Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ АНАЛИЗА АНТИГЕННОГО СОСТАВА BORDETELLA BRONCHISEPTICA

Васильева Ю.Б. 1
1 ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина»
Целью данного исследования явилось проведение сравнительного анализа различных иммунохимических методов, отличающихся друг от друга технологическими приемами для выбора оптимальной схемы анализа антигенного состава B.bronchiseptica. Установили, что иммунохимические методы являются достаточно эффективными и позволяют в короткие сроки провести анализ антигенного состава B.bronchiseptica. Использование двойной радиальной иммунодиффузии позволяет обнаружить 5 антигенов B.bronchiseptica, 3 из которых дают перекрёстную реакцию с B.papapertussis, 2 – являются видоспецифичными. Встречный электрофорез не дает возможности провести видовую идентификацию антигенов B.bronchiseptica. Метод иммуноэлектрофореза выявляет 8 антигенных комплексов, 5 из которых являются видоспецифичными для B.bronchiseptica. В результате сравнительного анализа трех иммунохимических методов установили, что наиболее эффективным является иммуноэлектрофорез. Предлагаемая нами схема анализа антигенной структуры B.bronchiseptica включает: извлечение антигенов ультразвуковой дезинтеграцией, получение иммунной сыворотки гипериммунизацией лабораторных животных и проведение реакции иммуноэлектрофореза.
Bordetella bronchiseptica
бордетеллёз
лабораторная диагностика
иммунохимические методы
1. Иммунологические методы / Х. Фримель и др. - М.: Мир, 1979. – 515 с.
2. Иммунология и аллергология / А.А. Воробьев и др. - М.: Практическая медицина. - 2006. – 288 с.
3. Bedarida G. The detection of Australia antigen and anti-Au antibodies by a rapid procedure combining electrophoresis and immunoprecipitation / G. Bedarida, G. Trinchieri, A. Carbonara // Haematologica. – 1969. – Vol. 54. – P. 591.
4. Grabar P. Biochim. / P. Grabar, C. Williams // Biophys. Acta. – 1953. - Vol. 10. - P. 193.
5. Hоlby N. Cross-reactions between B. pertussis and twenty-eight other bacterial species / N. Hоlby, J.B. Hertz, V. Andersen // Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section B, Microbiology. – 1977. – Vol. 84. - № .6. – P. 395–400.
6. MacLennan A.P. Specific lipopolisaccharides of Bordetella / A.P. MacLennan // Biochem. J. – 1960. – Vol. 74. – P. 398–409.
7. Ouchterlony O. Act. Pathol / O. Ouchterlony // Microbiol. Scand. – 1948. – Vol. 25. – P. 186.
8. Ross R. Histamin-sensitizing Factor, Mouse-protective Antigens, and Other Antigens of Some Members of the Genus B.. / R. Ross, J. Munoz, C. Cameron // Journal of Bacteriology. – 1969. – Vol. 99. - P. 57–44.

В связи с тем, что возбудитель бордетеллеза, коклюшеподобного заболевания животных, в нашей стране недостаточно изучен, заслуживает внимания поиск эффективных методов анализа антигенной структуры B.bronchiseptica, а также разработка быстрых и точных методов выделения и идентификации инфекционного агента.

Большинство исследователей описывают эксперименты, касающиеся антигенных различий трех генетически близкородственных представителей бордетелл: B.bronchiseptica, B.pertussis и B.parapertussis. Зарубежными авторами в реакциях агглютинации и преципитации исследованы термолабильные токсины, капсульные агглютиногены, эндотоксины, гемагглютинин, гистамин-чувствительный фактор, идентифицированы 14 различных антигенов представителей рода Bordetella [4, 5, 6, 8].

R. Ross et al. в 1969 году исследовали антигенный состав B.bronchiseptica, B.pertussis и B.parapertussis с помощью методов диффузной преципитации в агаровом геле и иммуноэлектрофореза в барбитуратовом буфере. Авторы установили, что три антигена являются общими [8].

N. Hоlby et al. методом иммуноэлектрофореза регистрировали перекрестные реакции между антигенами B.bronchiseptica, B.parapertussis и B.pertussis в широком диапазоне [5].

Экспериментально A.P. MacLennan обнаружил, что липополисахарид, являющийся протективным антигеном, в реакциях микроагглютинации и радиальной иммунодиффузии по O. Ouchterlony был идентичен таковым, выделенным из бактерий кишечной группы [6].

Несогласованность данных различных авторов и отсутствие стандартных методик изучения антигенного состава B.bronchiseptica подтолкнуло нас к проведению исследований в этом направлении. Целью работы явилось проведение сравнительного анализа трех различных иммунохимических методов, отличающихся технологическими приемами.

Материалы и методы исследования

Научные исследования проводились при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 годы (соглашение № 8267 от 10.08.2012). Работа выполнена в лабораториях кафедры МВЭиВСЭ ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина» и ООО «Медицинский Центр «Академия» (г. Ульяновск) совместно с научным сотрудником А.В. Мастиленко.

В работе были использованы референс-штаммы из коллекции музея вышеуказанной кафедры B.bronchiseptica, B.parapertussis, P.aeruginosa, P.putida, A.hydrophila, E.coli, Y.enterocolytica, Y.pseudotuberculosis, O.rhinotracheale, S.pyogenes, S.epidermidis, L acidophilus, S.aureus, B.subtilis и 52 штамма B.bronchiseptica, выделенных из клинических образцов биоматериала от животных.

Схемы получения антигенов и гипериммунных сывороток были подобраны экспериментальным путем. Для получения иммунных сывороток проводили гипериммунизацию 15-ти кроликов. Получение антигенов B.bronchiseptica проводили с помощью ультразвукового дезинтегратора, встречный электрофорез по схеме, описанной G. Bedarida et al., реакцию иммуноэлектрофореза по методу P. Grabar и C. Williams, описанному Х. Фримель [1–4]. Иммунодиффузию для выявления особенностей антигенов посредством реакции преципитации проводили по методу O. Ouchterlony [7].

Для двойной радиальной иммунодиффузии был использован 2 % агарозный гель на трис-боратном буфере (рН-8,3). Встречный электрофорез проводили в трис-боратном буфере (рН–8,3) на 1,5 % агарозном геле. Электрофорез проводили с режимом 25 В/см, 100 mA в течение 20 минут. После этого гель вынимали из электрофоретической камеры, промывали в 0,9 % NaCl в течение 30 минут и наблюдали преципитаты в проходящем свете. При слабых преципитатах пластину геля оставляли в растворе 0,9 % NaCl на 24–48 ч. Для проведения иммуноэлектрофореза сначала осуществляли электрофорез антигенов в агарозном геле в течение 30 минут. Толщина геля составляла 3–4 мм. Затем в канавку, параллельную миграции антигенов, наливали гипериммунную сыворотку. Для равномерной диффузии пластина с гелем находилась во влажной камере в течение 24–48 ч. Линии преципитации наблюдали в боковом освещении на темном фоне. Гели документировали и анализировали.

Результаты исследования и их обсуждение

Экспериментально подобрали режим ультразвуковой дезинтеграции бактериальных клеток, позволяющий полностью разрушить бордетеллы и максимально сохранить их антигенные комплексы. Исследования по выбору оптимальной мощности и установлению амплитуды для максимального разрушения клеток ультразвуком проводили следующим образом. В стерильные пробирки типа эппендорф (на 1,5 мл) набирали по 1,0 мл культуры, с помощью зажима ставили в акустическую камеру дезинтегратора так, чтобы подающая энергию насадка была опущена в среду на 1 см, и выставляли мощность на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 мк (таблица).

Опытные режимы дезинтеграции бактериальной взвеси Bordetella bronchiseptica

Объем бактериальной взвеси (мл)

Режимы дезинтеграции

Контроль дезинтеграции

Амплитуда (микрон)

Время (минут)

Разрушение клеток

Рост на МПА

Содержание белка мг/мл

1

1

1

Не полное

Рост отсутствовал

6,6

1

2

1

Не полное

Рост отсутствовал

6,6

1

3

1

Не полное

Рост отсутствовал

6,6

1

4

1

Не полное

Рост отсутствовал

6,5

1

5

1

Не полное

Рост отсутствовал

6,4

1

6

1

Не полное

Рост отсутствовал

6,3

1

7

1

Полное

Рост отсутствовал

6,2

1

8

1

Полное

Рост отсутствовал

6,0

1

9

1

Полное

Рост отсутствовал

5,9

1

10

1

Полное

Рост отсутствовал

5,6

Результаты микроскопии окрашенных по Граму бактериальных препаратов B.bronchiseptica до и после ультразвуковой дезинтеграции представлены на рис. 1.

Видно полное разрушение клеток после проведенной дезинтеграции.

По результатам микроскопии УЗ-антигеного препарата и проверки на полноту инактивации высевом на мясо-пептонный агар (48 ч инкубации при 37 °С).

Сохранение антигенов в дезинтегратах контролировалось электрофоретическим разделением белков в агарозном геле. В качестве контроля при электрофорезе был использован стандартный раствор сывороточного альбумина с молекулярной массой 65 кДа.

а pic_51.tif б pic_52.tif

Рис. 1. Микроскопия окрашенных по Граму бактериальных препаратов B.bronchiseptica до (А) и после (Б) ультразвуковой дезинтеграции (х1000)

Таким образом, экспериментально был подобран следующий оптимальный режим дезинтеграции: частота 23 кГц, амплитуда колебаний 7 микрон, в течение 1 минуты на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом.

Для стандартизации схемы иммунизации кроликов в дезинтеграте было определено количество белка, которое составило 6,2 мг/мл. Для удобства расчетов вводимого кроликам препарата количество белка было доведено до 5,0 мг/мл путем разведения исходного состава дезинтеграта стерильным физиологическим раствором. Для повышения иммунного ответа перед началом иммунизации кроликам внутримышечно, в область бедра вводили 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда. Затем каждые 3 дня внутривенно инъецировали антигенный дезинтеграт в количестве 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мл. Через 10, 15, 20, 30 дней после начала иммунизации брали кровь по 5 мл от каждого кролика, готовили сыворотку и ставили объемную реакцию агглютинации. Величина титра антител составила к 10-му дню 1:80, к 15-му – 1:160, к 20 дню титр антител вырос до 1:320 и оставался на этом уровне в последующем.

Далее провели испытания иммунохимических методов: двойной радиальной иммунодиффузии, встречного электрофореза и иммуноэлектрофореза.

Результаты изучения антигенного состава бордетелл в реакции двойной радиальной иммунодиффузии представлены на рис. 2.

pic_53.tif

Рис. 2. Двойная радиальная иммунодиффузия. Лунки: № 1–5 – штаммы B.bronchiseptica; № 6–9 – иммунная сыворотка

В результате проведенных экспериментов было получено 5 линий преципитации с комплексными антигенами различных штаммов B.bronchiseptica и 3 линии преципитации с комплексными антигенами B.parapertussis. Таким образом, 2 антигена B.bronchiseptica были видоспецифичными и не давали внутриродовых перекрестных реакций.

Далее были поставлены реакции встречного электрофореза (рис. 3).

pic_54.tif

Рис. 3. Встречный электрофорез. Лунки: № 1–5 – штаммы B.bronchiseptica; № 6 – B.parapertussis; № 7 – P.aeruginosa; № 8 – A.hydrophila; № 9 – E.coli; № 10 – Y.enterocolytica; № 11 – Y.pseudotuberculosis; № 12 – S.aureus; № 13–24 – иммунная сыворотка

В результате эксперимента были получены четкие преципитаты, образованные с антигенами дезинтегрированных культур B.bronchiseptica и B.parapertussis. С антигенами культур грамотрицательных и грамположительных бактерий преципитации не наблюдалось.

Далее испытали иммуноэлектрофорез (рис. 4).

pic_55.tif

Рис. 4. Иммуноэлектрофорез. Лунки: № 1–2 – штаммы B.bronchiseptica 169; № 3 – гипериммунная сыворотка

В результате данного эксперимента было определено 8 антигенных комплексов B.bronchiseptica. Антигены различных штаммов возбудителя были идентичны по количеству и расположению линий преципитации. В опытах с комплексными антигенами B.parapertussis было определено 3 линии преципитации, что подтверждает наличие общих антигенов с B.bronchiseptica. Были проведены эксперименты иммуноэлектрофореза комплексных антигенов грамотрицательных и грамположительных бактерий с гипериммунной сывороткой. Установили, что иммунная сыворотка к антигенам B.bronchiseptica образует с комплексными антигенами грамотрицательных бактерий 3 линии преципитации.

Выводы

Таким образом, мы провели сравнительный анализ трех иммунохимических методов для выбора оптимальной схемы при изучении антигенного состава B.bronchiseptica. Установили, что иммунохимические методы являются достаточно эффективными и позволяют в короткие сроки провести анализ антигенного состава B.bronchiseptica.

Использование двойной радиальной иммунодиффузии позволяет обнаружить 5 антигенов B.bronchiseptica, 3 из которых дают перекрёстную реакцию с B.papapertussis, 2 являются видоспецифичными. Встречный электрофорез не дает возможности провести видовую идентификацию антигенов B.bronchiseptica. Метод иммуноэлектрофореза выявляет 8 антигенных комплексов, 5 из которых являются видоспецифичными для B. bronchiseptica.

В результате сравнительного анализа трех иммунохимических методов наиболее эффективным для выявления видоспецифичных антигенных детерминант является иммуноэлектрофорез.

Предлагаемая нами схема исследования антигенной структуры B.bronchiseptica включает выделение антигенов ультразвуковой дезинтеграцией (частота 23 кГц, амплитуда колебаний 7 микрон, в течение 1 минуты на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом); получение иммунной сыворотки гипериммунизацией лабораторных животных (предварительное введение в/м 0,5 мл адъюванта Френда и в/в введение кроликам 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мл антигена с интервалом 3 дней и получением крови через 20 дней с начала инъекций); проведение реакции иммуноэлектрофореза с анализом антигенных детерминант (8 белковых комплексов).

Рецензенты:

Васильев Д.А., д.б.н., профессор, директор ООО «Научно-исследовательский инновационный центр микробиологии и биотехнологии», Ульяновская область, Чердаклинский р-н, пос.Октябрьский;

Нафеев А.А., д.м.н., заведующий отделением особо опасных инфекций, природно-очаговых инфекций и профилактики туберкулеза, ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ульяновской области», г. Ульяновск.

Работа поступила в редакцию 01.08.2013.


Библиографическая ссылка

Васильева Ю.Б. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ АНАЛИЗА АНТИГЕННОГО СОСТАВА BORDETELLA BRONCHISEPTICA // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 10-1. – С. 100-104;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32224 (дата обращения: 14.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074