Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК В ЛИКВОРЕ КРЫС ПРИ СТРЕССОРНОЙ НАГРУЗКЕ

Григорчук О.С. 1 Глебова К.В. 2 Вейко Н.Н. 2 Умрюхин П.Е. 1
1 Первый московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова
2 ФГБУ «Медико-генетический научный центр РАМН»
Работа посвящена исследованию уровня внеклеточной ДНК (вкДНК) в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) крыс с различной эмоциональной резистентностью в норме и условиях иммобилизационной стрессорной нагрузки. В контрольной серии экспериментов в группе устойчивых к стрессу животных наблюдалась тенденция к большему уровню вкДНК по сравнению с предрасположенными к стрессу и амбивалентными особями, однако статистически значимых различий между группами обнаружено не было. Все исследованные животные статистически достоверно разделялись на группы с высоким и низким общим количеством ДНК в ЦСЖ. Доля крыс с низким количеством вкДНК в ЦСЖ среди предрасположенных и устойчивых к стрессу животных составила 70 и 33 % соответственно. После эмоционального стресса (ЭС) в группах устойчивых и предрасположенных к стрессу животных нами выявлена обратная корреляционная зависимость между изменением объема аликвот отбираемого ликвора и изменением в нем концентрации вкДНК. Полученные нами результаты свидетельствуют о жесткой регуляции уровня вкДНК в ЦСЖ и позволяют предположить, что выявленные нами закономерности являются частью механизма адаптации мозга к стрессирующим воздействиям.
внеклеточная ДНК
цереброспинальная жидкость
эмоциональный стресс
1. Глебова К.В., Конорова И.Л., Полещук В.В., Байдакова Г.В., Вейко Н.Н. Свойства внеклеточной ДНК цереброспинальной жидкости и плазмы крови при болезни Паркинсона – пилотное исследование. БЭБИМ. В печати.
2. Конорова И.Л., Вейко Н.Н. Эмоциональный стресс изменяет концентрацию и состав циркулирующей в плазме крови внеклеточной ДНК у крыс в норме и при церебральной ишемии // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2012. – № 3. – С. 281–285.
3. Коплик Е.В. Метод определения критерия устойчивости крыс к эмоциональному стрессу // Вестн новых мед технол. – 2002. – № 9. 1. – Р. 16–18.
4. Лебедев С.В., Блинов Д.В., Петров С.В. Пространственные параметры большой цистерны мозга у крыс и новая техника ее пункции с помощью стереотаксического манипулятора // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2004. – Т. 137, № 6. – С. 717–720.
5. Пшенникова М.Г. Феномен стресса. Эмоциональный стресс и его роль в патологии (продожение) // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2001. – № 1. – С. 26–31.
6. Судаков К.В., Умрюхин П.Е. Системные механизмы эмоционального стресса. – М.: ГЭОТАР, 2009. – 112 с.
7. Angert R.M., Leshane E.S., Yarnell R.W. et al. // Am. J.Obstet. Gynecol. – 2004. – Vol. 190. – № 4. – P. 1087–1090.
8. Anker P., Stroun M. Bacterial ribonucleic acid in the frog brain after a bacterial peritoneal infection // Science. – 1972 Nov 10. – № 178(4061). – Р. 621–3.
9. García-Olmo D.C., Ruiz-Piqueras R., García-Olmo D. // Histol. Histopathol. – 2004. – Vol. 19, № 2. – P. 575–583.
10. Konorova I.L., Veiko N.N., Novikov V.E.. Influence of plasma DNA on acid-base balance, blood gas measurement, and oxygen transport in health and stroke. Ann N Y Acad Sci. 2008.
11. Konorova I.L., Veiko N.N. Emotional stress in rats changes concentration and composition of extracellular DNA circulating in blood plasma under normal conditions and in cerebral ischemia // Bull Exp Biol Med. – 2012 Jul. – № 153(3). – Р. 305–8.
12. Kostyuk S., Ermakov A., Alekseeva A., et al. // Mutat. Res. – 2012. – Vol. 729. – № 1–2. – P. 52–60.
13. Mittra I, Nair NK, Mishra PK. Nucleic acids in circulation: are they harmful to the host? // J Biosci. – 2012 Jun. – № 37(2). – Р. 301–12.
14. Podlesniy P., Figueiro-Silva J., Llado A., Antonell A., Sanchez-Valle R., Alcolea D., Lleo A., Molinuevo J.L., Serra N., Trullas R. Low CSF concentration of mitochondrial DNA in preclinical Alzheimer’s disease // Ann Neurol. – 2013 Jun 22. doi: 10.1002/ana.23955. [Epub ahead of print].
15. Rhodes C.H., Honsinger C., Sorenson G.D. // Am. J. Clin. Pathol. – 1995. – Vol. 103. – № 4. – P. 404–408.
16. Rykova E.Y., Morozkin E.S., Ponomaryova A.A., Loseva E.M., Zaporozhchenko I.A., Cherdyntseva N.V., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Cell-free and cell-bound circulating nucleic acid complexes: mechanisms of generation, concentration and content. Expert Opin Biol Ther. – 2012 Jun;12. – Suppl 1. – Р. 141–53.
17. Zoppi S., Pérez Nievas B.G., Madrigal J.L., Manzanares J., Leza J.C., García-Bueno B. Regulatory role of cannabinoid receptor 1 in stress-induced excitotoxicity and neuroinflammation. Neuropsychopharmacology. – 2011 Mar. – № 36(4). – Р. 805–18.

Многочисленные исследования посвящены изучению свойств и функций внеклеточной ДНК (вкДНК), циркулирующей в крови. Было показано, что вкДНК в крови является регулятором целого ряда физиологических процессов, а также может выступать в качестве маркера различного рода заболеваний [10; 13]. Однако о вкДНК, присутствующей в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), информации очень мало. Между тем имеющиеся на настоящий момент данные представляют значительный практический интерес, поскольку последние годы появляется все больше информации об участии вкДНК в развитии патологических процессов и о связи биологической активности вкДНК с ее молекулярными свойствами и концентрацией [9; 12]. Так, Родес и соавт. было показано, что при наличии опухолей в нервной системе в ликворе детектируется вкДНК с опухолеспецифичными геномными изменениями, источником которой являются раковые клетки [15]. Также было показано, что в ЦСЖ пациентов с болезнью Паркинсона обнаруживается вкДНК, и ее состав и концентрация существенно отличаются от таковых вкДНК, циркулирующей в крови [1]. Известен также факт обнаружения вкДНК плода в ЦСЖ женщин в предродовой период [7], что свидетельствует о возможности существования механизмов проникновения вкДНК через гистогематические барьеры.

Ранее Коноровой И.Л. было показано, что при стрессорной нагрузке концентрация вкДНК в крови возрастает [2]. Однако вопрос о том, происходит ли в стрессовых условиях изменение концентрации вкДНК в ЦСЖ, остается по-прежнему актуальным и открытым. Целью данной работы являлось исследование уровня вкДНК в ЦСЖ крыс с различной эмоциональной резистентностью в норме и условиях иммобилизационной стрессорной нагрузки.

Материалы и методы исследования

В работе были использованы 22 самца крыс линии Вистар массой 200–220 г. Исследования проводили в соответствии с международными правилами «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals». Индивидуальную эмоциональную реактивность крыс определяли в тесте «открытое поле» с использованием компьютерной программы регистрации параметров двигательной активности «Open Field Sequentional Test V.2» и расчетом индекса двигательной активности (ИА) как отношения суммы пересеченных периферических и центральных секторов к сумме латентных периодов первого движения и выхода в центр. К прогностически устойчивым к стрессу (активным) особям были отнесены 9 животных со значением ИА менее 0,8, к предрасположенным (пассивным) – 10 крыс с ИА более 1,5 [3]. Была также определена группа из 3 амбивалентных крыс со средними значениями коэффициента – от 0,8 до 1,5.

Забор ЦСЖ осуществляли под анестезией хлоралгидратом из большой цистерны головного мозга двукратно с интервалом в 10 дней по ранее разработанной методике [4]. При этом вторую пункцию проводили после эмоционального стресса (ЭС), индуцированного иммобилизацией крыс на плоской платформе за четыре конечности в течение 2,5 часов. Полученные образцы ликвора быстро замораживали и хранили при –20 °С.

ЦСЖ доводили физиологическим раствором до объема 400 мкл, а затем проводили выделение вкДНК фенольным методом, как было описано ранее [1]. Концентрацию вкДНК определяли на флуориметре EnspireTM 2300 (Perkin Elmer) по флуоресценции Picogreen (Invitrogen, США) при длинах волн возбуждения 480 нм и эмиссии 520 нм.

Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программного пакета Statistica 6.0. Для проверки гипотезы о различии независимых выборок использовали U-тест Манна‒Уитни. Результаты представляли в виде медианы значений и межквартильного интервала Ме [25 %; 75 %]. Для исследования связи признаков использовали непараметрический анализ по Спирмену.

Результаты исследования и их обсуждение

Медианы концентраций вкДНК в ликворе предрасположенных, устойчивых к стрессу и амбивалентных животных в норме составили 27, 68 и 20 нг/мл соответственно (табл. 1). Несмотря на то, что нами не было обнаружено статистически значимых различий между группами, в группе устойчивых к стрессу животных наблюдалась тенденция к большему уровню вкДНК по сравнению с остальными двумя. Объем ликвора, который в норме удавалось отобрать, был примерно одинаков для всех групп животных.

Таблица 1

Уровень вкДНК и объем ликвора в большой цистерне мозга у крыс с различной эмоциональной резистентностью в норме и ЭС

 

Группы животных

Предрасположенные к стрессу n = 10

Устойчивые к стрессу n = 9

Амбивалентные n = 3

контроль

стресс

контроль

стресс

контроль

стресс

Концентрация вкДНК, нг/мл

27 [23;56]

32 [24;73]

68 [25;80]

46 [28;60]

20 [20;22]

23 [23;26]

Объем ЦСЖ, мкл

86 [81;90]

86 [81;87]

88 [76;89]

84 [78;139]

93 [93;107]

91 [74;100]

Общее количество ДНК в пробе, нг

2,1 [2.0;6.3]

2,7 [2.0;6.4]

6,1 [2.2;6.5]

6,2 [2.1;6.8]

2,1 [1.9;2.1]

2,1 [1.9;2.3]

Статистический анализ концентраций вкДНК в ликворе по группам после эмоционального стресса показал отсутствие различий между группами устойчивых и предрасположенных к стрессу животных. Однако медианы концентраций вкДНК в ликворе предрасположенных, устойчивых к стрессу и амбивалентных животных после иммобилизационного стресса составили 32, 46 и 23 нг/мл соответственно. Как следует из оценки соответствующих верхних границ межквартильных интервалов, после ЭС концентрация вкДНК в ЦСЖ устойчивых к стрессу животных демонстрировала тенденцию к снижению, а у предрасположенных – наоборот, к повышению.

После стрессорной нагрузки изменения содержания вкДНК были выявлены у 5 из 9 устойчивых к эмоциональному стрессу животных (табл. 2). При этом у 4 крыс уменьшение концентрации вкДНК сопровождалось увеличением объема аликвот отбираемого ликвора. У 5-й активной особи концентрация вкДНК увеличивалась, а объем ЦСЖ снижался. Среди пассивных животных изменения концентрации вкДНК в ЦСЖ после стрессорной нагрузки были выявлены у 6 животных из 10: у четырех из них увеличение концентрации вкДНК сопровождалось снижением объема ликвора, у двух наблюдалось уменьшение концентрации вкДНК, причем в одном случае объем ликвора после стресса возрастал, а в другом – не изменялся. У амбивалентных животных концентрация и объем отбираемого ликвора до и после ЭС оставалась на том же уровне.

Таблица 2

Индивидуальные данные по концентрациям вкДНК и объемам аликвот ликвора у крыс с различной эмоциональной резистентностью при ЭС

Группа животных

Номер крысы

Контроль

ЭС

И.А.

Отношение параметров при ЭС и в контроле

Общ. кол-во ДНК в пробе, нг

Эффект

контр

ЭС

Устойчивые к стрессу

1

мкл

103

157

 

1,52

7,0

7,2

ув.V/ум.С

нг/мл

68

46

 

0,68

2

мкл

88

171

 

1,94

7,0

7,5

ув.V/ум.С

нг/мл

80

44

 

0,55

3

мкл

101

94

 

0,93

6,1

6,2

 

нг/мл

60

66

 

1,1

4

мкл

78

72

 

0,92

6,2

6,2

 

нг/мл

80

86

 

1,08

5

мкл

49

139

 

2,84

6,5

6,8

ув.V/ум.С

нг/мл

133

49

 

0,37

6

мкл

45,2

84,1

3,07

1,86

5,1

2,4

ув.V/ум.С

нг/мл

113

28

 

0,25

7

мкл

88,7

78,2

2,9

0,88

2,1

1,8

 

нг/мл

24

23

 

0,96

8

мкл

88,9

81,2

4,2

0,91

2,2

1,9

 

нг/мл

25

24

 

0,96

9

мкл

76,3

35,7

2,08

0,47

1,9

2,1

ум.V/ув.С

нг/мл

25

60

 

2,4

Предрасположенные к стрессу

10

мкл

91

89,4

 

0,98

6,6

6,5

 

нг/мл

72

73

 

1,01

11

мкл

113

90

 

0,8

6,3

6,4

ум.V/ув.С

нг/мл

56

71

 

1,27

12

мкл

81

58,9

 

0,73

7,6

6,1

ум.V/ув.С

нг/мл

94

103

 

1,1

13

мкл

51,9

73,2

0,33

1,41

2,6

1,9

ув.V/ум.С

нг/мл

50

26

 

0,52

14

мкл

90,2

86

0,22

0,95

2,1

2,7

ум.V/ув.С

нг/мл

23

31

 

1,35

15

мкл

103

83,7

0,53

1,03

2,0

2,7

 

нг/мл

68

32

 

1,28

16

мкл

88

86,3

0,45

0,97

2,1

2,1

 

нг/мл

80

24

 

1,04

17

мкл

101

87,4

0,46

1,03

2,0

2,0

 

нг/мл

60

23

 

0,96

18

мкл

78

80,9

0,35

1,11

2,0

1,8

ув.V/ум.С

нг/мл

80

22

 

0,79

19

мкл

49

86,2

0,33

0,98

2,0

7,9

не изм.V/ув.С

нг/мл

133

92

 

4

20

мкл

45,2

100

 

1,07

2,1

2,3

 

нг/мл

113

23

 

1,05

21

мкл

88,7

90,9

 

0,98

1,9

2,1

 

нг/мл

24

23

 

1,15

22

мкл

88,9

74,2

 

0,7

2,1

1,9

 

нг/мл

25

26

 

1,3

Как в группе устойчивых, так и в группе предрасположенных к ЭС животных нами была выявлена обратная корреляционная зависимость между изменением объема аликвот ликвора, которые удавалось отобрать до и после ЭС, и изменением концентрации вкДНК в данных аликвотах. Коэффициент корреляции Спирмена (R) составил –0,73 и –0,78 при р < 0,05 для предрасположенных (n = 10) и устойчивых (n = 9) животных соответственно.

Интересно отметить, что все изучаемые животные как в норме, так и после ЭС статистически достоверно (р < 0,005, U-тест) разделялись на 2 группы – с повышенным 6,5 [6,2; 7] (n = 9) и низким 2,1 [2; 2,1] (n = 13) общим количеством вкДНК (в нг) в пробе (табл. 1 и 2). При этом в норме среди устойчивых к ЭС крыс всего 33 % животных имели низкое количество вкДНК в ЦСЖ, в то время как доля таких животных среди предрасположенных к стрессу составила 70 % (табл. 2). Низкое количество вкДНК в ЦСЖ было обнаружено и у всех изучаемых амбивалентных животных. После ЭС эта закономерность сохранялась. В группе устойчивых к стрессу крыс общее количество вкДНК в пробе оставалось постоянным до и после ЭС у 8-ми из 9 животных. У одной крысы наблюдалось снижение общего количества вкДНК в ЦСЖ после стресса. Среди предрасположенных к стрессу животных постоянство общего количества вкДНК было отмечено у 8 из 10 животных, а у двух крыс наблюдали прирост и снижение количества вкДНК соответственно (табл. 2).

В данной работе впервые была проведена оценка концентрации вкДНК в ЦСЖ из большой цистерны головного мозга животных с различной эмоциональной резистентностью. При стрессорных нагрузках у каждого животного могут проявляться различные реакции со стороны гормональных, биохимических и вегетативных показателей организма [6], тест открытого поля оценивает лишь вероятную резистентность особи к эмоциональным нагрузкам. Поскольку у отдельных животных могут проявляться индивидуальные варианты динамики физиологических показателей, нам представлялось важным помимо анализа животных по группам резистентности к ЭС на основе ИА также проводить оценку индивидуальных изменений исследуемых параметров у каждого животного.

Выявленная нами тенденция к большему уровню вкДНК у группы устойчивых к стрессу животных согласуется с результатами, полученными ранее при исследовании вкДНК в плазме крови крыс с разной индивидуальной эмоциональной устойчивостью [11]. Концентрация вкДНК в плазме крови устойчивых к стрессу животных также превышала таковую у предрасположенных, но в крови это различие было выражено более явно.

Поскольку в работе [11] определение концентрации вкДНК в плазме крови крыс проводилось тем же методом, что и в данном исследовании, интересным представлялось провести сравнительную оценку концентраций вкДНК в крови и ЦСЖ в норме у крыс с различной эмоциональной резистентностью. Значения концентраций вкДНК в плазме крови предрасположенных и устойчивых к стрессу животных составили соответственно 60 [52;69] (n = 17) и 155 [134;174] (n = 11) нг/мл. Таким образом, очевидно, что концентрация вкДНК в ЦСЖ крыс была ниже, чем в плазме крови в 2,1 и 3,0 раза для предрасположенных и устойчивых к стрессу животных соответственно. Рассчитанные соотношения имеют один порядок с ранее полученными результатами на людях – концентрация вкДНК в ЦСЖ пациентов с болезнью Паркинсона оказалась в 3,3 ниже, чем в плазме крови [1].

Источниками вкДНК, циркулирующей в биологических жидкостях, являются некротические и апоптотические клетки, а также процессы активной секреции из жизнеспособных клеток [16]. Известно, что ЭС индуцирует неспецифический окислительный стресс (ОС) в организме, сопровождающийся массовой гибелью клеток, что в свою очередь приводит к изменению концентрации и свойств вкДНК, циркулирующей в крови [2]. В мозге стрессовые воздействия индуцируют эксайтотоксичность и нейровоспаления, также приводящие к клеточной гибели [17], а, следовательно, к выбросу вкДНК в экстраклеточное пространство. Кроме того, ранее в работе Строуна и Анкера была показана возможность проникновения вкДНК в мозг через гемато-энцефалический барьер [8]. Поэтому в данной работе нам представлялось интересным проверить, происходят ли изменения концентрации вкДНК, циркулирующей в ЦСЖ при ЭС.

Мы не выявили статистически достоверных изменений концентрации вкДНК в ЦСЖ после ЭС, индуцированного 2,5 ч иммобилизацией за 4 конечности, в группах предрасположенных, устойчивых и амбивалентных к стрессу животных. Также не удалось установить связь между резистентностью животных к ЭС и изменением концентрации вкДНК в ЦСЖ после стресса. Полученный нами результат может быть объяснен несколькими причинами. Возможно, значительное изменение уровня вкДНК в ЦСЖ происходит лишь в случае развития хронических патологий мозга – болезней Паркинсона, Альцгеймера, злокачественных новообразований [1; 14; 15]. Острые расстройства, такие как ЭС, могут не вызывать существенных изменений, поскольку вкДНК, выбрасываемая в экстраклеточное пространство при гибели клеток мозга, может поглощаться соседними клетками и расщепляться внеклеточными эндонуклеазами, не успевая попасть в желудочки. Другими возможными причинами отсутствия достоверных различий могут служить малый объем выборок животных, сравнительно небольшая длительность стрессорного воздействия, а также наложение процессов расщепления, появления свежей вкДНК в ЦСЖ и изменения скорости локального мозгового кровотока после стресса.

Как следует из полученных нами данных, содержание вкДНК в ЦСЖ отдельных крыс в пределах групп предрасположенных и устойчивых к стрессу животных изменялось не одинаково. Данный факт может быть связан с тем, что тестирование поведения в открытом поле позволяет прогностически оценить степень устойчивости к стрессорным нагрузкам, которая наиболее ярко проявляется в популяционной совокупности животных. При этом индивидуальная устойчивость отдельной особи в группе устойчивых или предрасположенных может варьироваться в широких пределах. У крыс со средним уровнем поведенческой активности изменений в содержании вкДНК и объема полученной ЦСЖ не выявлялись. Такой результат, возможно, был связан с небольшим количеством животных в группе.

По общему количеству ДНК в образцах все животные статистически достоверно разделялись на 2 группы – с низким и высоким общим количеством вкДНК в ЦСЖ. Причем в группе устойчивых к стрессу животных преобладали особи с высоким общим количеством вкДНК в ликворе, а среди предрасположенных и амбивалентных к стрессу – наоборот, с низким. Полученный нами результат свидетельствует о том, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животного к стрессорным воздействиям.

Выявленная нами обратная корреляционная зависимость между изменениями объема аликвот ликвора и концентрации в них вкДНК при ЭС как у предрасположенных, так и у устойчивых к стрессу животных при сохранении общего количества вкДНК в пробе постоянным может свидетельствовать о существовании механизма жесткой регуляции уровня вкДНК в желудочках мозга. Такой механизм может являться одной из форм адаптации организма и, в частности, мозга к стрессовым воздействиям. В настоящее время неясно, несет ли выявленный нами феномен постоянства общего количества вкДНК в аликвотах ликвора какую-либо физиологическую функцию. Для ответа на этот вопрос необходимы дальнейшие исследования.

Заключение

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что предрасположенные, амбивалентные и устойчивые к стрессу животные в норме различаются по концентрации и общему количеству вкДНК в ЦСЖ желудочков мозга. Среди устойчивых крыс преобладают особи с высоким уровнем вкДНК в ликворе, среди предрасположенных и амбивалентных – с низким. При ЭС у устойчивых и предрасположенных к стрессу крыс происходят изменения объема отбираемых аликвот ликвора и уровня вкДНК в них, а также активируются механизмы, препятствующие изменению общего количества ДНК в ликворе. Выявленные нами закономерности могут являться частью механизма адаптации мозга к стрессирующим воздействиям и требуют дальнейшего более тщательного исследования. Данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о перспективности исследования вкДНК в ЦСЖ животных с различной эмоциональной резистентностью и позволяют надеяться, что вкДНК, циркулирующая в биологических жидкостях, в перспективе может быть использована в качестве уникального показателя предрасположенности животных к стрессорным воздействиям.

Рецензенты:

Стрельников В.В., д.б.н., доцент, главный научный сотрудник, ФГБУ «Медико-генетический научный центр» РАМН, г. Москва;

Лосева Е.В., д.б.н., главный научный сотрудник, ФГБУН «Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН», г. Москва.

Работа поступила в редакцию 20.09.2013.


Библиографическая ссылка

Григорчук О.С., Глебова К.В., Вейко Н.Н., Умрюхин П.Е. ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК В ЛИКВОРЕ КРЫС ПРИ СТРЕССОРНОЙ НАГРУЗКЕ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 9-4. – С. 621-626;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=32482 (дата обращения: 21.09.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074