Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Козовый Р.В. 1 Эрстенюк Г.М. 1

---

1 ГВУЗ «Ивано-Франковский национальный медицинский университет»

Проведен анализ показателей функционального состояния ферментативной системы детоксикации ксенобиотиков и окислительной модификации белков в сыворотке крови 60 долгожителей (основная группа) и 30 человек зрелого возраста, в родословных которых не было долгожителей (группа сравнения). Выявлено, что активность глутатионпероксидазы у всех долгожителей составила (0,329 ± 0,18) мкмоль/(мин·мг), а в группе сравнения (0,353 ± 0,17) мкмоль/(мин·мг). Активность фермента глутатионредуктазы у долгожителей Прикарпатья в 3,17 раза больше по сравнению с лицами зрелого возраста. Установлена тенденция к снижению активности глутатион-S-трансферазы у долгожителей (0,305 ± 0,31) мкмоль/(мин·мг) относительно показателей группы сравнения (0,345 ± 0,18) мкмоль/(мин·мг). Доказано статистически достоверное снижение уровня продуктов окислительной модификации белков альдегидо-и кетонопроизводных нейтрального характера в основной группе относительно сравнительной. Интенсификация процессов окислительной модификации белков у долгожителей сопровождалась увеличением альдегидо- и кетонопроиздных основного характера по сравнению с лицами зрелого возраста. Полученные результаты могут свидетельствовать о лучшем функционирования у долгожителей защитных противорадикальних систем по сравнению с лицами зрелого возраста.

Статья в формате PDF

315 KB

долгожители

окислительные модификации белков

глютатионпероксидаза

глютатионредуктаза

глютатионтрансфераза

1. Баранов В.С. Геномика старения и предиктивная медицина / В.С. Баранов, О.С. Глотов, Е.В. Баранова // Успехи геронтологи. – 2010. – Т. 23, № 3. – С. 329–338.

2. Власова С.Н., Шабунина Е.И., Переслягина И.А. Активность глутатионзависимых ферментов эритроцитов при хронических заболеваниях печени у детей // Лаб. дело. – 1990. – № 8. – С. 19–21

3. Глотов О.С. Генетический полиморфизм, мультифакториальные болезни и долголетие / О.С. Глотов, В.С. Баранов // Мед. генетика. – 2007. – Т.6, № 4 (58). – С. 17–29.

4. Губський Ю.І. Вплив унітіолу на окиснювальну модифікацію білків плазми крові та процеси пероксидації ліпідів мембран гепатоцитів щурів за умов інтоксикації хлоридом кадмію / Ю.І. Губський, О.В. Задоріна, Г.М. Ерстенюк, Л.Ф. Осинська // Современные проблемы токсикологии. – 2008. – № 2. – С. 70–73.

5. Губський Ю.І. Основні шляхи утворення активних форм кисню в нормі та при ішемічних патологіях (Огляд літератури) / Ю.І. Губський, І.Ф. Бєленічев, С.І. Коваленко, Є.Л. Левицький, О.М. Марченко // Современные проблемы токсикологии. – 2004. – № 2. – С. 8–15.

6. Дубинина Е.Е. Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения / Е.Е. Дубинина, С.О. Бурмистров, Д.А. Ходов, И.Г. Поротов // Вопр. мед. химии. – 1995. – Т.41. – № 1 – С. 156–158.

7. Леоненко Н.С. Стан перекисного окислення ліпідів та окислювальної модифікації білків в організмі щурів при дії метсульфурон-метилу в малих дозах // Сучасні проблеми токсикології. – 2005. – № 4. – С. 53–57.

8. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / под ред. проф. М.И. Прохоровой. – Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1982. – 272 с.

9. Рябов А.Г. Окислительный стресс и эндогенная интоксикация у больных в критических состояниях // А.Г. Рябов, Ю.М. Азидов, И.Н. Пасечник и др. // Вестник интенсивной терапии. – 2002. – № 4. – С. 4–7.

10. Спицын В.А. Экологическая генетика человека // Наследственные болезни: национальное руководство / под ред. Н.П. Бочкова, Е.К. Гинтера, В.П. Пузырева. – М.: ГЭОТАР – Медиа, 2012. – С. 244–283.

11. Ткачук С.С. Порівняльний аналіз впливу двобічної каротидної ішемії-реперфузії на стан окислювальної модифікації білків у структурах мозку дорослих та старих щурів / С.С. Ткачук, Т.І. Бойчук // Клiнiчна та експериментальна патологiя. – 2010. – Т. ІХ, № 4 (34). – С. 65–69.

12. Эпигенетика. Александр Вайсерман URL: http://moikompas.ru/compas/avaiserman.

13. A longitudinal study of the effect of GSTT1 and GSTM1 gene copy number on survival./L. Christiansen, C. Brasch-Andersen, L. Bathum, T.A. Kruse, K. Christensen // Mech Ageing Dev. – 2006. – Vol. 127. – № 7 – P. 597–599.

14. Bolt H. M. Relevance of the Deletion Polymorphisms of the Glutathione S-Transferases GSTT1 and GSTM1 in Pharmacology and Toxicology / Bolt H. M., Thier R. // Current Drug Metabolism. – 2006. – Vol. 7. – P. 613–628.

15. Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B. Glutathione-S-transferases. The first step in mercapturic acid formation // J. Biol. Chem. – 1974. – № 249(22). – Р. 7130–7139.

16. Hallivel В. Neurological and Mental Disordes/ В. Hallivel, L. Packer, L. Prilipko // Berlin: Springer Verlag, – 1992. – P. 21–40.

17. Hayes J.D. Glutathione Transferases/Hayes J.D., Flanagan J.U., Jowsey I.R. //Ann Rev Pharm Toxicol. – 2005. – Vol. 45. – P. 51–88.

18. Metabolic Gene Polymorphism Frequencies in Control Populations / S. Garte, L. Gaspari, A. Alexandrie [et al.] // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. – 2001. – Vol. 10. – P. 1239–1248.

19. Polymorphisms of drug-metabolizing enzymes in healthy nonagenarians and centenarians: difference at GSTT1 locus/E. Taioli, D. Mari, C. Franceschi, [et al.] // Biochem Biophys Res Commun. – 2001. – Vol. 280. – P. 1389–1392.

20. Wuttge D.M. T-cell recognition of lipid peroxidation products breacs tolerance to self proteins / D.M. Wuttge, M. Bruzelius, S. Stemme // Immunology. – 1999. – Vol. 98, № 2. – P. 273–279.

Революционный взгляд на молекулярные механизмы развития живых систем предлагает молодая динамичная наука эпигенетика [12]. По мнению проф. А.М. Вайсермана, эпигенетика – направление генетики, сравнительно недавно осформировалась в самостоятельную область исследований. Одна из наиболее вдохновляющих эпигенетических гипотез о том, что активность многих генов подвержена влиянию извне, сейчас находит подтверждение в экспериментах на модельных животных. Известно, что продолжительность жизни – это мультифакторной признак, а следовательно, на его проявление влияют не только наследственные, но и внешние факторы. Довольно часто они имеют отрицательный эффект.

В условиях современной антропогенной нагрузки становится актуальным изучение особенностей функционирования детоксикационных систем. Процесс биотрансформации, который включает ферментативное превращение инородных включений или ксенобиотиков, делится на три фазы [10, 14, 17, 19]. Первая фаза активации ксенобиотиков или метаболической трансформации заключается в присоединении к ним модифицирующих функциональных групп (–ОН, –SH, –NH2). При этом происходят реакции окисления, восстановления и гидролиза, в результате которых образуются промежуточные метаболиты. Этот процесс катализируется микросомальной ферментативной системой цитохрома Р450 (семья ферментов цитохромов) и некоторыми другими ферментами классов оксидаз, редуктаз, гидролаз и дегидрогеназ. В процессе второй фазы биотрансформации – нейтрализации, промежуточные метаболиты соединяются с эндогенными лигандами, которые усиливают гидрофильную природу этих соединений, тем самым способствуют их выведению из организма. Вторая фаза заключается в конъюгации высокомолекулярных гидрофильных веществ с различными субстратами, в результате чего они превращаются в гидрофильные конъюгаты, способные к экспрессии с желчью. Третья фаза заключается в эвакуации или выведении водорастворимых нетоксичных веществ из организма. Для этого есть специальные переносчики экзогенных соединений – Р-гликопротеины, которые способствуют экскреции ксенобиотиков в желчь или кровь.

Известно, что любой адаптивный или патологический процесс протекает на фоне образования активных форм кислорода [5, 9]. В условиях окислительного стресса активно протекают процессы пероксидации белков, что в конечном итоге приводит к потере их биологической активности, при этом окислительно модифицированные белки генерируют новые антигены и негативно влияют на иммунный ответ [16, 20]. Активные формы кислорода вызывают окислительную модификацию белков (ОМБ) в условиях нормы и патологии. При нормальном функционировании организма поддерживается динамическое равновесие между антиоксидантными и прооксидантными системами. Оксидация белков является нормальным функциональным процессом в организме, с которым связаны жизненно важные функции. Причем последние в значительной степени взаимосвязаны с защитными и адаптационными реакциями организма, а именно в процессе биотрансформации ксенобиотиков. Повышение уровня продуктов ОМБ является результатом нарушения равновесия между процессами, регулирующими синтез и оксидации протеинов, и уменьшение активности протеаз, которые селективно расщепляют оксидированные формы белков. ОМБ может включать прямую фрагментацию белков или вызывать их денатурацию с частичной или полной потерей функций [7]. Такие изменения приводят к снижению адаптационных процессов организма в целом, что способствует развитию патологических состояний. На экспериментальных животных доказано, что старение сопровождается накоплением продуктов окислительной модификации белков в определенных тканях организма [15].

В результате наших предыдущих исследований установлены ассоциации делецийних аллелей генов GSTT 1 и GSTM 1 с продолжительностью жизни. С позиции функциональной геномики крайне важным является определение активности ферментных систем биотрансформации ксенобиотиков, ведь существование функциональных различий между аллелями в пределах одного локуса обусловливают аллельные дифференциации в экспрессии уровня белка, эффективности транспортной функции, активности, термостабильности фермента, иммунного ответа и т.п. Особый интерес принадлежит исследованию этих процессов у долгожителей.

Цель работы – изучение взаимосвязи между ферментативной активностью глутатионовой системы, показателей окислительных модификаций белков в плазме крови и продолжительностью жизни в популяции долгожителей Прикарпатья.

Материалы и методы исследования

Функциональное состояние ферментативной системы детоксикации ксенобиотиков и антиоксидантной защиты изучали по показателям сыворотки крови 60 долгожителей (основная группа) и 30 человек зрелого возраста, в родословных которых не было долгожителей (группа сравнения). Активность глутатион-S-трансферазы (GST) оценивали по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между восстановленным глутатиономи 1 – хлор-2, 4 – динитробензола [8]. Активность глутатионредуктазы (GRD) определяли по скорости изменения оптической плотности при 340 нм, обусловленного окисленим НАДФ•Н [2], глутатионпероксидазы (GPO) – по реакции взаимодействия восстановленного глутатиона с гидроперекиситрет-бутила [11]. Продукты окислительной модификации белков (ОМБ) в сыворотке крови исследовали методом А.Ю. Дубининой [6], основанным на взаимодействии окисленных аминокислотных остатков белков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ). Степень ОМБ оценивали по содержанию альдегидо- и кетонопроизводные белков нейтрального и основного характера. Пробы спектрофотометрирували при длине волн 356, 370, 430 и 530 нм.

Для статистического анализа полученных данных использовали метод программного обеспечения Microsoft Excel.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате метаболических превращений веществ в организме человека образуются свободные радикалы, обладающие высокой химической активностью, вызывают процессы пероксидации липидов, белков, нуклеиновых кислот [4]. Возникнув в организме, они вступают во взаимодействие со структурами клетки, приводя в итоге к повреждению клетки, вызывая, таким образом, развитие патологического процесса. Уменьшают повреждающее воздействие свободных радикалов ферменты, обеспечивающие антиоксидантную защиту. К мощным антиоксидантам относится система глутатиона.

При исследовании ферментов глутатионовой системы установлено, что активность GPO в группе долгожителей составила 0,329 ± 0,18 мкмоль/(мин·мг), а в группе сравнения 0,353 ± 0,17 мкмоль/(мин·мг) (таблица). Глутатионпероксидаза – фермент, который принимает участие в инактивации перекиси водорода и органических пероксидов в клетках высших животных и людей. GPO – гликопротеин, имеющий в активном центре четыре атома селена. Он является гидрофильным соединением, что затрудняет его проникновения в липидный слой мембран, основная часть фермента локализована в цитозоле, а другая – в митохондриях. GPO имеет селеновые изоферменты: внеклеточный GPO, обнаруженный в плазме и молоке, GPO-G1, выделенный из цитозоля клеток печении кишечника, а также неселеновый изофермент, идентичен GSТ.

Активность ферментов глутатионовой системы у долгожителей Прикарпатья, М ± m

Примечание.* – Достоверность различий с показателями группы сравнения (р < 0,05).

Результаты исследования функциональной активности генов GPO у мышей показали, что при нокаутном варианте в одном аллельном гене глутатитонпероксидазы имеют нормальний фенотип, нормальную продолжительность жизни [18]. Эти данные указывают на то, что данный фермент не является критическим для жизнедеятельности. Однако у мышей нокаутных по двум копиям и гена, рано развивается катаракта и наблюдаются дефекты в пролиферации вспомогательных мышечных клеток. Однако мыши, нокаутные по гену GPO-G4 (глутатионпероксидазы – 4), погибают в течение раннего эмбрионального развития. Существуют данные о том, что пониженный уровень глутатионпероксидазы – 4 может повышать продолжительность жизни у мышей [3]. Активность GPO в живих клетках увеличивается при действии ионизирующей радиации, акрилонитрила, интоксикации этанолом, при Е-авитаминозе. Особенно важна роль GPO в условиях окислительного стресса, поскольку предупреждает возникновение и развитие процессов пероксидации. GPO является одним из важнейших компонентов ферментативной антиоксидантной системы.

В реакциях, катализируемых GPO, образуется окисленный глутатион (GSSG), для его восстановления в клетках существует специальный фермент – глутатион редуктаза [17]. Не менее важной в системе детоксикации ксенобиотиков является глутатион-S-трансфераза. Основная функция GST – защита клеток от ксенобиотиков и продуктов перекисного окисления посредством их восстановления, присоединения к субстрату молекулы глутатиона или нуклеофильного замещения гидрофобных групп. Проведенные нами исследования показали, что активность GRD и GST у долгожителей составила (0,219 ± 0,12) и (0,305 ± 0,31) мкмоль/(мин·мг) (см. таблицу), в группе сравнения соответственно – (0,069 ± 0,05) и (0,345 ± 0,18) мкмоль/(мин·мг). Таким образом, полученные результаты показывают, что при почти одинаковой активности GST как в исследуемой, так и в группе сравнения активность фермента GRD у долгожителей в 3,17 раза больше чем у лиц зрелого возраста.

Изучив уровень продуктов ОМБ в плазме долгожителей, нами установлено снижение (р < 0,05) альдегидо- и кетонопроизводные нейтрального характера с максимальным поглощением при длине волны 356 и 370 нм до (1,142 ± 0,050), (1,048 ± 0,035) и (1,414 ± 0,176), (1,246 ± 0,098) в группе сравнения (рисунок).

Такая тенденция может свидетельствовать о лучшей регуляции синтеза и меньшей оксидации протеинов у долгожителей, увеличение активности протеаз, селективно расщепляющих оксидированные формы белков. Учитывая, что лица исследуемой и сравнительной групп находились в одинаковых экологических условиях, меньшая интенсификация ОМБ альдегидо- и кетонопроизводных нейтрального характера в долгожителей может указывать на лучшее функционирование защитных протирадикальних систем.

Исследование альдегидо- и кетонопроизводных основного характера показало, что у долгожителей по сравнению с лицами зрелого возраста более высокий уровень этих продуктов в плазме крови, однако эти различия не были статистически значимы (р > 0,05).

Изучение влияния различных токсических соединений на экспериментальных животных, по данным литературы [7], свидетельствует об изменениях уровня альдегидо- и кетонопроизводных основного характера, при этом отмечают, что отклонение 2,4 ДНФГидразонив основного характера менее выраженными.

В ряде исследований проанализирована роль молекулярных маркеров, ассоциированных со скоростью развития процессов старения [16–20]. В частности, вместо теории оксидативного стресса предлагается более универсальная «Зеленая теория старения».

Показатели окислительной модификации белков основной и группы сравнения

Согласно последней, старение рассматривается как результат макромолекулярних нарушений, вызванных действием различных эндогенных и экзогенных веществ и токсичных продуктов метаболизма, включая влияние и оксидативного стресса, и свободных радикалов, а продолжительность жизни определяется скоростью, с которой токсичные вещества удаляются из организма, и эффективностью исправления повреждений.

Выводы

1. Выявлено, что активность GPO у всех долгожителей составила (0,329 ± 0,18) мкмоль/(мин·мг), а в группе сравнения (0,353 ± 0,17) мкмоль/(мин·мг).
2. Доказано, что активность фермента GRD у долгожителей Прикарпатья в 3,17 раза больше по сравнению с лицами зрелого возраста.
3. Установлена тенденция к снижению активности GST у долгожителей (0,305 ± 0,31) мкмоль/(мин·мг) относительно показателей группы сравнения (0,345 ± 0,18) мкмоль/(мин·мг).
4. Диагностировано статистически достоверное снижение уровня продуктов ОМБ альдегидо- и кетонопроизводных нейтрального характера в основной группе относительно сравнительной.
5. Интенсификация процессов ОМБ у долгожителей сопровождалась увеличением альдегидо- и кетонопроизводных основного характера по сравнению с лицами зрелого возраста.
6. Полученные результаты могут свидетельствовать о лучшем функционировании у долгожителей защитных противорадикальных систем по сравнению с лицами зрелого возраста.

Рецензенты:

Ковальчук Л.Е., д.м.н., профессор кафедры медицинской биологии и медицинской генетики, ГВУЗ «Ивано-Франковский национальный медицинский университет», г. Ивано-Франковск;

Булык Р.Е., д.м.н., профессор кафедры медицинской биологии, генетики и фармацевтической ботаники Буковинского государственного медицинского университета, г. Черновцы.

Работа поступила в редакцию 04.02.2014.

Библиографическая ссылка