Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕЗА И РЕГЕНЕРАЦИИ КАТРАНА БУГОРЧАТОГО in vitro

Магомедалиева В.К. 1
1 Дагестанский государственный университет
Изучено действие NaCl (0,5; 1 %) и ПЭГ (5 %) на прорастание семян, морфогенез узловых и листовых эксплантов. Концентрация NaCl (1 %) полностью подавляет всхожесть семян катрана бугорчатого, а вариант 0,5 % характеризовался процессами роста и морфогенеза у прорастающих семян. ПЭГ 5 % подавлял ризогенез, побегообразование и закладку почек у прорастающих семен. У узловых и листовых NaCl (0,5; 1 %) подавляет морфогенез и приводит к их отмиранию. ПЭГ (5 %), как и NaCl (0,5; 1 %), губительно действует на узловые и листовые экспланты катрана бугорчатого. Узловые экспланты характеризуются отмиранием, а выживаемость листовых эксплантов составила 20 % без роста и морфогенеза. Действие БАП (0,5 и 5 мг/л) на узловые, листовые и корневые экспланты катрана бугорчатого характеризовалось 100 %-й выживаемостью и ростом (0,5 мг/л). Однако у узловых эксплантов в отличие от листовых наблюдалась закладка почек и рост побегов (100 %). БАП (5 мг/л) губителен для узловых эксплантов, но стимулирует рост листовых эксплантов и отмечен частичным некрозом раневой поверхности. У корневых эксплантов наблюдалась закладка почек и рост побегов. Итак, разработана методика in vitro тканей катрана бугорчатого и оценка устойчивости к стрессам, определен гормональный состав питательной среды для роста и морфогенеза у эксплантов побегов и семян катрана бугорчатого.
культура тканей
in vitro
клональное размножение
редкие и исчезающие виды растений
катран бугорчатый
1. Андреев Л.Н. Сохранение редких и исчезающих растений in situ: достижения и проблемы / Л.Н. Андреев, Ю.Р. Горбунов // Изучение и охрана разнообразия флоры, фауны и основных экосистем Евразии: матер. Международ. конф. – М., 21–23 апреля 1999 г. – М.: ИПЭЭ РАН, 2000. – С. 19–23.
2. Разработка принципов сохранения и воспроизводства генетических фиторесурсов / Ю.К. Виноградова, Ю.Н. Горбунов, А.И. Макридин, О.И. Молканова, А.Н. Швецов // Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами. – М., 2005. – С. 343–351.
3. Красная книга республики Дагестан / под ред. Абдурахманова Г.М. – Махачкала: Республиканская газетно-журнальная типография, 2009. – 552 с.
4. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – Киев: Наукова думка, 1980. – 448 с.
5. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. – М.: ФБК – ПРЕСС, 1999. – 160 с.
6. Талиева М.Н. Влияние иммуномодулирующего действия эпина и эпина экстра // Полифункциональное действие брассиностероидов. – М.: НЭСТ М, 2007. – С. 307–309.

В настоящее время происходит стремительное сокращение ареалов распространения и полное исчезновение редких видов растений. В связи с этим возникла необходимость разработки методов воспроизведения, сохранения и поддержания биологического разнообразия [1] путем использования методов биотехнологии для воспроизведения редких растений [2].

К редким растениям, нуждающимся в охране и репродукции, в Дагестане относится катран бугорчатый (Crambe giberosa) со второй категорией редкости [3]. Это многолетний, травянистый, степной гемикриптофит, обитающий в сухих степях, на каменистых склонах. Лимитирующими факторами для вида является малочисленность популяции из-за выпаса скота, хозяйственного освоения местности. Он занесен в Красную книгу Ставропольского края (2002). В условиях ex situ испытывается в Горном ботаническом саду ДНЦ РАН. Необходимо выявление состояния популяций для создания специализированного ООПТ.

Целью работы была разработка методики выведения in vitro катрана бугорчатого и оценка стрессоустойчивости с использованием методов биотехнологии.

Материалы и методы исследования

Исходным материалом для введения в культуру in vitro катрана бугорчатого служили семена и зеленые побеги с растений ценопопуляции Талгинского ущелья, предоставленные сотрудниками кафедры ботаники ДГУ. Стерилизацию зеленых побегов проводили в несколько этапов. Предварительно побеги замачивали в мыльной воде с добавлением 2–3 капель твин-80 в течение 10–15 минут, почистив их, несколько раз промывали водопроводной и 2–3 раза – дистиллированной водой. Перед стерилизацией в течение 8 минут в 0,1 %-м растворе сулемы (HgCl2) зеленые побеги разрезали на небольшие части и парафинировали срезы для предотвращения попадания в ткани стерилизующего агента. После стерилизации экспланты побегов промывали в дистиллированной воде поочередно в течение 5, 10 и 15 минут. Узловые экспланты помещали на питательную среду Мурасиге – Скуга (МС). Асептику обеспечивали по общепринятой методике в условиях ламинар-бокса [4, 5].

Семена катрана бугорчатого вводили в культуру in vitro двумя способами. В первом случае их перед стерилизацией очищали только от скорлупы (перикарп), а во втором – очищали не только от скорлупы, но и от семенной кожицы. Для стерилизации семена помещали в 70 % спирт на 1 минуту, после на 10 минут – в 3 % перекись водорода.

Культивирование узловых эксплантов и семян проводили в условиях 16-часового фотопериода, при температуре 23–25 °С на среде Мурасиге‒Скуга (МС) с добавлением регуляторов роста ИМК и БАП, соли NaCl разных концентрации и полиэтиленгликоля (ПЭГ). Для предотвращения грибковой инфекции в среду добавляли флуконазол (50 мг/50 мл на 100 мл среды 0,5 мл раствора) [6].

Жизнеспособность эксплантов оценивали по показателям выживаемости (% выживших от общего числа эксплантов в варианте), каллусо- и корнеобразованию, визуально по мощности развития каллуса (начало закладки – 1 балл, слабое покрытие каллусом раневой поверхности – 2 балла, мощное ее покрытие – 3 балла.

Результаты исследования и их обсуждения

Экспланты зеленых побегов катрана бугорчатого характеризовались очень низкой жизнеспособностью по сравнению с семенами, отличающимися высокой всхожестью и хорошим ростом. Культивировали узловые экспланты зеленых побегов на среде МС с добавлением ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л). Повторность опыта двукратная.

На 5–7 сутки культивирования все экспланты стали коричневыми. Прорастание у семян в варианте 2 (без покровов) наблюдалось на 6–7 сутки культивирования. На 30 сутки из всех культивированных семян (100 %) формировались полноценные проростки с хорошо развитым побегом и корневой системой. У семян в варианте 1 (с семенной кожицей) не обнаружен рост даже на 90 сутки (табл. 1). Поэтому все основные исследования в дальнейшем проводились на семенах с очищенной семенной кожицей.

Таблица 1

Жизнеспособность семян катрана при культивировании на среде МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) без очистки (А) и с очисткой (Б) семенной кожицы

Семена

Сутки

Прорастание, %

Рост

Морфогенез, %

%

балл

корни

почки

побеги

А

90

0

0

0

0

0

0

Б

30

100

100

3

100

100

100

Изучение влияния регуляторов роста на прорастание семян проводилось по четырем вариантам на питательной среде МС (табл. 2).

Таблица 2

Влияние гормонального состава питательной среды МС на прорастания семян катрана бугорчатого

Варианты

Прорастание

Рост

Морфогенез, %

сутки

%

%

балл

корни

побеги

1

7

100

100

3

100

100

2

10

100

100

3

100

100

3

10

75

0

0

0

0

4

10

88

0

0

0

0

Примечание. Варианты культивирования: среда МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) (1); МС + БАП (0,5 мг/л) (2); МС (3); МС + ИМК (0,5 мг/л) (4)

Изучено влияние NaCl (0,5 и 1 %) и ПЭГ (5 %) на прорастание семян катрана бугорчатого (табл. 3). На 14 сутки по всем вариантам отмечено прорастание семян. Однако следует отметить, что варианты отличались реализации регенерационного потенциала и морфогенеза. Так, на 14 сутки у проросших семян ризогенез наблюдался только в контрольном варианте (100 %) и в варианте с NaCl 0,5 % (60 %), а в варианте с ПЭГ 5 %, где так же, как и в других вариантах наблюдалось прорастание семян, но без закладки корней даже на 60 сутки.

Уже на 60 сутки культивирования было четко видно количество проросших семян и процессы их морфогенеза (ризогенез, закладка почек и побегообразование) в зависимости от варианта среды. В контроле на 60 сутки у всех проросших семян отмечены закладка почек и побегообразование, тогда как у семян варианта с NaCl (0,5 %) – у 80 %, а варианта с ПЭГ (5 %) – только у 30 %.

Таблица 3

Жизнеспособность семян катрана бугорчатого на 14(а) и 60 (б) сутки их культивирования

Варианты

Сроки прорастания, сутки

Прорастание, %

Рост

Морфогенез, %

%

балл

корни

почки

побеги

1

а

100

100

3

100

0

100

б

100

100

3

100

100

100

2

а

80

80

2,5

60

0

80

б

80

80

2,5

80

80

80

3

а

0

0

0

0

0

0

б

0

0

0

0

0

0

4

а

60

60

2

0

0

30

б

60

60

2

0

30

30

Примечание. Варианты культивирования: среда МС + ИМК и БАП – контроль (1); МС + ИМК и БАП + NaCl 0,5 % (2); МС + ИМК и БАП + NaCl 1 % (3); МС + ИМК и БАП + ПЭГ (5 %) (4)

Также изучена жизнеспособность узловых и листовых эксплантов катрана бугорчатого на среде МС с добавлением разных концентраций ИМК, БАП, NaCl и ПЭГ (табл. 4). Так, на 10 сутки культивирования у узловых и листовых эксплантов в контроле выживаемость составила 100 %, у всех эксплантов наблюдался интенсивный рост (100 %). Процессы морфогенеза (закладка почек и побегообразование) происходили только на узловых эксплантах (100 %), а каллуссогенез отсутствовал как на листовых, так и на узловых эксплантах. Устойчивость узловых и листовых эксплантов к действию NaCl (0,5 и 1 %) и ПЭГ – (5 %) оценивали добавлением их в питательную среду МС. Узловые и листовые экспланты на 10 сутки в варианте МС с NaCl (0.5 %) сохранили зеленую окраску и высокую жизнеспособность. Однако процессы роста, каллусогенеза и морфогенеза отсутствовали, а на 60 сутки наблюдалась гибель (100 %) как узловых, так и листовых эксплантов.

Таблица 4

Жизнеспособность узловых (а), листовых (б) и корневых (в) эксплантов катрана бугорчатого

Вариант среды

Экспланты

Сроки культивирования, сутки

Выживаемость, %

Рост

Морфогенез, %

%

балл

корни

почки

побеги

I

а

10

100

100

3

0

100

100

б

10

100

100

3

0

0

0

II

а

10

100

0

0

0

0

0

60

0

0

0

0

0

0

б

10

100

0

0

0

0

0

60

0

0

0

0

0

0

III

а

10

0

0

0

0

0

0

б

10

0

0

0

0

0

0

IV

а

10

100

0

0

0

0

0

60

0

0

0

0

0

0

б

10

100

0

0

0

0

0

60

20

0

0

0

0

-0

V

а

30

100

100

3

0

100

100

б

30

100

100

3

0

0

0

VI

а

20

0

0

0

0

0

0

б

20

60

100

2,5

0

0

0

в

25

30

0

0

0

100

100

Примечание. Узловые и листовые экспланты стерильных побегов катрана бугорчатого на среде МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) (Iа,б); МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) + NaCl (0,5 %) (IIа, б), МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) + NaCl (1 %) (III а, б), МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) + ПЭГ (5 %) (IV а,б), МС + БАП (0,5 мг/л) (Vа, б). МС + БАП (0,5 мг/л) (VI а, б, в).

На среде МС с NaCl 1 % уже на 10 сутки отмечалась 100 %-я гибель узловых и листовых эксплантов. Они в варианте с ПЭГ (5 %), характеризовались 100 % -й выживаемостью без ростовых процессов. На 60 сутки отмечен отмирание узловых эксплантов, тогда как выживаемость листовых составила 20 %. Листовые экспланты и на 60 сутки сохранили зеленую окраску, хотя нередко отмечались почернение и высыхание листовой пластинки (рис. 1). Несмотря на слабую выживаемость листовых эксплантов (в отличие от узловых) на среде МС с ПЭГ (5 %), у них не наблюдался рост, закладка каллуса, почек и корней.

Наряду с изучением воздействия NaCl и ПЭГ на узловые и листовые экспланты катрана бугорчатого было исследовано влияние на них БАП (0.5 и 5 мг/л). И узловые, и листовые экспланты на среде МС с БАП (0,5 мг/л) на 30 сутки характеризовались высокой выживаемостью и ростом (100 %). Однако у узловых эксплантов наблюдалась закладка почек и рост побегов (100 %). На среде МС с БАП (5 мг/л) на 20 сутки культивирования узловые экспланты отмерли, тогда как выживаемость листовых составила 60 %. Они характеризовались высокими показателями роста (100 %) без морфогенеза (рис. 2, а). Листовые хотя и имели зеленую окраску, отмечались некрозы на раневой поверхности (рис. 2, б). На 25 сутки культивирования у корневых эксплантов на среде МС с цитокининами в концентрации 5 мг/л наблюдали закладку адвентивных почек и рост побегов (рис. 3).

а pic_61.tif б pic_64.tif в pic_62.tif

Рис. 1. Листовые экспланты стерильных побегов катрана бугорчатого, проросших из семян, при посадке (а) на 10 (б), 60 (в) сутки культивирования на среде МС + ИМК (0,5 мг/л) и БАП (2,5 мг/л) + ПЭГ 5 %

а pic_65.tif б pic_63.tif в pic_66.tif

Рис. 2. Листовые (а, б, в) экспланты стерильных побегов катрана бугорчатого, проросших из семян на 20 сутки на среде МС + БАП (5 мг/л)

Выводы

Высокая всхожесть семян (100 %) у Crambe giberosa достигается скарификацией, что свидетельствует о покое при сопротивлении покровов семени. Его снятие ведет к повышению всхожести семян.

pic_67.tif pic_68.tif

Рис. 3. Корневые экспланты стерильных побегов катрана бугорчатого на 25 стуки на среде МС + БАП (5 мг/л)

Выявлена зависимость прорастания семян от наличия в среде регуляторов роста ИМК и БАП. В среде с содержанием гормонов прорастание наблюдалось у 100 % культивированных семян, а без них – у 25 %.

Изучено действие NaCl (0,5; 1 %) и ПЭГ (5 %) на прорастание семян, морфогенез узловых и листовых эксплантов. Концентрация NaCl (1 %) полностью подавляет всхожесть семян катрана бугорчатого, а вариант 0,5 % характеризовался процессами роста и морфогенеза у прорастающих семян. ПЭГ 5 % подавлял ризогенез, побегообразование и закладку почек у прорастающих семен. У узловых и листовых NaCl (0,5; 1 %) подавляет морфогенез и приводит к их отмиранию. ПЭГ (5 %), как и NaCl (0,5; 1 %), губительно действует на узловые и листовые экспланты катрана бугорчатого. Узловые экспланты характеризуются отмиранием, а выживаемость листовых эксплантов составила 20 % без роста и морфогенеза.

Действие БАП (0,5 и 5 мг/л) на узловые, листовые и корневые экспланты катрана бугорчатого характеризовалось 100 %-й выживаемостью и ростом (0,5 мг/л). Однако у узловых эксплантов в отличие от листовых наблюдалась закладка почек и рост побегов (100 %). БАП (5 мг/л) губителен для узловых эксплантов, но стимулирует рост листовых эксплантов и характеризуется частичным некрозом раневой поверхности. У корневых эксплантов наблюдалась закладка почек и рост побегов.

Итак, разработана методика in vitro тканей катрана бугорчатого и оценка устойчивости к стрессам, определен гормональный состав питательной среды для роста и морфогенеза у эксплантов побегов и семян катрана бугорчатого.

Рецензенты:

Абдулмалик Г.Ю., д.б.н., профессор кафедры физиологии растений и теории эволюции биологического факультета Дагестанского государственного университета, г. Махачкала;

Куркиев К.У., д.б.н., профессор кафедры ботаники, генетики и селекции Дагестанского государственного аграрного университета, г. Махачкала.

Работа поступила в редакцию 01.08.2013.


Библиографическая ссылка

Магомедалиева В.К. ОСОБЕННОСТИ МОРФОГЕНЕЗА И РЕГЕНЕРАЦИИ КАТРАНА БУГОРЧАТОГО in vitro // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 10-1. – С. 114-118;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32227 (дата обращения: 18.11.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074