Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Лыков А.П. 1 Бондаренко Н.А. 1 Повещенко О.В. 1 Кабаков А.В. 1 Райтер Т.В. 1 Казаков О.В. 1 Стрункин Д.Н. 2 Повещенко А.Ф. 1 Коненков В.И. 1

---

1 ФГБУ «НИИ КЭЛ» СО РАМН

2 ФГБУ «НИИ КИ» СО РАМН

Неоадъювантная химиотерапия, направленная на подавление метастазирования, является обязательной при раке молочной железы приводит также и к угнетению процессов гемо- и лимфопоэза. В последнее время ведется исследование эффектов терапии больных с раком фрагментированной ДНК способной активировать защитные силы организма и предотвращать угнетение гемо- и лимфопоэза. Однако эффект экзогенной ДНК на процесс гемо- и лимфопоэза исследован недостаточно. Проведено исследование эффекта экзогенной ДНК при экспериментальном раке молочной железы у крыс линии Wistar на процесс гемо- и лимфопоэза, функциональную активность лимфоидных клеток. Терапия фрагментированной ДНК приводит к увеличению количества спленоцитов, более выраженному снижению количества клеток в костном мозге и отсутствие снижения количества костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

Статья в формате PDF

308 KB

экзогенная ДНК

рак молочной железы

полихимиотерапия

пролиферация

цитокинпродуцирующая активность

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. – М.: Практика, 1999. – 459 с.

2. Кудаева О.Т. Влияние препаратов, изменяющих соотношение Th1/Th2, на частоту развития клинических вариантов хронической реакции трансплантат против хозяина / О.Т. Кудаева, Е.В. Гойман, А.П. Лыков / БЭБИМ. – 2005. – № 9. – С. 325–327.

3. Кулигина Е.Ш. Эпидемиологические и молекулярные аспекты рака молочной железы // Практическая онкология. – 2010. – № 4. – С. 203–216.

4. Кухарев Я.В. Связь иммунологических показателей с эффективностью неоадъювантной химиотерапии у больных раком молочной железы / Я.В. Кухарев, М.Н. Стахеева, А.В. Дорошенко // СОЖ. – 2013. – № 2. – С. 50–57.

5. Масная Н.В. Реакция клеток кроветворных и лимфоидных органов у мышей разных линий на введение тимусзависимого антигена и циклофосфана / Н.В. Масная, А.А. Чурин, Е.Ю. Шерстобоев // БЭБИМ. – 2005. – № 1. – С. 42–47.

6. Масычева В.И. Изучение гемостимулирующей активности нуклеопротеидного комплекса, выделенного из плаценты человека / В.И. Масычева, Е.Д. Даниленко, Г.Г. Шимина // СОЖ. – 2012. – № 5. – С. 34–38.

7. Стенина М.Б. Перспективные направления развития лекарственной терапии рака молочной железы / М.Б. Стенина / Практическая онкология. – 2002. – № 4. – С. 262–272.

8. Стенина М.Б. Рак молочной железы: наиболее важные научные события и выводы последних лет / М.Б. Стенина, М.А. Фролова // Практическая онкология. – 2011. – № 1. – С. 6–11.

9. Чочиева А.Р. Химиопрофилактика рака молочной железы в эксперименте: автореф. дис. д-ра мед. наук. – 2010. – 47 с.

10. Alyamkina E.A. Effects of human exogenous DNA on production of perforin-containing CD8 + cytotoxic lymphocytes in laboratory setting and clinical practice / E.A. Alyamkina, O.Yu. Leplina, A.A. Ostanin / Cell. Immunol. – 2012. – Vol. 276. – Р. 59–66.

11. Pestina T.I. Mpl ligand prevents lethal myelosuppression by inhibiting p53-dependent apoptosis / T.I. Pestina, J.L. Cleveland, C. Yang // Blood. – 2001. – Vol. 98. – Р. 2084–2090.

12. Tian J. Effect of cyclophosphamide on murine bone marrow hematopoietic cells and its possible mechanism / J. Tian, P. Yu, W.X. Sun // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. – 2012. – Vol. 20. – Р. 1316–1321.

13. Wang Y. Role of the spleen in cyclophosphamide-induced hematosuppression and extramedullary hematopoiesis in mice / Y. Wang, Q. Meng, H. Qiao // Arch. Med. Res. – 2009. – Vol. 40. – Р. 249–255.

Высокая частота рака молочной железы и низкая эффективность традиционных методов терапии диктуют необходимость поиска новых средств неоадъювантной химиотерапии и средств, способных нивелировать побочные эффекты от такой терапии [3, 5, 7–8, 10–13]. Известно, что препараты нуклеиновых кислот, применяемые в терапии пациентов с онкологической патологией, способствуют активации как факторов неспецифической защиты организма, так и факторов специфической защиты организма [10]. Однако эффект экзогенной ДНК на гемо- и лимфопоэз при онкопатологии, в том числе и при РМЖ, изучен недостаточно.

Поэтому целью исследования стало изучение влияния полихимиотерапии на параметры иммунной системы in vivo на фоне лечения фрагментированной ДНК из плаценты человека у крыс линии Wistar с РМЖ, индуцированным введением метилнитрозомочевины.

Материалы и методы исследования

Эксперименты на лабораторных животных проведены в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755) и с соблюдением принципов Хельсинкской декларации BMA (2000). Эксперимент выполнен на 25 крысах-самках линии Wistar с массой 300–350 г. Животные содержались на стандартной лабораторной диете и имели свободный доступ к воде. РМЖ у 21 крысы линии Wistar индуцировали введением N-метил-N-нитрозомочевины (Sigma-Aldrich, США) 5 раз с интервалом в 7 дней подкожно в область одной и той же молочной железы (2-я молочная железа справа) [9]. Было сформировано 6 групп животных: 1-я группа – интактные особи (n = 4); 2-я группа – животным проведено только оперативное удаление пораженной молочной железы (n = 3); 3-я группа – животным проведено оперативное удаление пораженной молочной железы, подключена полихимиотерапия и введение фрагментированной ДНК (n = 5); 4-я группа – животным проведено оперативное удаление опухоли и проводилась полихимиотерапия (n = 5); 5-я группа – животным не удалялась опухоль молочной железы, но проводилась полихимиотерапия (n = 4). 6-ю группу составили животные, которым индуцировали РМЖ (опухоленосители), но не проводилось хирургическое вмешательство и полихимиотерапия (n = 4). Курс полихимиотерапии (ПХТ) включал в себя: 5-фторурацил (Ebewe, Австрия) из расчета 15 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии; метотрексат (Ebewe, Австрия) из расчета 2,5 мг/кг внутрибрюшинно на 1 и 8 день курса терапии; циклофосфан (ОАО «Биохимия», Саранск) из расчета 3 мг/кг внутрибрюшинно ежедневно однократно 14 дней. Курс терапии фрагментированной ДНК (5 мг/кг) проводили внутрибрюшинным введение однократно в течение 14 дней через 3 часа после введения циклофосфана. В экспериментах использовали субстанцию препарата Панаген с содержанием фрагментированной ДНК 1,7 мг/мл. Препарат Панаген (ЛСР № 004429/08 от 09.06.08) представляет собой фрагментированный нуклеопротеидный комплекс, выделенный из плаценты человека. Оперативное лечение проводили через 6 месяцев от момента индукции РМЖ. Животных из эксперимента выводили через 6 месяцев под наркозом (40 мг/кг нембутана внутрибрюшинно; Sigma-Aldrich, США), что обусловливалось необходимостью прижизненного сбора лимфы из грудного лимфатического протока. Ядросодержащие клетки костного мозга (КМ) получали при помощи перфузии бедренных костей лабораторных животных [2]. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) от линии крыс Wistar (n = 5) получали из клеток КМ. Ядросодержащие клетки КМ ресуспендировали в среде DMEM (Биолот, СПб) и пропускали через фильтр (размер пор 80 мкм) для удаления клеточного дебриса, подсчитывали количество жизнеспособных клеток. Для получения КМ-ММСК ядросодержащие клетки КМ инкубировали в пластиковых флаконах (TPP, Швейцария) в среде DMEM (Биолот, СПб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина сульфата (Дальхимфарм, Хабаровск), 2 мM L-глютамина (ICN, США) и 15 % FCS при 37 °С в атмосфере 5 % СО₂. Через 48 часов неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а прилипающую фракцию клеток культивировали до получения конфлюэнтного слоя. Снятие КМ-ММСК при пассировании осуществляли с использованием 0,25 % раствора трипсина/0,02 % раствора ЭДТА (ICN, США). Суспензию спленоцитов получали измельчением селезенки [2]. Мононуклеарные клетки (МНК) из лимфы получали осаждением при 1500 об/мин в течение 5 минут с последующей 2-кратной отмывкой в забуференном физиологическом растворе. Пролиферативный потенциал клеток КМ, спленоцитов и МНК из лимф оценивали в МТТ-тесте в присутствии и отсутствии Конканавалина А (Sigma-Aldrich, США) в дозе 10 мкг/мл оценивали спектрофотометрически (длина волны 492 нм) по включению 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолиум бромида – МТТ (Sigma-Aldrich, США) через 72 часа и выражали в условных единицах оптической плотности. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы Statistica 6.0, меры центральной тенденции и рассеяния описаны медианой (Ме), нижним (Lq) и верхним (Hq) квартилями; достоверность различия рассчитывалась по U-критерию Манна – Уитни, и принималась при значениях p < 0,05 [1].

Результаты исследования и их обсуждение

В серии опытов по оценке эффективности полихимиотерапии на фоне применения фрагментированной ДНК проведен анализ репаративной способности органов кроветворения и лимфопоэза после воздействия на организм повреждающих факторов. Как видно из таблицы, статистически значимых различий по количеству МНК в лимфе между группами не выявлено, что указывает на тот факт, что прошло достаточное время для восстановления пула циркулирующих лимфоцитов.

В то же время выявлены статистически значимые различия по количеству спленоцитов, ядросодержащих клеток КМ и КМ-ММСК в исследуемых группах животных. Так, отмечено статистически значимое увеличение количества спленоцитов в группе животных, подвергшихся только оперативному лечению, в группе животных, получавших только ПХТ и комбинацию ПХТ с введением фрагментированной ДНК по сравнению с контрольной группой животных и группой сравнения по РМЖ. Однако в группе животных, подвергшихся оперативному вмешательству с проведением неоадъювантной ПХТ, отмечено статистически значимое снижение количества спленоцитов в сравнении с остальными группами животных. Что касается количества клеток КМ, то выявлено статистически значимое снижение их количества во всех экспериментальных группах животных с РМЖ по сравнению с интактными животными. В то же время наиболее выраженное подавление количества клеток в КМ отмечено в группе животных, подвергшихся оперативному вмешательству и получавших ПХТ в комбинации с фрагментированной ДНК, в группе животных, получавших только ПХТ, и в контрольной группе животных по РМЖ. По количеству КМ-ММСК в исследуемых группах также выявлены статистически значимые различия. Так, выявлен парадоксальный факт статистически значимого увеличения количества КМ-ММСК в группе животных с РМЖ, подвергшихся только оперативному вмешательству по сравнению с остальными группами животных. Не выявлено статистически значимого различия по количеству КМ-ММСК между интактными животными и группой, получавшей терапию фрагментированной ДНК. Количество КМ-ММСК в группах, подвергшихся ПХТ без оперативного вмешательства или же с оперативным вмешательством, а также в контрольной группе по РМЖ, было статистически значимо меньшим по сравнению с интактными животными и группой крыс, получавших терапию фрагментированной ДНК.

Абсолютное количество мононуклеаров, спленоцитов, клеток костного мозга и костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток у крыс-самок линии Wistar (Me; Lq-Hq)

Примечания: МНК – мононуклеарные клетки; КМ – клетки костного мозга; КМ-ММСК – костномозговые мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки; ПХТ – полихимиотерапия; фрДНК – фрагментированная ДНК из плаценты человека; p – достоверность различий.

Таким образом, с учетом времени, прошедшего после проведения различных схем лечения животных с РМЖ, выявлена различная регенеративная способность органов кроветворения и лимфопоэза. Не всегда добавление к стандартной процедуре терапии РМЖ введение фрагментированной ДНК статистически значимо улучшала показатели гемо- и лимфопоэза.

Полученные результаты по количественному составу органов кроветворения и лимфопоэза также не противоречат литературным данным о нормализации состава периферической крови после введения цитостатических препаратов [5; 13]. Так, нами через 2 недели после окончания курса ПХТ у экспериментальных животных при РМЖ не выявлено статистически значимых различий по количеству мононуклеарных клеток в лимфе грудного протока между всеми группами животных, что указывает на тот факт, что органы гемопоэза преодолели повреждающее действие цитостатиков. Более того, транзиторная лимфопения, возникающая на фоне терапии цитостатиками способствует появлению в организме нового пула лимфоцитов, способных эффективно оказывать цитотоксический эффект на клетки опухоли [4]. Кроме этого, полученные данные о восстановлении пула мононуклеарных клеток в лимфе, в том числе и на фоне терапии экзогенной ДНК, согласуются с данными авторов, указывающих на стимуляцию процессов регенерации кроветворения введением чужеродной ДНК [6]. В то же время, на фоне терапии фрагментированной ДНК животных с РМЖ отмечено возрастание количества спленоцитов, ядросодержащих клеток костного мозга и костномозговых мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток по сравнению с контрольной группой по РМЖ. Нами не найдено литературных данных, в которых также бы исследовали количественный состав органов гемо- и лимфопоэза на фоне ПХТ и дополнительного введения экзогенной ДНК.

Заключение

Таким образом, терапия фрагментированной экзогенной ДНК способствует уменьшению цитопатического действия препаратов полихимиотерапии, но не способствует полному восстановлению функции органов гемо- и лимфопоэза.

Выражаем благодарность за техническую и организационную помощь в проведении экспериментов Алямкиной Е.А., Долговой Е.В., Рогачеву В.А. и Богачеву С.С., сотрудникам ИЦИГа.

Рецензенты:

Бгатова Н.П., д.б.н., зав. лабораторией ультраструктурных исследований, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск;

Горчаков В.Н., д.м.н., зав. лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы, ФГБУ «НИИКЭЛ» СО РАМН, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 04.06.2014.

Библиографическая ссылка