Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

АНТИОКСИДАНТНАЯ МОДУЛЯЦИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ESCHERICHIA COLI К ЦИПРОФЛОКСАЦИНУ

Мирошниченко А.Г. 1 Брюханов В.М. 1 Бутакова Л.Ю. 1 Госсен И.Е. 1 Перфильев В.Ю. 1 Смирнов П.В. 1
1 ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России
Проведено исследование влияния антиоксидантов (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, метилэтилпиридинол) в концентрациях 0,5, 1, 2 и 4 мМ на чувствительность трех штаммов Escherichia coli к ципрофлоксацину в сублетальных концентрациях. В качестве питательной среды использовали минеральную среду М9. Динамическое наблюдение за развитием штаммов проводились в течение 24 часов. Установлено, что аскорбиновая кислота и метилэтилпиридинол обладают слабым антибактериальным действием, сила которого прямо пропорциональна концентрациям антиоксидантов. Тиоловые антиоксиданты N-ацетилцистеин и восстановленный глутатион стимулируют развитие всех изучаемых штаммов. Выраженность пробактериального эффекта также прямо зависит от концентрации антиоксидантов. Полученные данные необходимо учитывать при назначении лекарственных средств с антиоксидантным типом действия, а также при проведении микробиологических исследований.
антиоксиданты
ципрофлоксацин
восстановленный глутатион
аскорбиновая кислота
N-ацетилцистеин
метилэтилпиридинол
Escherichia coli
1. Лакин Г.Ф. Биометрия: учеб. пособие для биол. спец. вузов – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: Высш. шк., 1990 – 352 с.
2. Мирошниченко А.Г., Брюханов В.М., Бутакова Л.Ю., Госсен И.Е., Перфильев В.Ю., Смирнов П.В. Влияние антиоксидантов на развитие чистой культуры Escherichia coli и ее чувствительность к гентамицину // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 5 (часть 2). – C. 339–343.
3. Яковлев В.П. Ципрофлоксацин — высокоэффективный препарат из группы фторхинолонов // Антибиотики и химиотерапия. – 1997. – № 11. – С. 69–71.
4. Dwyer D.J., Kohanski M.A., Collins J.J. Role of reactive oxygen species in antibiotic action and resistance // Curr. Opin. Microbiol. – 2009. – Vol. 12(5). – P. 482–489.
5. Kresse H., Belsey M.J., Rovini H. The antibacterial drugs market // Nat. Rev. Drug Discov. – 2007. – Vol. 6(1). – P. 19–20.

В связи с широким распространением инфекционных заболеваний, вызванных устойчивыми к антибактериальным средствам возбудителями, исследования, посвященные причинам развития и методам преодоления антибиотикорезистентности, являются актуальными.

Фторхинолоны обладают широким спектром антибактериальной активности [5]. Одной из привлекательных особенностей этого класса антибактериальных веществ является их способность оказывать быстрое бактерицидное действие, выраженность которого может сильно отличаться между различными производными. Ципрофлоксацин – один из наиболее эффективных фторхинолонов, нашедший широкое применение в клинической практике, что отразилось, в частности, в большом количестве наименований, под которыми он выпускается в разных странах [3].

Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка влияния некоторых антиоксидантов (восстановленный глутатион, N-ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, метилэтилпиридинол) на чувствительность штаммов кишечной палочки к ципрофлоксацину.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на трех штаммах Escherichia coli, депонированных на кафедре микробиологии с вирусологией Алтайского государственного медицинского университета: контрольный штамм ATCC 25922 (далее – штамм № 1); штамм, полученный из цервикального канала больной 22 лет, страдающей хроническим эндометритом (далее – штамм № 2); штамм, полученный из кала пациента 62 лет с диагнозом «дисбактериоз» (далее – штамм № 3). Идентификация микроорганизмов проводилась при помощи системы «ENTEROtest 16» (Erba Lachema s.r.o., Чехия) с использованием планшетного фотометра Multiskan-Ascent (Thermo Fisher Scientific Inc., Финляндия) и программного обеспечения «Микроб-Автомат». Из указанных штаммов готовили суточные культуры инкубацией на скошенном агаре при 35 °С, которые использовали для приготовления инокулятов – бактериальных суспензий в 0,9 % растворе хлорида натрия с оптической плотностью 1,0 по Мак-Фарланду. Перед инокуляцией методом разведения определяли минимальную подавляющую концентрацию ципрофлоксацина (МПК).

Для инкубации готовили смесь на основе минеральной питательной среды M9. В среду добавлялись изучаемые антиоксиданты (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, метилэтилпиридинол) до конечных концентраций 0,25, 0,5, 1, 2 и 4 мМ, а также ципрофлоксацин до сублетальной концентрации, составляющей 50 % ранее определенной МПК для каждого штамма в заданных условиях инкубации (приведены в табл. 1).

После инокуляции бактериальной суспензии смесь инкубировали в воздушном термостате при 35 °С в течение 24 часов. Для оценки развития штаммов использовали аппарат для определения оптической плотности бактериальных взвесей Densi-la-meter (Erba Lachema s.r.o., Чехия). Полученные данные сравнивали с данными контрольных инкубационных смесей, не содержащих антиоксиданты. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметического критерия Манна‒Уитни с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc., США), различия считали значимыми при P < 0,05 (в таблицах уровень статистической значимости указан в верхнем индексе после значения) [1].

Результаты исследования и их обсуждение

Введение в инкубационную среду сублетальных концентраций ципрофлоксацина, составляющих 50 % МПК для каждого из изучаемых штаммов, вызывает стойкое сдерживание роста бактериальных культур с нерезким увеличением оптической плотности на протяжении суток (табл. 1). Медленное увеличение бактериальной биомассы, по-видимому, обусловлено приобретением частичной резистентности к ципрофлоксацину отдельных бактериальных клеток.

Таблица 1

Влияние сублетальных концентраций ципрофлоксацина на развитие периодических культур Escherichia coli

Штамм

СЦИП, мг/л

Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме (25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду*

4 ч

8 ч

12 ч

24 ч

№ 1

0

0,3(0,3;0,3)

2,6(2,5;2,6)

4,2(4,1;4,2)

4,2(4,1;4,2)

0,035

0,2(0,2;0,2)0,002

0,2(0,2;0,2)0,001

0,3(0,3;0,4)0,002

0,6(0,4;0,7)0,002

№ 2

0

0,7(0,7;0,7)

4,1(4,0;4,2)

4,7(4,7;4,7)

4,3(4,3;4,4)

0,02

0,2(0,2;0,3)0,002

0,3(0,3;0,4)0,001

0,4(0,3;0,4)0,002

0,9(0,7;1,0)0,003

№ 3

0

0,6(0,6;0,7)

4,4(4,4;4,6)

4,7(4,7;4,8)

4,1(4,0;4,2)

0,04

0,4(0,4;0,5)0,002

0,7(0,7;0,8)0,002

0,8(0,7;0,8)0,002

0,8(0,7;0,8)0,002

Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры без ципрофлоксацина.

Аскорбиновая кислота не вызывает каких-либо закономерных изменений активности ципрофлоксацина в первые 8 часов эксперимента (табл. 2). При измерении оптической плотности бактериальной биомассы на 12 и 24 час становится заметным потенцирующее влияние антиоксиданта в наиболее высоких изучаемых концентрациях на действие антибактериального средства.

Более выраженно изменяет активность ципрофлоксацина восстановленный глутатион, пробактериальное действие которого становится заметным уже через 4 часа после начала инкубации (табл. 3). Исходя из суточного профиля развития бактериальных культур, можно сделать вывод о том, что указанный антиоксидант значительно уменьшает бактерицидное действие ципрофлоксацина (после инкубации в течение суток оптическая плотность инкубационных смесей при наиболее высоких концентрациях антиоксиданта превышает контрольные значения в 2–3 раза).

В связи с вышеописанными эффектами восстановленного глутатиона определенный интерес представляет собой соответствующий профиль влияния еще одного антиоксиданта, содержащего тиольную группу – N-ацетилцистеина. При сопоставлении данных табл. 3 и 4 становится очевидным сходное влияние двух антиоксидантов, проявляющееся как в факте самого пробактериального действия, так и в степени ответа каждой из изучаемых периодических культур на присутствие восстановленного глутатиона и N-ацетилцистеина. Отметим, что ранее нами были описаны неоднозначные эффекты антиоксидантов на развитие Escherichia coli: восстановленный глутатион в концентрациях 0,25–0,5 мМ стимулирует развитие бактерий, в концентрациях 2 и 4 мМ ‒ оказывает слабое угнетающее действие; N-ацетилцистеин во всех концентрациях снижает интенсивность развития бактериальных культур в отсутствии антибактериальных средств [2].

Таблица 2

Влияние аскорбиновой кислоты на активность ципрофлоксацина в отношении Escherichia coli

САО, мМ

Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме (25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду*

4 ч

8 ч

12 ч

24 ч

Штамм № 1

0,25 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,2)0,350

0,2(0,2;0,3)0,044

0,6(0,4;0,6)0,340

0,5 мМ

0,2(0,2;0,2)0,178

0,2(0,2;0,3)0,473

0,3(0,2;0,3)0,110

0,5(0,4;0,5)0,280

1 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,2)0,350

0,3(0,2;0,3)0,004

0,4(0,4;0,5)0,174

2 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,2)0,350

0,2(0,2;0,3)0,044

0,3(0,3;0,3)0,010

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,2)0,350

0,2(0,2;0,2)0,004

0,3(0,3;0,4)0,009

Штамм № 2

0,25 мМ

0,2(0,2;0,2)0,501

0,3(0,3;0,3)0,750

0,4(0,4;0,4)0,240

0,8(0,7;1,0)0,805

0,5 мМ

0,2(0,2;0,2)0,501

0,3(0,3;0,3)0,417

0,4(0,2;0,4)0,840

0,8(0,5;0,9)0,497

1 мМ

0,2(0,2;0,2)0,501

0,3(0,3;0,4)0,765

0,4(0,4;0,4)0,477

0,7(0,7;0,9)0,387

2 мМ

0,2(0,2;0,2)0,501

0,3(0,3;0,3)0,750

0,4(0,3;0,4)0,621

0,6(0,6;0,8)0,155

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,130

0,2(0,2;0,3)0,015

0,3(0,3;0,3)0,019

0,6(0,6;0,7)0,108

Штамм № 3

0,25 мМ

0,4(0,3;0,4)0,225

0,7(0,6;0,8)0,741

0,8(0,8;0,8)0,501

0,7(0,7;0,7)0,025

0,5 мМ

0,4(0,3;0,4)0,225

0,7(0,7;0,7)0,624

0,8(0,7;0,8)0,943

0,7(0,7;0,7)0,040

1 мМ

0,4(0,4;0,4)0,769

0,7(0,7;0,8)0,621

0,7(0,7;0,7)0,179

0,7(0,7;0,7)0,168

2 мМ

0,4(0,3;0,4)0,225

0,7(0,7;0,7)0,240

0,8(0,7;0,8)0,943

0,7(0,7;0,7)0,025

4 мМ

0,4(0,4;0,4)0,769

0,6(0,6;0,7)0,167

0,7(0,7;0,7)0,179

0,6(0,6;0,7)0,008

Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры в присутствии ципрофлоксацина (табл. 1).

Таблица 3

Влияние восстановленного глутатиона на активность ципрофлоксацина в отношении Escherichia coli

САО, мМ

Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме (25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду*

4 ч

8 ч

12 ч

24 ч

Штамм № 1

0,25 мМ

0,2(0,2;0,2)0,678

0,2(0,2;0,3)0,473

0,3(0,3;0,3)0,942

1,3(1,1;1,6)0,009

0,5 мМ

0,2(0,2;0,2)0,678

0,3(0,2;0,3)0,155

0,3(0,3;0,3)0,479

1,3(1,0;1,7)0,026

1 мМ

0,2(0,2;0,2)0,678

0,2(0,2;0,2)0,930

0,3(0,3;0,3)0,578

1,1(1,0;1,6)0,018

2 мМ

0,3(0,2;0,3)0,056

0,3(0,3;0,3)0,028

0,3(0,3;0,4)0,727

1,6(1,5;1,7)0,002

4 мМ

0,3(0,3;0,3)0,011

0,3(0,3;0,3)0,006

0,4(0,4;0,4)0,114

2,0(1,2;2,3)0,015

Штамм № 2

0,25 мМ

0,3(0,3;0,3)0,179

0,3(0,3;0,4)0,765

0,4(0,4;0,4)0,477

0,9(0,8;1,0)0,803

0,5 мМ

0,3(0,3;0,3)0,037

0,4(0,4;0,4)0,016

0,4(0,4;0,5)0,109

0,9(0,9;1,1)0,536

1 мМ

0,3(0,3;0,4)0,013

0,5(0,5;0,5)0,001

0,6(0,6;0,7)0,002

1,1(1,0;1,2)0,072

2 мМ

0,4(0,4;0,4)0,003

0,6(0,6;0,6)0,001

0,7(0,5;0,7)0,065

1,2(1,1;1,2)0,040

4 мМ

0,4(0,4;0,4)0,001

0,6(0,6;0,6)0,001

0,8(0,8;0,8)0,002

1,3(1,3;1,4)0,007

Штамм № 3

0,25 мМ

0,4(0,4;0,5)0,497

0,8(0,8;0,9)0,009

0,8(0,8;0,8)0,065

0,8(0,8;0,9)0,080

0,5 мМ

0,4(0,4;0,4)0,889

0,8(0,8;0,8)0,061

0,9(0,9;0,9)0,002

1,0(0,8;1,0)0,022

1 мМ

0,4(0,4;0,4)0,769

0,8(0,8;0,9)0,009

1,0(1,0;1,0)0,002

1,0(1,0;1,0)0,002

2 мМ

0,5(0,4;0,5)0,228

1,0(0,9;1,0)0,002

1,0(1,0;1,0)0,001

1,1(1,0;1,1)0,002

4 мМ

0,4(0,4;0,5)0,497

1,0(0,9;1,0)0,002

1,0(1,0;1,0)0,002

1,1(1,0;1,2)0,002

Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры в присутствии ципрофлоксацина (табл. 1).

Метилэтилпиридинол (синтетический антиоксидант, производное 3-оксипиридина), как и аскорбиновая кислота, усиливает действие ципрофлоксацина. Данный эффект становится статистически значимым через 12 часов после начала инкубации и сохраняется до окончания эксперимента. Указанный эффект с учетом степени угнетения развития культур можно охарактеризовать как слабый.

Таблица 4

Влияние N-ацетилцистеина на активность ципрофлоксацина в отношении Escherichia coli

САО, мМ

Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме (25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду*

4 ч

8 ч

12 ч

24 ч

Штамм № 1

0,25 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,2)0,350

0,3(0,3;0,4)1,000

0,7(0,5;0,9)0,456

0,5 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,3)0,473

0,4(0,3;0,4)0,282

1,0(0,7;1,2)0,292

1 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,2)0,930

0,4(0,3;0,4)0,378

1,5(0,7;1,9)0,040

2 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,3)0,473

0,4(0,3;0,4)0,557

2,0(1,4;2,3)0,003

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,3)0,930

0,3(0,3;0,4)0,578

2,5(2,3;2,7)0,002

Штамм № 2

0,25 мМ

0,3(0,2;0,3)0,525

0,4(0,3;0,4)0,313

0,4(0,4;0,5)0,109

0,9(0,7;0,9)0,853

0,5 мМ

0,2(0,2;0,2)0,501

0,3(0,3;0,4)0,765

0,5(0,5;0,5)0,004

0,8(0,8;1,0)0,901

1 мМ

0,2(0,2;0,3)0,943

0,3(0,3;0,3)0,750

0,4(0,4;0,5)0,109

0,9(0,8;1,2)0,621

2 мМ

0,3(0,2;0,3)0,525

0,4(0,3;0,4)0,313

0,6(0,6;0,7)0,002

1,2(1,1;1,2)0,094

4 мМ

0,3(0,3;0,3)0,179

0,4(0,4;0,4)0,016

0,6(0,6;0,7)0,002

1,2(1,2;1,2)0,039

Штамм № 3

0,25 мМ

0,4(0,4;0,4)0,769

0,8(0,7;0,8)0,270

0,8(0,8;0,8)0,130

0,8(0,8;0,8)0,455

0,5 мМ

0,4(0,4;0,4)0,769

0,8(0,8;0,9)0,041

0,9(0,9;0,9)0,002

0,9(0,8;0,9)0,035

1 мМ

0,4(0,4;0,4)0,889

0,8(0,8;0,9)0,009

0,9(0,9;0,9)0,002

0,9(0,9;0,9)0,013

2 мМ

0,5(0,5;0,5)0,082

0,9(0,9;0,9)0,015

1,0(1,0;1,0)0,002

1,2(1,0;1,2)0,002

4 мМ

0,5(0,5;0,5)0,082

1,0(0,9;1,0)0,002

1,1(1,1;1,1)0,002

1,1(1,1;1,2)0,002

Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры в присутствии ципрофлоксацина (табл. 1).

Таблица 5

Влияние метилэтилпиридинола на активность ципрофлоксацина в отношении Escherichia coli

САО, мМ

Оптическая плотность бактериальной биомассы, Ме(25 %;75 %)P, усл. ед. по Мак-Фарланду*

4 ч

8 ч

12 ч

24 ч

Штамм № 1

0,25 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,3(0,2;0,3)0,155

0,3(0,2;0,3)0,110

0,6(0,5;0,9)0,901

0,5 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,3(0,2;0,3)0,155

0,3(0,2;0,3)0,110

0,8(0,7;1,0)0,321

1 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,3(0,2;0,3)0,155

0,2(0,2;0,2)0,015

0,4(0,3;0,5)0,091

2 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,3(0,2;0,3)0,155

0,2(0,2;0,3)0,044

0,5(0,4;0,7)0,571

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,572

0,2(0,2;0,2)0,350

0,2(0,2;0,2)0,004

0,3(0,3;0,4)0,009

Штамм № 2

0,25 мМ

0,3(0,2;0,3)0,525

0,3(0,3;0,3)0,750

0,4(0,4;0,4)0,240

0,8(0,6;1,0)0,665

0,5 мМ

0,3(0,2;0,3)0,525

0,4(0,4;0,4)0,090

0,4(0,4;0,4)0,477

0,8(0,7;0,9)0,534

1 мМ

0,3(0,2;0,3)0,525

0,3(0,3;0,3)0,217

0,4(0,4;0,4)1,000

0,8(0,8;0,8)0,574

2 мМ

0,2(0,2;0,2)0,501

0,3(0,3;0,3)0,217

0,3(0,3;0,4)0,270

0,6(0,6;0,7)0,048

4 мМ

0,2(0,1;0,2)0,154

0,3(0,2;0,3)0,040

0,3(0,3;0,3)0,061

0,6(0,5;0,6)0,026

Штамм № 3

0,25 мМ

0,5(0,4;0,5)0,228

0,8(0,7;0,8)0,197

0,8(0,8;0,8)0,065

0,8(0,8;0,8)0,162

0,5 мМ

0,4(0,4;0,5)0,497

0,7(0,7;0,8)0,621

0,8(0,8;0,8)0,065

0,8(0,8;0,9)0,080

1 мМ

0,4(0,4;0,4)0,889

0,8(0,7;0,8)0,197

0,8(0,8;0,9)0,030

0,9(0,9;0,9)0,054

2 мМ

0,4(0,4;0,4)0,769

0,6(0,6;0,8)0,434

0,7(0,6;0,7)0,071

0,7(0,6;0,7)0,015

4 мМ

0,4(0,4;0,4)0,769

0,6(0,6;0,7)0,043

0,7(0,7;0,7)0,023

0,6(0,6;0,7)0,008

Примечание. * в верхнем индексе указана вероятность ошибки при вычислении различия с соответствующими данными развития культуры в присутствии ципрофлоксацина (табл. 1).

Представленные данные подтверждают тот факт, что наличие антиоксидантных свойств у вещества не определяет тип его влияния на активности антибактериального средства (в данном случае – ципрофлоксацина). Несмотря на то, что для фторхинолонов доказана ключевая роль усиления процессов свободнорадикального окисления в бактерицидном действии [4], в нашем исследовании обнаружены разнонаправленные эффекты антиоксидантов в отношении этого действия. По-видимому, вещества-антиоксиданты вызывают многоплановое действие за счет особенностей своего химического строения, касающееся не только окислительно-восстановительных процессов, но также других элементов метаболизма бактериальной клетки.

Выводы

Установлено, что аскорбиновая кислота и метилэтилпиридинол обладают слабым антибактериальным действием, сила которого прямо пропорциональна концентрациям антиоксидантов. Тиоловые антиоксиданты N-ацетилцистеин и восстановленный глутатион стимулируют развитие всех изучаемых штаммов. Выраженность пробактериального эффекта также прямо зависит от концентрации антиоксидантов. Полученные данные необходимо учитывать при назначении лекарственных средств с антиоксидантным типом действия, а также при проведении микробиологических исследований.

Рецензенты:

Карбышева Н.В., д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул;

Смирнов И.В., д.м.н., заведующий кафедрой фармакогнозии и ботаники, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул.

Работа поступила в редакцию 15.07.2013.


Библиографическая ссылка

Мирошниченко А.Г., Брюханов В.М., Бутакова Л.Ю., Госсен И.Е., Перфильев В.Ю., Смирнов П.В. АНТИОКСИДАНТНАЯ МОДУЛЯЦИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ESCHERICHIA COLI К ЦИПРОФЛОКСАЦИНУ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 7-3. – С. 584-588;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32060 (дата обращения: 14.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074