионита, а также за счет образования водородных связей.

Аналогичные изменения происходят в ИК-спектре КУ-2-8чС (рис. 4), поэтому очевидно, что связывание инулиназы с матрицей носителя происходит по тому же механизму, что и для КУ-2.

Элементарные ячейки анионитов марок ЭДЭ-10П и АН-12П содержат в основном вторичные и третичные аминогруппы, которые характеризуются поглощением электромагнитного излучения в области 3400–3200 и 1650–1600 см–1. После иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus на ЭДЭ-10П на ИК-спектре носителя уменьшается интенсивность полосы 3400–3200 см–1, а полоса 1650–1600 см–1 совсем исчезает, что, вероятно, связано с тем, что ко вторичным и третичным аминогруппам ионита присоединяются отрицательно заряженные аминокислотные остатки молекулы фермента. После адсорбции ферментного препарата из Helianthus tuberosus на матрице АН-12П на ИК-спектре носителя также уменьшается интенсивность полосы 3400–3200 см–1, а полоса 1650–1600 см–1 в некоторой степени меняет свою форму, что указывает на сходный с ЭДЭ-10П механизм взаимодействия ионита с молекулой инулиназы (рис. 5 и 6).

pic_112.tif

Рис. 4. ИК-спектр катионита КУ-2-8чС до (1) и после (2) иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus

pic_113.tif

Рис. 5. ИК-спектр анионита ЭДЭ-10П до (1) и после (2) иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus

pic_114.tif

Рис. 6. ИК-спектр анионита АН-12П до (1) и после (2) иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus

Сорбция анионов аминокислот сопровождается появлением в ИК-спектрах ионита значительно большего количества абсорбционных полос в области 3700–3200 см–1. При иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus на КУ-2 подобного эффекта мы не наблюдали (рис. 7), однако пик в данной области после связывания носителя с ферментом был более выражен. В рассматриваемом случае взаимодействие растворителя возможно как вблизи ионной пары –N + (CH3)3|–OOC (максимум при 3660–3500 и при 3460–3330 см–1), так и с концевыми полярными группами (–NH2, –COOH) аминокислот при 3290–3213 см–1.

pic_115.tif

Рис. 7. ИК-спектр канионита КУ-2 до (1) и после (2) иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus

pic_116.tif

Рис. 8. ИК-спектр инулиназы из Helianthus tuberosus до (1) и после (2) иммобилизации на катионите КУ-2

pic_117.tif

Рис. 9. ИК-спектр инулиназы из Helianthus tuberosus до (1) и после (2) иммобилизации на катионите КУ-2-8чС

Так как ряд полос поглощения инулиназы и ионитов перекрываются друг с другом, для того чтобы оценить изменения, происходящие в структуре фермента, мы анализировали не ИК-спектр иммобилизованного энзима, а дифференциальный спектр, полученный путем вычитания значений коэффициента поглощения α для ионита из значений α для носителя с иммобилизованным на нем белком. При иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus на КУ-2, КУ-2-8чС, ЭДЭ-10, АН-12П мы наблюдали изменение формы и снижение интенсивности пиков в областях 3000–2800, 1049 и 868 см–1, соответствующих зоне поглощения алифатических аминокислотных остатков. Модификации аналогичного рода происходят и в полосах амид I (1690–1630 см–1) и амид II (1560–1520 см–1), что может указывать на формирование более плотно упакованного гидрофобного ядра по сравнению с нативной формой фермента, что, вероятно, и является основной причиной снижения каталитической активности препарата после иммобилизации (рис. 8–11).

pic_118.tif

Рис. 10. ИК-спектр инулиназы из Helianthus tuberosus до (1) и после (2) иммобилизации на анионите ЭДЭ-10П

pic_119.tif

Рис. 11. ИК-спектр инулиназы из Helianthus tuberosus до (1) и после (2) иммобилизации на анионите АН-12П

При сорбции инулиназы из Helianthus tuberosus на КУ-2 и КУ-2-8чС (рис. 8 и 9) мы наблюдали исчезновение пика фермента в области 3400–3200 см–1, характеризующего колебания NH2-групп. Этот факт, по всей вероятности, связан с тем, что боковые аминогруппы лизина, аргинина и гистидина успешно провзаимодействовали соответственно с сульфо- и карбоксильными группами катионитов и образовали множественные электростатические взаимодействия.

Изменения в полосах амид III (1255 см–1) и амид IV (1050 см–1) в модифицированных спектрах препарата инулиназы из Helianthus tuberosus, иммобилизованного на КУ-2, КУ-2-8чС и АН-12П (рис. 8, 9, 11), вероятно, свидетельствуют о значительных структурных перестройках в молекуле фермента.

При иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus на АН-12П (рис. 11) мы наблюдали снижение интенсивности и изменение формы и максимумов пиков в области колебаний СН-групп ненасыщенных и ароматических соединений (2100–3000 см–1), что может быть обусловлено существенными перестройками в глобуле белка.

Выше нами было показано, что связывание инулиназы с матрицами различных носителей происходит в основном за счет электростатических взаимодействий. Анализируя ИК-спектры свободных и иммобилизованных ферментов, мы попытались установить роль водородных связей в процессе адсорбции.

Полоса поглощения 3700–3500 см–1 соответствует свободной ОН-группе в парах вещества. Уменьшение этих значений указывает на взаимодействие ОН-группы, например, по типу водородной связи ОН···О. Чем прочнее водородная связь, тем ниже частота колебаний; может наблюдаться также расширение полосы [16, 17].

Смещения пиков свободной ОН-группы в область более низких значений частоты колебаний или усиления полосы поглощения в спектрах иммобилизованных инулиназ по сравнению со свободными не наблюдалось, что позволяет нам сделать предположение о том, что водородная связь не является ведущей при связывании молекулы фермента с матрицей носителей.

Только в одном случае было обнаружено смещение пиков свободной ОН-группы в область более низких значений частоты колебаний – при иммобилизации инулиназы из Helianthus tuberosus на АН-12П (рис. 11), что может свидетельствовать о значительной роли водородной связи при формировании комплекса «фермент-носитель».

Далее мы исследовали степень изменения вторичной структуры для инулиназы из Helianthus tuberosus при их адсорбции на синтетических ионообменных смолах и волокнах (таблица).

Содержание типов вторичной структуры в молекуле инулиназы из Helianthus tuberosus в свободном и иммобилизованном состояниях

Конформация

Содержание структуры в нативной инулиназе, %

Содержание структуры в иммобилизованной инулиназе, %

на АВ-17-2П

на КУ-2

на КУ-2-8чС

на АН-12П

на ЭДЭ-10

a-спираль

25,5

28

46

45

40

43

b-слои

37

39

25

26

41

23

Неупорядоченная структура

37,5

33

29

29

19

34

При адсорбции инулиназы из Helianthus tuberosus на всех исследуемых носителях мы наблюдали уменьшение количества нерегулярных участков в белковой глобуле, причем какой-либо корреляции между процентом сохранения активности иммобилизованного препарата по сравнению со свободным и структурными перестройками a-спиралей, b-слоев и неупорядоченных участков мы не обнаружили.

Выводы

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о том, что механизмы взаимодействия инулиназы с матрицей катионо- и анионообменников принципиально отличаются друг от друга: в процессе адсорбции принимают участие разные участки белковой глобулы и в результате происходят различные конформационные перестройки в молекуле энзима. Можно заключить, что процесс адсорбции для каждого исследуемого носителя протекает по сложному индивидуальному механизму и трудно прогнозировать структурные изменения в молекуле фермента в зависимости от химической природы матрицы сорбента, с которым он взаимодействует.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009–2013 годы» (Соглашение о предоставлении гранта № 14.В37.21.2080 от 14.11.2012).

Рецензенты:

Епринцев А.Т., д.б.н., профессор, зав. каф. биохимии и физиологии клетки Воронежского государственного университета, г. Воронеж;

Попова Т.Н., д.б.н., профессор, зав. каф. медицинской биохимии и микробиологии Воронежского государственного университета, г. Воронеж.

Работа поступила в редакцию 19.02.2013.


Библиографическая ссылка

Холявка М.Г., Ковалева Т.А., Артюхов В.Г., Карпов С.И., Середин П.В., Богачев М.И. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МОЛЕКУЛЫ ИНУЛИНАЗЫ С МАТРИЦЕЙ СИНТЕТИЧЕСКИХ ИОНИТОВ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 4-3. – С. 663-671;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=31252 (дата обращения: 21.10.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074