Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,222

ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ in vitro

Осиков М.В. 1 Григорьев Т.А. 2 Федосов А.А. 1
1 ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России»
2 ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница»
В экспериментальных условиях in vitro с использованием крови клинически здоровых людей-добровольцев и больных хронической почечной недостаточностью, имеющих дефицит эндогенного эритропоэтина (ЭПО), исследовано влияние различных доз ЭПО на функциональную активность тромбоцитов по показателям АДФ-индуцированной агрегации и состояние плазменных протеолитических систем, участвующих в гемостазе – фибринообразования, фибринолиза и противосвертывания. ЭПО применяли в концентрациях 30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/л, что соответствует 200, 100, 50, 25, 12,5 % от его нормальной концентрации в сыворотке. Установлено, что ЭПО ускоряет АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов, полученных от клинически здоровых людей-добровольцев и больных хронической почечной недостаточностью. При этом скорость агрегации тромбоцитов увеличивается по мере снижения дозы ЭПО от 30 до 1,88 МЕ/л. Добавление ЭПО к плазме клинически здоровых людей-добровольцев угнетает систему фибринолиза и оказывает гипокоагуляционный эффект с заинтересованностью факторов внешнего и внутреннего пути в диапазоне доз от 1,88 до 30 МЕ/л.
эритропоэтин
гемостаз
тромбоциты
свертывание крови
1. Захаров Ю.М. Цитопротекторные функции эритропоэтина // Клиническая нефрология. – 2009. – № 1. – С. 16–21.
2. Осиков М.В. Церулоплазмин устраняет нарушения гемостаза при экспериментальной гипераммониемии / М.В. Осиков, Е.В. Макаров, Л.В. Кривохижина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2006. – Т. 142, № 10. – С. 396–399.
3. Осиков М.В. Анализ эфферентных свойств церулоплазмина и альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном перитоните / М.В. Осиков, Л.В. Кривохижина, А.В. Мальцев // Эфферентная терапия. – 2006. – Т. 12, № 4. – С. 36–39.
4. Осиков М.В. Гемостазиологические эффекты альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном септическом перитоните / М.В. Осиков, Е.В. Макаров, Л.В. Кривохижина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 8. – С. 143–145.
5. Осиков М.В. Влияние альфа-1-кислого гликопротеина на процессы свободнорадикального окисления при экспериментальной печеночной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 7. – С. 29–31.
6. Осиков М.В. Реактивные изменения клеточно-гуморальной системы организма как типовой патологический процесс и его регуляция реактантами острой фазы: автореф. дис.... д-ра мед. наук. – Челябинск, 2008. – 44 с.
7. Осиков М.В. Роль орозомукоида в регуляции активности систем плазменного протеолиза при экспериментальной почечной недостаточности / М.В. Осиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 148, № 7. – С. 27–30.
8. Осиков М.В. Анализ гематологических эффектов эритропоэтина у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на диализе / М.В. Осиков, К.В. Ахматов, Л.В. Кривохижина, В.Ю. Ахматов // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. – 2009. – № 20 (153). – С. 79–82.
9. Осиков М.В. Роль эритропоэтина в коррекции нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 9–3. – С. 462–466.
10. Осиков М.В. Влияние эритропоэтина на активность систем плазменного протеолиза при экспериментальной почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – Т. 153, № 1. – С. 27–30.
11. Осиков, М.В. К вопросу о механизме влияния эритропоэтина на аффективный статус у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, К.В. Ахматов, А.А. Федосов // Фундаментальные исследования. – 2012. – № 7–1. – С. 140–145.
12. Осиков, М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов, Козочкин Д.А., Ильиных М.А. // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6. – С. 195–199.
13. Osikov, M.V. Effects of α1-acid glycoprotein on hemostasis in experimental septic peritonitis / M.V. Osikov, E.V. Makarov, L.V. Krivokhizhina // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. – 2007. – № 2. – Р. 178–180.

Актуальной проблемой медицины является расшифровка механизма действия биологически активных веществ эндогенного происхождения, способных выступать в роли мультипотентных регуляторов гомеостаза. Ранее нами убедительно продемонстрирована роль белков острой фазы церулоплазмина и альфа-1-кислого гликоапротеина в регуляции активности единой клеточно-гуморальной защитной системы организма [2-7, 13]. В последние годы объектом пристального внимания многих отечественных и зарубежных исследователей выступает эритропоэтин [1]. Нами показано участие эритропоэтина (ЭПО) в коррекции аффективного статуса у больных хронической почечной недостаточностью [11]. По нашим данным, ЭПО снижает выраженность геморрагического синдрома у больных хронической почечной недостаточностью, регулирует функциональную активность тромбоцитов и плазменных протеолитических систем при хронической почечной недостаточности (ХПН) в клинических и экспериментальных условиях [8–10, 12]. Возникает вопрос о возможности регуляторного влияния ЭПО на активность тромбоцитов и плазменных систем гемостаза и антигемостаза в интактных условиях вне зависимости от наличия патологии. Цель работы – исследовать влияние ЭПО на функциональную активность тромбоцитов и плазменных систем гемостаза и антигемостаза в экспериментальных условиях in vitro.

Материалы и методы исследования

Для реализации поставленной цели использована цельная кровь 96 клинически здоровых добровольцев-доноров Челябинской областной станции переливания крови и 30 больных ХПН, не принимающих ЭПО, находящихся на лечении гемодиализом в ГБУЗ ЧОКБ. Стабилизацию крови осуществляли 3,8 % раствором цитрата натрия в соотношении 1:5 для исследований агрегации тромбоцитов и 1:9 – для исследований коагуляционного гемостаза. ЭПО в форме препарата «Рекормон» (МНН: эпоэтин бэта, «Roche», Швейцария) применяли в концентрациях 30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/л, что соответствует 200, 100, 50, 25, 12,5 % от его нормальной концентрации в сыворотке. После добавления ЭПО плазму инкубировали в условиях термостата при температуре 37 °С в течение 30 мин. АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали с помощью двуканального лазерного анализатора агрегации тромбоцитов «LA-230» (Россия). Для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП) кровь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Затем получали бедную тромбоцитами плазму (БТП), для чего остаток центрифугировали в течение 15 минут, при 4500 об/мин. Смешиванием ОТП и БТП получали тромбоцитарную плазму с концентрацией тромбоцитов 300∙109/л. В качестве индуктора агрегации использовали динатриевую соль АДФ в концентрации 0,109 М. Регистрировали амплитуду агрегации (%), время агрегации (мин), скорость агрегации (% мин). Для исследования коагуляционного гемостаза плазму получали путем центрифугирования цельной крови при 3000 об/мин в течение 15 мин. С использованием коагулометра «АПГ2-02» (Россия) определяли тромбиновое время (ТВ), активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), протромбиновое время (ПТВ), концентрацию фибриногена (ФГ) в плазме, активность антитромбина (АТ), XIIа-зависимый (хагеманзависимый) фибринолиз (ФЛ) с использованием реактивов фирмы «Технология-Стандарт» (Россия, Барнаул). Проверку статистических гипотез в группах проводили с использованием критериев Манна–Уитни, Вальда–Вольфовитца, Уилкоксона. Для выявления связи между изучаемыми параметрами использовали коэффициенты корреляции Спирмена (R) и Гамма.

Результаты исследования и их обсуждение

На первом этапе исследовали влияние ЭПО на агрегацию тромбоцитов, полученных от больных ХПН, т.к. при ХПН содержание ЭПО прогрессивно снижается, что позволяет исследовать функцию тромбоцитов в условиях дефицита эндогенного ЭПО и при добавлении к ним различных концентраций экзогенного ЭПО. Установлено, что ЭПО ускоряет агрегацию тромбоцитов во всех дозах, кроме максимальной (30 МЕ/л). Ускорение агрегации тромбоцитов достигается за счет уменьшения времени процесса, а не увеличения амплитуды, более того, амплитуда процесса при этом значимо уменьшается (табл. 1). Создается впечатление, что большие дозы ЭПО оказывают ингибирующий, а малые – стимулирующий эффект на реактивность тромбоцитов. Причем по мере уменьшения дозы скорость агрегации тромбоцитов нарастает. Для выявления дозозависимого эффекта ЭПО был использован корреляционный анализ в парах «доза» – «эффект», в качестве интегрального показателя «эффекта» ЭПО использована скорость агрегации. Установлено, что скорость агрегации тромбоцитов нарастает по мере снижения дозы ЭПО (коэффициент корреляции Спирмена R = −0,44; р < 0,05).

Таблица 1

Влияние ЭПО на показатели агрегации тромбоцитов больных ХПН (M ± m)

Показатели

Группы сравнения

Амплитуда агрегации, %

Время агрегации, мин

Скорость агрегации, %/мин

Группа 1 (n = 6)

тромбоциты + физ. р-р

62,50 ± 8,59

4,78 ± 0,76

14,66 ± 2,92

Группа 2

тромбоциты + ЭПО 30 МЕ/л (n = 6)

28,17 ± 2,75

p = 0,004

2,68 ± 0,96

16,03 ± 3,14

Группа 3

тромбоциты + ЭПО 15 МЕ/л (n = 6)

38,63 ± 5,12

p = 0,002

2,93 ± 1,03

23,52 ± 6,64

p = 0,02 (WW)

Группа 4

тромбоциты + ЭПО 7,5 МЕ/л (n = 6)

51,13 ± 2,17

2,02 ± 0,52

p = 0,02

34,31 ± 7,59

p = 0,02 (U)

Группа 5

тромбоциты + ЭПО 3,75 МЕ/л (n = 6)

44,1 ± 5,63

2,46 ± 1,04

41,84 ± 10,00

p = 0,04 (W)

Группа 6

тромбоциты + ЭПО 1,88 МЕ/л (n = 6)

71,23 ± 5,26

1,34 ± 0,22

p = 0,003

60,39 ± 8,51

p = 0,04 (W)

Примечание. Здесь и далее р – показатель значимости различий при сравнении с группой 1.

Для выявления эффекта ЭПО на функциональную активность тромбоцитов независимо от наличия патологии нами проведены аналитические эксперименты in vitro в условиях, аналогичных при исследовании уремических тромбоцитов (табл. 2). При этом ЭПО добавляли к интактным тромбоцитам, полученным от клинически здоровых добровольцев-доноров.

Как видно, ЭПО ускоряет агрегацию тромбоцитов при всех используемых дозах. Эффект ЭПО в одних случаях реализовался за счет увеличения амплитуды процесса, в других был связан с укорочением времени агрегации. С использованием непараметрического корреляционного анализа установлено, что скорость агрегации тромбоцитов нарастает по мере снижения дозы ЭПО (коэффициент корреляции Гамма = −0,23; р < 0,05).

Таблица 2

Влияние ЭПО на показатели агрегации тромбоцитов здоровых людей (M ± m)

Показатели

Группы сравнения

Амплитуда агрегации, %

Время агрегации, мин

Скорость агрегации, %/мин

Группа 1

тромбоциты + физ. р-р (n = 8)

107,40 ± 15,54

4,79 ± 0,92

25,89 ± 3,06

Группа 2

тромбоциты + ЭПО 30 МЕ/л (n = 8)

83,33 ± 4,79

p < 0,01

4,25 ± 1,06

p = 0,04

33,16 ± 8,11

p = 0,002

Группа 3

тромбоциты + ЭПО 15 МЕ/л (n = 8)

81,12 ± 9,35

2,29 ± 0,28

39,36 ± 5,75

р = 0,04

Группа 4

тромбоциты + ЭПО 7,5 МЕ/л (n = 8)

93,30 ± 7,36

2,30 ± 0,29

р = 0,01

42,90 ± 4,31

р = 0,01

Группа 5

тромбоциты + ЭПО 3,75 МЕ/л (n = 8)

78,30 ± 6,63

2,42 ± 0,64

p = 0,01

47,28 ± 8,30

p = 0,002

Группа 6

тромбоциты + ЭПО 1,88 МЕ/л (n = 8)

130,37 ± 23,13

р = 0,03

3,49 ± 0,84

p < 0,01

53,91 ± 12,27

р = 0,04

В аналитических условиях in vitro ЭПО изменял показатели коагуляционного гемостаза после 30-минутной инкубации с цельной кровью здоровых людей (табл. 3). Отмечено угнетение активности системы фибринолиза в связи с удлинением времени фибринолиза. Гипокоагуляционный эффект ЭПО обусловлен заинтересованностью факторов внешнего и внутреннего, т.к. наряду с укорочением тромбинового времени при всех используемых дозах, наблюдалось укорочение ПТВ во всех дозах кроме минимальной (1,88 МЕ/л), и укорочение АПТВ при добавлении ЭПО в дозе 7,5 и 30 МЕ/л. Дисперсионный однофакторный анализ позволил установить, что влияние ЭПО на показатели системы фибринообразования может составить (р < 0,05): для тромбинового времени не менее 21,54 % и не более 72,28 % от общего влияния всей суммы факторов; для протромбинового времени – не менее 19,94 % и не более 64,32 % от общего влияния всей суммы факторов.

Таким образом, ЭПО ускоряет агрегацию интактных и уремических тромбоцитов; скорость агрегации тромбоцитов увеличивается по мере снижения дозы ЭПО от 30 МЕ/л до 1,88 МЕ/л. Добавление ЭПО к интактной плазме угнетает систему фибринолиза и оказывает гипокоагуляционный эффект в диапазоне доз от 1,88 до 30 МЕ/л.

Таблица 3

Влияние ЭПО на активность систем плазменного протеолиза (M ± m)

Группы

Показатели

Группа 1

Кровь + физ. р-р

n = 8

Группа 2

Кровь + ЭПО

1,88 МЕ/л

n = 8

Группа 3

Кровь + ЭПО

3,75 МЕ/л

n = 8

Группа 4

Кровь + ЭПО

7,5 МЕ/л

n = 8

Группа 5

Кровь + ЭПО

15 МЕ/л

n = 8

Группа 6

Кровь + ЭПО

30 МЕ/л

n = 8

ТВ, с

14,65 ± 0,49

15,73 ± 0,35

р = 0,01

16,05 ± 0,65

р = 0,02

18,03 ± 1,05

р = 0,001

16,60 ± 0,85

р = 0,05

17,10 ± 0,70

р = 0,01

АПТВ, с

33,53 ± 0,68

33,30 ± 1,36

34,33 ± 1,66

40,18 ± 4,69

р = 0,05

33,20 ± 1,82

39,40 ± 1,44

р = 0,001

ПТВ, с

15,30 ± 0,59

15,63 ± 0,66

17,53 ± 1,05

р = 0,001

18,08 ± 0,99

р = 0,001

16,90 ± 0,78

р = 0,001

16,73 ± 0,68

р = 0,001

ФГ, г/л

3,16 ± 0,21

3,08 ± 0,28

2,83 ± 0,22

2,99 ± 0,24

3,03 ± 0,23

2,99 ± 0,25

ФЛ, мин

5,58 ± 0,17

4,90 ± 0,20

р = 0,001

5,05 ± 0,16

р = 0,001

4,90 ± 0,55

5,15 ± 0,06

р = 0,01

4,98 ± 0,21

р = 0,001

АТ, с

105,30 ± 2,63

111,43 ± 4,94

100,85 ± 5,59

109,88 ± 5,92

102,80 ± 5,83

109,57 ± 2,28

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 12-04-31726 «Механизм влияния эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов».

Рецензенты:

Абрамовских О.С., д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;

Цейликман В.Э., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 11.04.2013.


Библиографическая ссылка

Осиков М.В., Григорьев Т.А., Федосов А.А. ВЛИЯНИЕ ЭРИТРОПОЭТИНА НА АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ УСЛОВИЯХ in vitro // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 5-2. – С. 358-361;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=31620 (дата обращения: 17.07.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252