Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ИНГИБИРОВАНИЕ РОСТА КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЭПОКСИАЛАНТОЛАКТОНОМ И ЕГО ПРОИЗВОДНЫМИ

Пухов С.А. 1 Неганова М.Е. 1 Аникина Л.В. 1 Шевцова Е.Ф. 1 Афанасьева С.В. 1 Клочков С.Г. 1
1 ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук
Изучено действие природного сесквитерпенового лактона эпоксиалантолактона и его производных на выживаемость клеточной линии MCF7 и перекисное окисление липидов (ПОЛ), индуцируемое ионами железа. Исходное природное соединение не проявляет антиоксидантной активности в широком диапазоне концентраций, в то время как остальные синтезированные вещества эффективно ингибируют Fe3+-индуцированное ПОЛ. Эпоксиалантолактон и его производные ингибируют рост культуры клеточной линии MCF7 в дозозависимом виде за счет механизмов, связанных не только с продукцией свободных радикалов и влиянием на окислительные повреждения липидов. В большинстве случаев антиоксидантный потенциал этих соединений не препятствует проявлению их цитотоксичности по отношению к клеточной линии MCF7, что показано при предобработке клеток N-ацетилцистеином. Показано, что данные соединения могут представлять интерес в качестве потенциальных противоопухолевых агентов с различными мишенями действия.
сесквитерпеновые лактоны
аденокарцинома
апоптоз
активные формы кислорода
перекисное окисление липидов
1. Клочков С.Г., Афанасьева С.В., Пушин А.Н. Изомеризация производных алантолактона под действием кислот / Хим. прир. соед. – 2006. Т. 42, № 4. – С. 325–330.
2. Клочков С.Г., Афанасьева С.В., Булычев Ю.Н., Неганова М.Е., Шевцова Е.Ф. Синтез и биологическая активность конъюгатов изоалантолактона с триптаминами / Изв. акад. наук. Сер. хим. – 2012. – № 2. – С. 407–412.
3. Клочков С.Г., Ананьев И.В., Пухов С.А., Афанасьева С.В. Стереохимия аза-реакции Михаэля с участием природных алантолактонов / Хим. гет. соед. – 2012. – № 5. – С. 750–756.
4. Неганова М.Е., Блик В.А., Клочков С.Г., Чепурнова Н.Е., Шевцова Е.Ф.. Исследование антиоксидантных свойств нового триптаминового производного секуринина и его влияние на судорожную активность мозга при экспериментальной эпилепсии / Нейрохимия. – 2011. – Т. 28, № 3. – С. 236–243.
5. Apak R., Guclu K., Ozyurek M., Karademir S.E. Novel total antioxidant capacity index for dietary polyphenol and vitamins C and E, using their cupric ion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC Method // J. Agric. Food Chem. – 2004. – № 52. – P. 7970–7981.
6. Konishi T., Shimada Y., Nagao T., Okabe H., Konoshima T. Antiproliferative sesquiterpene lactones from the roots of Inula helenium // Biol. Pharm. Bull. – 2002. – Vol. 25, № 10. – P. 1370–1372.
7. Merfort I. Perspectives on sesquiterpene lactones in inflammation and cancer // Curr. Drug Targets. – 2011. – Vol. 12, № 11. – P. 1560–1573.
8. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays // J. Immunol. Meth. – 1983. – № 65. – P. 55–63.
9. Rasul A., Di J., Millimouno F.M., Malhi M., Tsuji I., Ali M., Li J., Li X.. Reactive oxygen species mediate isoalantolactone-induced apoptosis in human prostate cancer cells // Molecules. – 2013. – Vol. 5, № 18(8). – P. 9382–9396.
10. Zhang S., Won Y.K., Ong C.N., Shen H.M. Anti-cancer potential of sesquiterpene lactones: bioactivity and molecular mechanisms // Curr. Med. Chem. Anticancer Agents. – 2005. – Vol. 5, № 3. – P. 239–249.

В последнее время интенсивно исследуются сесквитерпеновые лактоны растений семейства сложноцветных (Asteraceae) и механизмы их противоопухолевого действия [7]. Противоопухолевая активность сесквитерпеновых лактонов реализуется в основном через индукцию апоптоза. Немаловажную роль в этом процессе играют влияние лактонов на клеточный редокс-статус, образование активных форм кислорода (АФК) и, как следствие, окислительные повреждения в клетке и запуск митохондриально-зависимого пути апоптоза [10]. Было показано, что сесквитерпеновые лактоны, выделенные из известного в народной медицине многих стран растения девясил высокий (Inula helenium L.), обладают выраженным антипролиферативным действием в отношении ряда культур опухолевых клеток [6]. Изоалантолактон (основной сесквитерпеновый лактон I. helenium) индуцирует апоптоз в различных опухолевых клеточных линиях. Данный эффект обеспечивается за счет регуляции белков семейства Bcl, активации ростовых факторов и каспазы-3, причем все эти процессы тесно связаны с образованием АФК [9]. В настоящем исследовании мы оценили влияние минорного сесквитерпенового лактона I. helenium – эпоксиалантолактона – и его производных на рост клеток аденокарциномы молочной железы человека и способность этих соединений индуцировать или предотвращать окислительные повреждения липидов мембран клеток.

Материалы и методы исследования

Исследуемые соединения

Эпоксиалантолактон выделяли из корней растения девясил высокий (Inula helenium L., сем. Asteraceae) по стандартной методике, препаративные количества эпоксиалантолактона получали эпоксидированием алантолактона [1]. Производные эпоксиалантолактона 1 и 2 получали реакцией нуклеофильного присоединения аминов по активированной экзометиленовой связи лактонного цикла (реакция Михаэля) (рис. 1) [2].

Реакция эпоксиалантолактона с аминами (общая методика). Смесь эпоксиалантолактона и соответствующего амина (10 %-й избыток) растворяли при перемешивании в метаноле и оставляли при комнатной температуре на ночь. По завершении реакции происходило образование продукта в виде осадка. При использовании в качестве нуклеофилов вторичных аминов были получены аминопроизводные эпоксиалантолактона 1 (15 соединений).

При проведении реакции с рядом первичных аминов, которые содержали дополнительный n- или π-донорный фрагмент, отделенный от аминогруппы углеводородным мостиком, нами были получены производные нового структурного типа – гидрированные бензо[g]фуро[4,3,2-cd]индолоны 2 [3]. Таким способом было получено 10 производных.

Строение всех полученных соединений было установлено с помощью спектральных методов и в ряде случаев подтверждено методом РСА.

pic_40.tif

Рис. 1. Получение эпоксиалантолактона и его производных

Культуры клеток

Культуру клеток человека MCF7 (ATCC® HTB22™) (аденокарцинома молочной железы) выращивали в среде EMEM (НПП ПанЭко) с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone®, Thermo Scientific), 2мM L-глутамина (НПП ПанЭко) и 1 % гентамицина (ОАО Биохимик) в качестве антибиотика и инкубировали при 37 °C в атмосфере CO2 (5 %).

Цитотоксичность

Цитотоксичность синтезированных соединений была определена по МТТ-тесту [8]. Клетки MCF7 сеяли в 96-луночный планшет (CELLTREAT™) в количестве 1∙104 клеток/200 мкл и культивировали при 37 °C в атмосфере CO2 (5 %). После 24 часов инкубации к культурам клеток были добавлены различные концентрации тестируемых соединений (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12 и 1,56 мкМ), и далее клетки культивировали в тех же условиях 48 часов. Для каждой концентрации эксперименты были выполнены в трех повторностях. Все вещества растворяли в ДМСО (PANREAC QUÍMICA S.L.U), конечная концентрация ДМСО в лунке не превышала 1 % и не была токсична для клеток. В контрольные лунки добавляли растворитель в количестве 1 %. После инкубации в каждую лунку было добавлено 20 мкл MTT (бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) (5 мг/мл) (Sigma-Aldrich) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 2 часов. Далее из планшетов удаляли среду и в каждую лунку добавляли по 100 мкл ДМСО для растворения образовавшихся кристаллов формазана. С помощью планшетного анализатора (Victor3, PerkinElmer) определяли оптическую плотность при 530 нм, за вычетом измеренного фонового поглощения при 620 нм. Значение концентрации, вызывающее 50 % ингибирование роста популяции клеток (IC50), было определено на основе дозозависимых кривых с помощью программного обеспечения OriginPro 9.0.

Определение интенсивности перекисного окисления липидов

Перекисное окисление липидов гомогената мозга крыс определяли по модифицированному ТБК-тесту [4]. В качестве инициатора ПОЛ гомогената мозга крыс выступали ионы трехвалентного железа (FeNH4(SO4)2·12H2O). Оптическую плотность регистрировали на планшетном анализаторе при длине волны 540 нм. В качестве контроля использовали гомогенат мозга крыс в отсутствие соединений, но с добавлением равного объёма растворителя.

Определение восстановительной активности соединений

Восстановительную активность исследуемых веществ устанавливали на основании их активности в реакции переноса электрона с использованием CUPRAC-теста [5]. В качестве вещества-стандарта использовали известный антиоксидант – тролокс. Значение тролокс-эквивалента определяли графически по величине оптической плотности с использованием калибровочного графика – концентрационной зависимости количества восстановленной меди от содержания тролокса.

Предобработка N-ацетилцистеином

Для определения роли окислительного стресса в процессе ингибирования роста клеточной линии аденокарциномы молочной железы при действии эпоксиалантолактона и его производных исследовали их цитотоксичность в присутствии N-ацетилцистеина – специфичного АФК-акцептора. Для этого в лунки с культивированными клетками MCF7 (кроме контроля) добавляли 3 мкл N-ацетилцистеина (5 мМ) (Sigma-Aldrich) в EMEM и инкубировали в течение 4 часов, после этого вносили исследуемые соединения (100 мкМ) и определяли значение IC50 согласно процедуре, приведенной выше.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что исходный эпоксиалантолактон не проявляет антиоксидантной активности в широком диапазоне концентраций, в то время как остальные синтезированные вещества эффективно ингибируют Fe3+ -индуцированное ПОЛ (табл. 1).

Для ряда соединений антиоксидантная активность в значительной степени может быть связана с восстановительной активностью, определяемой в CUPRAC-тесте. Это прежде всего относится к производным L05-0003, L05-5488n и L05-5488, более активным, чем тролокс, и производным L05-5272n, L05-5272st, близким по активности к тролоксу, которые оказывают и наиболее сильное ингибирование ПОЛ.

Таблица 1

Антиоксидантная активность соединений

№ п/п

Соединение

Ингибирование ПОЛ, % от контроля

CUPRAC-тест, ТЭ*

1.

Эпоксиалантолактон

― **

2.

L05-0123

76,28 ± 2,84

3.

L05-0003

77,69 ± 0,33

1,14 ± 0,12

4.

L05-5488n

87,39 ± 2,57

1,20 ± 0,06

5.

L05-5488

85,73 ± 1,83

1,20 ± 0,10

6.

L05-0181

82,36 ± 1,29

7.

L05-8019

72,95 ± 2,74

8.

L05-8031

79,99 ± 3,81

9.

L05-0020

10.

L05-5272n

71,78 ± 3,81

0,65 ± 0,04

11.

L05-5272st

73,57 ± 3,56

0,77 ± 0,07

12.

L05-0165n

77,34 ± 6,09

13.

L05-0165v

80,99 ± 3,69

0,30 ± 0,09

14.

L05-3008

64,76 ± 8,28

0,23 ± 0,04

15.

L05-0073

73,42 ± 11,05

0,22 ± 0,06

Примечания:

* тролокс-эквивалент;

** нет влияния.

Практически все исследованные соединения обладают выраженной цитотоксической активностью. Как показали проведенные эксперименты, воздействие эпоксиалантолактоном и его производными в течение 48 часов ингибирует рост культуры клеточной линии MCF7 (табл. 2) в дозозависимом виде. Следует отметить, что цитотоксическая активность ряда аддуктов эпоксиалантолактона (соединения L05-0003, L05-6640, L05-0218, L05-6605, L05-6747) превышает активность исходного соединения в несколько раз.

Предварительная обработка N-ацетилцистеином снижает токсический эффект исследуемых соединений в разной степени (рис. 2) вплоть до практически полного подавления цитотоксического эффекта соединения L05-5272n. В случае изоалантолактона в работе [4] было показано, что предварительная обработка различных опухолевых клеточных линий N-ацетилцистеином сохраняет жизнеспособность клеток, указывая, что цитотоксическое действие на клетки осуществляется в основном через генерацию АФК.

Таким образом, можно предположить, что в основе цитотоксической активности производных эпоксиалантолактона лежат механизмы, связанные не только с продукцией свободных радикалов и влиянием на окислительные повреждения липидов. В большинстве случаев антиоксидантный потенциал этих соединений не препятствует проявлению их цитотоксичности по отношению к клеточной линии MCF7. В то же время для соединений L05-5272n и L05-5702 (структурный тип 1) участие АФК-зависимых механизмов в гибели клеток MCF7 более выражено и цитотоксический эффект этих соединений в большей степени может быть предотвращён добавлением N-ацетилцистеина.

Таблица 2

Цитотоксичность соединений в отношении культуры опухолевых клеток MCF7

№ п/п

Соединение

IC50, мкM

1.

Эпоксиалантолактон

47,79 ± 1,65

2.

L05-0020

> 250,00

3.

L05-0073

176,76 ± 11,59

4.

L05-0165v

154,69 ± 11,45

5.

L05-0165n

169,89 ± 2,77

6.

L05-0181

184,65 ± 35,82

7.

L05-5272st

137,38 ± 0,24

8.

L05-5272n

64,46 ± 4,90

9.

L05-5488

138,85 ± 6,61

10.

L05-5488n

210,18 ± 3,61

11.

L05-8019

> 250,00

12.

L05-8031

176,76 ± 13,92

13.

L05-3008

119,40 ± 0,09

14.

L05-0123

243,62 ± 8,34

15.

L05-0003

23,73 ± 3,34

16.

L05-0619

77,06 ± 11,29

17.

L05-6616

151,48 ± 12,56

18.

L05-6640

18,37 ± 0,60

19.

L05-0218

23,55 ± 0,74

20.

L05-5702

40,47 ± 2,83

21.

L05-1073

91,73 ± 2,12

22.

L05-6605

19,30 ± 0,01

23.

L05-0140

40,47 ± 0,98

24.

L05-6747

11,21 ± 0,55

25.

L05-5418

24,31 ± 1,39

pic_41.wmf

Рис. 2. Выживаемость клеток MCF7, предобработанных N-ацетилцистеином, под действием исследуемых соединений

Исследование действия эпоксиалантолактона и его производных на трансмембранный потенциал митохондриий, высвобождение проапоптотических факторов из митохондрий и влияние на клеточный цикл поможет уточнить предполагаемый механизм действия полученных соединений. Вместе с тем наличие активных соединений с разными механизмами действия среди синтезированной серии аддуктов позволяет рассматривать их как основу для разработки агентов с высоким противоопухолевым потенциалом.

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума Российской академии наук «Фундаментальные науки – медицине».

Рецензенты:

Григорьев В.В., д.б.н., заведующий лабораторией нейрорецепции, ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук, ведомственная принадлежность Федеральное агентство научных организаций (ФАНО), г. Черноголовка;

Кинзирский А.С., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией фармакологии, ФГБУН «Институт физиологически активных веществ» Российской академии наук, ведомственная принадлежность Федеральное агентство научных организаций (ФАНО), г. Черноголовка.

Работа поступила в редакцию 26.08.2014.


Библиографическая ссылка

Пухов С.А., Неганова М.Е., Аникина Л.В., Шевцова Е.Ф., Афанасьева С.В., Клочков С.Г. ИНГИБИРОВАНИЕ РОСТА КЛЕТОК АДЕНОКАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЭПОКСИАЛАНТОЛАКТОНОМ И ЕГО ПРОИЗВОДНЫМИ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 9-9. – С. 1988-1992;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35174 (дата обращения: 10.12.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074