Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

МИЦЕЛЛЯРНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ПРИСУТСТВИИ СОЛЕЙ МЕТАЛЛОВ ПЕРЕМЕННОЙ ВАЛЕНТНОСТИ

Перевозкина М.Г. 1
1 ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья»
Разработана кинетическая модель экспресс-тестирования антиоксидантной активности различных классов органических соединений в условиях мицеллярного катализа. Подобраны оптимальные параметры каталитического окисления эфиров высших ненасыщенных жирных кислот в водно-липидной среде в зависимости от природы и концентрации солей металлов переменной валентности и поверхностно-активного вещества. Получен ряд каталитической активности солей металлов переменной валентности: Cu2+ > Co2+ > Fe2+ > Fe 3+ > Ni2+. Показан идентичный механизм действия стационарного антиоксиданта дибунола при окислении липидных субстратов в растворе хлорбензола в присутствии 6∙10-3 М инициатора 2,2′-азобисизобутиронитрила и водно-липидной системе в присутствии 2∙10-3 М хлорида меди (II), 1∙10-3 М цетилтриметиламмоний бромида. Рассчитана скорость инициирования в обеих системах, получены значения 6,2∙10-8 М∙с-1 и 6,8∙10-5 М∙с-1 в безводной и водно-липидной среде соответственно. Показано, что скорость окисления модельных субстратов в водно-липидной среде в 1000 раз выше, чем в безводной среде. Установлено, что a-токоферол проявлял слабую антиоксидантную активность при каталитическом окислении водно-липидных субстратов. Показана перспективность использования гетерогенной системы в качестве модели для изучения окисления липидных субстратов различной природы.
a-токоферол
дибунол (ионол)
антиоксидантная активность
каталитическое окисление
мицеллы
соли металлов переменной валентности
кинетическая модель
тестирование антиоксидантов
1. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. Кинетические особенности токоферолов как антиоксидантов. – Черноголовка, 1992. – 56 с.
2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. – 252 с.
3. Захаров И.В., Гелетий Ю.В., Адамян В.А. Кобальтбромидный катализ окисления органических соединений. III. Инициирующая реакция пероксидных радикалов с двухвалентным кобальтом // Кинетика и катализ. – 1988. – Т. 29, № 5. – С. 1072–1077.
4. Круглов Д.А. Влияние катионных поверхностно-активных веществ на окисление лимонена. Дисс. … канд. хим. наук. М., 2009. – 97 с.
5. Майзус З.К., Скибида И.П., Гагарина А.Б. Окисление углеводородов в жидкой фазе в присутствии соединений переменной валентности // Журнал физической химии. – 1975. – Т. 49. – № 1. – С. 2491–2503.
6. Паничева Л.П., Паничев С.А. Влияние структуры мицеллярных систем на каталитическую активность соединений металлов переменной валентности при окислении углеводородов (обзор) // Нефтехимия. – 1998. – Т. 38, № 1. – С. 3–14.
7. Перевозкина М.Г. Тестирование антиоксидантной активности полифункциональных соединений кинетическими методами: монография. – Новосибирск: Изд. СибАК, 2014. – 240 c.
8. Ушкалова В.Н., Перевозкина М.Г., Барышников Э.В. Разработка способа тестирования средств антиоксидантотерапии // Свободно-радикальное окисление липидов в эксперименте и клинике. – Тюмень, Изд. Тюм. ГУ, 1997. – С. 77–82.
9. Ohlson R. Fats and oils demetalization. Its influence on their oxidative stability // Proceedings of the third international symposium of metal-catalyzed lipid oxidation. – Paris, Institute de Corps, 1973. – P. 184–192.

Установлено, что процессы окисления липидов биомембран тонко сбалансированы и существует множество механизмов для их поддержания и регулирования в соответствии с потребностями клетки в данный момент времени. Особую роль в этих процессах играют катионы металлов, ферменты и ингибиторы окисления. Известны многочисленные работы по тестированию активности катионов металлов, которые относятся к катализу гомогенных липидных систем [3, 9]. Эти результаты имеют ограниченное значение для описания процессов окисления, протекающих в мицеллах. Мало работ, в которых сравниваются антиоксидантные свойства соединений различных классов в безводной и водно-липидной средах, в условиях инициирования и катализа. Поскольку большинство известных моделей для тестирования антиоксидантов (АО) являются гидрофобными, представлялось актуальным подобрать гидрофильную липидную систему и проверить её эффективность на примере стандартных ингибиторов окисления: дибунола и a-токоферола. Настоящая работа является продолжением ранее начатых исследований [8].

Цель исследования – разработка кинетического метода экспресс-тестирования антиоксидантной активности различных классов органических соединений в условиях мицеллярного катализа, изучение в этой модели стандартных антиоксидантов: дибунола и α-токоферола.

Материалы и методы исследования

Окисление метиллинолеата (МЛ) изучали волюмометрическим методом поглощения кислорода в модифицированной установке типа Варбурга в присутствии (10–4–10–2 М) цетилтриметиламмоний бромида (ЦТМАБ) в качестве поверхностно-активного вещества (ПАВ), с добавками солей металлов переменной валентности (10–6–10–1 М) в пробе при t = (60 ± 0,2) °С, Wi = 6,8∙10–5 М∙с–1. Антиоксиданты добавляли в диапазоне концентраций (1∙10–8–1∙10−1) М. Соотношение липидов и воды составляло 1:3, общий объем пробы 4 мл. В качестве критериев оценки антиоксидантных свойств соединений использовали – периоды индукции (t), начальные и максимальные скорости окисления (Wнач, Wmax). Скорость инициирования определяли уравнением Wi = f[InH]/ti, где f – стехиометрический коэффициент ингибирования; [InH] – концентрация ингибитора (дибунола); ti – период индукции.

Результаты исследования и их обсуждение

Разработка кинетического метода базировалась на исследовании активности солей металлов переменной валентности: сульфата железа (II), хлорида железа (III), хлорида никеля (II), хлорида кобальта (II), хлорида меди (II) в водно-липидных субстратах. Для эмульгирования модельного субстрата использовали поверхностно-активное соединение цетилтриметиламмоний бромид.

В присутствии катализатора известны следующие реакции зарождения и продолжения цепей [2, 5], при этом наблюдается цикличность окисленной (Cu2+) и восстановленной (Cu1+) формы ионов:

RH + Cu2+ → R● + Cu1+ + H+;

ROOH + Cu1+ → RO● + OH- + Cu2+ ;

ROOH + Cu2+ → RO2● + H+ + Cu1+ .

Механизм действия катализатора при окислении липидного субстрата может быть описан по характеру кинетических кривых (КК). Из рис. 1 видно, что в сравнимых концентрациях наиболее эффективным катализатором является хлорид меди (II). Для него отмечается наибольшая скорость процесса, оцениваемая из наклона КК. При сопоставлении абсолютных значений Wмах исследуемые катализаторы располагаются в следующем порядке:

NiCl2 < FeCl3 < FeSO4 < CoCl2 < CuCl2.

Действие упомянутых выше солей было изучено в широком диапазоне концентраций для отбора среди них наиболее эффективных катализаторов. На рис. 2 приведены закономерности изменения максимальной скорости процесса от концентрации катализатора. Можно видеть, что концентрационные зависимости для всех веществ носят экстремальный характер, экстремумы проявляются в разных диапазонах. Скорости окисления липидных субстратов в присутствии хлорида никеля (II) и хлорида железа (III) выходят на максимум при 1,0∙10–3 М, далее с ростом концентрации их значение не меняется. Максимальная скорость при окислении с добавками сульфата железа (II) отмечается в диапазоне (0,1–1,0) ∙10–3 М (табл. 1). Зависимость максимальной скорости от добавок хлорида кобальта (II) имеет максимум при концентрации (9–11)∙10–3 М. Скорость окисления субстрата в присутствии хлорида меди (II) выше в 5 раз по сравнению с добавками солей других металлов и при концентрации 2∙10–3 М составляет (26,3 ± 0,3)∙10–5 М∙с–1 (табл. 1).

pic_20.wmf

Рис. 1. Кинетика окисления метиллинолеата в водно-липидной среде в присутствии добавок солей металлов в концентрации 1∙10–3 М: 1 – CuCl2 2∙10−3 М; 2 – CuCl2; 3 – FeSO4; 4 – CoCl2; 5 – FeCl3; 6 – NiCl2; 1∙10−3 М ЦТМАБ; t = 60 °С

pic_21.wmf

Рис. 2. Зависимость стационарных скоростей окисления метиллинолеата в присутствии солей катализаторов от их концентрации, М: 1 – CuCl2; 2 – CoCl2; 3 – FeSO4; 4 – NiCl2; 5 – FeCl3; 1∙10−3 М ЦТМАБ, t = 60 °С

Таблица 1

Кинетические параметры окисления метиллинолеата (МЛ) в присутствии металлов переменной валентности, t = 60 °С, С ЦТМАБ = 1∙10-3 М, липиды:вода - 1:3, [Kat] - концентрация катализатора

[Kat], М

[Kat]/[МЛ]

Wнач ∙10-5, М∙с-1

Wmax ∙10-5, М∙с-1

Хлорид железа (III)

1∙10-4

1:1000

2,7

3,7

2∙10-4

1:500

3,1

6,5

5∙10-4

1:200

3,0

3,6

7∙10-4

1:135

3,0

4,4

1∙10-3

1:100

2,3

3,2

2∙10-3

1:50

1,7

3,5

5∙10-3

1:20

1,7

3,5

1∙10-2

1:10

3,0

5,3

5∙10-2

1:2

2,0

3,9

1∙10-1

1:1

3,0

4,9

Сульфат железа (II)

1∙10-6

1:100000

3,1

5,1

5∙10-6

1:20000

3,4

5,7

1∙10-5

1:10000

7,6

6,6

5∙10-5

1:2000

3,8

7,2

1∙10-4

1:1000

8,5

8,3

2∙10-4

1:500

6,2

9,1

5∙10-4

1:200

3,8

4,9

1∙10-3

1:100

6,8

5,9

2∙10-3

1:50

6,8

6,1

1∙10-2

1:10

6,8

5,4

1∙10-1

1:1

6,8

5,7

Хлорид никеля (II)

1∙10-4

1:1000

1,3

3,1

2∙10-4

1:500

1,4

3,3

1∙10-3

1:100

3,5

4,1

[Kat], М

[Kat]/[МЛ]

Wнач ∙10-5, М∙с-1

Wmax ∙10-5, М∙с-1

2∙10-3

1:50

2,4

3,2

5∙10-3

1:20

2,3

3,8

1∙10-2

1:10

2,4

4,3

5∙10-2

1:2

2,2

4,6

1∙10-1

1:1

1,7

4,7

2∙10-1

1:0,5

3,0

4,4

Хлорид кобальта (II)

1∙10-4

1:1000

10,0

4,2

2∙10-4

1:500

9,1

4,1

5∙10-4

1:200

3,2

10,2

1∙10-3

1:100

11,4

6,8

2∙10-3

1:50

14,2

7,3

5∙10-3

1:20

2,3

10,4

1∙10-2

1:10

5,7

24,4

5∙10-2

1:2

14,3

4,5

1∙10-1

1:1

5,7

7,4

Хлорид меди (II)

1∙10-6

1:100000

3,5

9,6

1∙10-5

1:10000

5,7

4,3

1∙10-4

1:1000

3,7

5,7

1∙10-3

1:100

8,6

14,5

2∙10-3

1:50

14,4

26,3

5∙10-3

1:20

13,7

15,0

1∙10-2

1:10

12,8

8,6

2∙10-2

1:5

11,3

8,9

5∙10-2

1:2

5,7

15,4

1∙10-1

1:1

8,5

14,5

Ранее каталитическое действие металлов переменной валентности изучалось при окислении растительных масел, модельных липидных субстратов [9]. Был получен ряд активности катионов:

Cu2+ > Mn2+ > Fe2+ > Cr2+ > Ni2+ >> Zn2+.

Как видно из приведенных выше данных, изученные соли вписываются в указанный ряд активности металлов, а хлорид меди обладает наибольшей каталитической активностью при наименьшей концентрации 2∙10–3 М.

Следующим этапом создания модели для тестирования биоантиоксидантов был выбор концентрации ПАВ. Известно [6], что скорость окисления в гомогенных системах ниже, чем в эмульсиях, и зависит от степени ее дисперсности.

В работе [2] установлено, что соотношение констант скорости роста и обрыва цепей при инициированном окислении кумола в эмульсиях и гомогенной системе определяется 5,5:1 и равно 110 и 20 соответственно. В нашем эксперименте было установлено, что скорость окисления МЛ в водно-липидной среде в 1000 раз выше, чем в безводной среде. При выборе оптимальной добавки ЦТМАБ исследовали диапазон концентраций (10-4–10−2) М. Установлено, что с ростом концентраций ПАВ скорость процесса проходит через максимум, соответствующий концентрации 1∙10−3 М (рис. 3). Дальнейшее повышение концентрации ПАВ приводит к снижению скорости окисления. Указанную концентрацию детергента, обеспечивающую наибольшую скорость реакции, можно рекомендовать для использования в гетерогенных моделях окисления. Методом Ребиндера и рефрактометрическим методом была определена критическая концентрация мицеллообразования ЦТМАБ (1,0 ± 0,2)∙10−3 М, что соответствовало кинетическим данным. Механизм каталитического окисления углеводородов (липидов) в водно-эмульсионной среде сводится к следующему. В присутствии ЦТМАБ формируются мицеллы [4]. Добавки катионного ПАВ усиливают мицеллообразование, при этом катионы внедряются в промежутки между углеводородными «хвостами» с образованием двойного электрического слоя. С выработкой свободных радикалов высших жирных кислот катионы катализатора должны иметь доступ к гидрофобным хвостам субстрата. При низких концентрациях катионы имеют большую вероятность донорно-акцепторного взаимодействия с эфирными группами субстрата, приводящего к образованию в присутствии катализатора свободных радикалов по реакции

Me(n+1)+ + RH + O2 → Men+ + R + HO2

pic_22.wmf

Рис. 3. Кинетика окисления метиллинолеата в водно-липидной среде в присутствии 2·10-3 М CuCl2 и добавок ЦТМАБ, М: 1 - 1·10-3; 2 - 5·10-4; 3 - 5·10-3; 4 - 1·10-2; 5 - 1·10-4; t = 60 °С

Вероятно, существуют оптимальные концентрации ЦТМАБ, при которых количество контактов катионов катализатора, сложного эфира и кислорода максимально. При увеличении концентрации ПАВ количество катионов на поверхности мицеллы возрастает, происходит их более интенсивное отталкивание, приводящее к снижению скорости зарождения цепей и скорости процесса. В соответствии с приведенной гипотезой добавки 1∙10−3 М ЦТМАБ являются оптимальными, обеспечивающими максимальный контакт катионов меди и кислорода с жирно-кислотными радикалами. Увеличение концентрации ЦТМАБ снижает количество таких контактов и скорость процесса соответственно. В результате проведенных исследований нами была предложена новая кинетическая модель для экспресс-тестирования биоантиоксидантов: модельный субстрат содержит 1 мл эфиров высших ненасыщенных жирных кислот (липиды), 1 мл водного раствора 2∙10−3 М хлорида меди (II) в конечной концентрации, 1 мл водного раствора 1∙10−3 М ЦТМАБ в конечной концентрации, соотношение липиды-вода 1:3, добавляют 1 мл воды или раствора исследуемого антиоксиданта (или точную навеску антиоксиданта), общий объем пробы 4 мл, смесь перемешивают на магнитной мешалке, помещают в термостатируемую при t = (60 ± 0,2) °С ячейку (схема манометрической установки приведена в работе [7]). Пробу насыщают кислородом, соединяют с волюмометрической системой, измеряют объем поглощенного кислорода во времени без добавок биоантиоксидантов и в присутствии их в различных концентрациях. При известных скоростях инициирования и оптимальных концентрациях ингибитора рассчитывают антирадикальную активность по величине параметра fK7, по периоду индукции (t) определяют суммарную антиоксидантную активность. Сравнение начальных и максимальных скоростей и характера КК позволяет оценить механизм действия антиоксидантов.

Для доказательства свободнорадикального механизма каталитического окисления липидного субстрата использован метод ингибиторов. Проведено исследование закономерностей окисления модельного субстрата в присутствии добавок стационарных ингибиторов окисления дибунола и a-токоферола. По результатам эксперимента рассчитаны кинетические параметры окисления субстратов. В нашем исследовании показан идентичный характер кинетических кривых окисления метиллинолеата в растворе хлорбензола в присутствии 6∙10−3 М инициатора 2,2′-азобисизобутиронитрила и водно-липидной системе в присутствии 2∙10−3 М хлорида меди при равных концентрациях дибунола (рис. 4). Показано, что в водно-липидной среде дибунол проявляет себя как сильный ингибитор: наблюдается период полного торможения, период аутоускорения и достижения максимальной скорости окисления. Периоды индукции увеличиваются пропорционально увеличению концентрации дибунола (табл. 2). Наличие торможения в присутствии добавок дибунола является признаком радикально-цепного механизма процесса, а отсутствие комплексообразующей способности с катионами меди происходит благодаря экранированию двумя трет-бутильными заместителями гидроксильной группы в его структуре. По наклону прямой в координатах t [InH] была рассчитана скорость инициирования в обеих системах, получены значения 6,2∙10–8 и 6,8∙10–5 М∙с–1 в безводной и водно-липидной среде соответственно. Максимальные скорости окисления метиллинолеата при t = (60 ± 0,2) °С, равные 2,6∙10–7 М∙с–1 и 2,6∙10–4 М∙с–1 в безводной и водно-липидной среде соответственно, различаются в 1000 раз.

pic_23.wmf

Рис. 4. Кинетика окисления метиллинолеата в присутствии добавок дибунола в водно-липидной среде, М: 1 - контроль; 2 - 1·10-5; 3 - 5·10-5; 4 - 1·10-4; 5 - 5·10-4; 2·10-3 М CuCl2; t = 60 °С

Таблица 2

Кинетические параметры окисления метиллинолеата в водно-липидной среде в присутствии 2∙10-3 М CuCl2 в зависимости от концентрации a-токоферола и дибунола, t = 60 °С, [InH] - концентрация ингибитора

[InH], М

t, мин

Wнач∙10-5, М∙с-1

Wmax∙10-4, М∙с-1

Контроль МЛ

5

14,4

2,6

a-токоферол

1∙10-8

10

14,0

2,1

1∙10-7

15

11,0

2,1

1∙10-6

20

9,7

1,9

1∙10-5

25

6,8

1,8

1∙10-4

35

5,2

1,4

1∙10-3

15

14,6

3,2

1∙10-2

6

15,7

3,4

1∙10-1

5

16,8

5,7

дибунол

1∙10-6

30

13,8

2,5

1∙10-5

40

12,7

2,3

2∙10-5

75

9,8

2,1

5∙10-5

130

5,0

1,9

1∙10-4

160

4,1

1,8

2∙10-4

180

3,8

1,7

5∙10-4

270

3,1

1,6

8∙10-4

430

2,3

1,6

1∙10-3

590

1,9

1,5

pic_24.wmf

Рис. 5. Кинетика окисления метиллинолеата в водно-липидной среде в присутствии добавок a-токоферола, М: 1 - 1·10-1; 2 - 1·10-2; 3 - 1·10-3; 4 - контроль; 5 - 1·10-8; 6 - 1·10-7; 7 - 1·10-6; 8 - 1·10-5; 9 - 1·10-4; 2·103 М CuCl2, 1·103 М ЦТМАБ, t = 60 °С

Известно, что a-токоферол характеризуется высокой константой скорости реакции с пероксильными радикалами K7 = (3,3 – 3,5)∙106 М–1∙с–1, что на два порядка превышает аналогичные константы скорости для дибунола K7 = 2,6∙104 М–1∙с–1 [1]. Известен сложный механизм действия a-токоферола в безводных углеводородных и липидных субстратах, его участие не только в реакциях обрыва цепей, но и реакциях продолжения цепей и распаде гидропероксидов. Последние реакции приводят к снижению антиоксидантной активности a-токоферола.

На рис. 5 показано, что a-токоферол в водно-липидной среде проявлял слабые антиоксидантные свойства, в концентрациях свыше 1∙10−3 М промотировал процесс окисления липидных субстратов, при концентрации (1∙10–8–1∙10–6) М a-токоферол незначительно уменьшал максимальную скорость, без заметного влияния на начальные стадии окисления. В присутствии 1∙10–5 и 1∙10–4 М a-токоферола наблюдалось замедление начальных стадий окисления и уменьшение максимальной скорости (табл. 2). В процессе окисления a-токоферол образует достаточно активные токофероксильные радикалы (In), способные участвовать в побочных реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата (RH) [1]:

In + RH → R + InH.

Не исключается возможность a-токоферола образовывать комплексные соединения с катионами меди (II), которые приводят к снижению его антиоксидантных свойств.

Выводы

1. Разработана кинетическая модель экспресс-тестирования биоантиоксидантов в водно-липидной каталитической среде, выбраны оптимальные концентрации катализатора и поверхностно-активного вещества.

2. Получен ряд каталитической активности солей металлов переменной валентности при концентрации 2∙10−3 М:

Cu2+ > Co2+ > Fe2+ > Fe3+ > Ni2+.

3. Показан идентичный механизм действия стационарного антиоксиданта дибунола при окислении безводных и водно-липидных субстратов в условиях инициирования и катализа.

4. Установлена слабая антиоксидантная активность a-токоферола при каталитическом окислении водно-липидных субстратов.

Разработанный способ тестирования биоантиоксидантов волюмометрическим методом с использованием каталитического окисления водно-липидных (эмульсионных) субстратов был внедрен в НИИ клинической и профилактической кардиологии СО РАМН.

Рецензенты:

Ерёмин Д.И., д.б.н., профессор кафедры почвоведения и агрохимии, ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья», г. Тюмень;

Грехова И.В., д.б.н., профессор кафедры общей химии, ФГБОУ ВПО «Государственный аграрный университет Северного Зауралья», г. Тюмень.

Работа поступила в редакцию 14.12.2014.


Библиографическая ссылка

Перевозкина М.Г. МИЦЕЛЛЯРНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ПРИСУТСТВИИ СОЛЕЙ МЕТАЛЛОВ ПЕРЕМЕННОЙ ВАЛЕНТНОСТИ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 12-8. – С. 1656-1662;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=36417 (дата обращения: 08.12.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074