Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,674

БИОКОНВЕРСИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО СУБСТРАТА МИСКАНТУСА В ЭТАНОЛ

Байбакова О.В. 1
1 ФГБУН «Институт проблем химико-энергетических технологий» Сибирского отделения Российской академии наук
Установлено, что химическая предобработка мискантуса раствором азотной кислоты в одну стадию позволяет получать субстрат с высокой реакционной способностью к ферментативному гидролизу: выход редуцирующих веществ при последовательном процессе осахаривания-сбраживания (ППОС) составил 65,4 г/л, при одновременном процессе осахаривания-сбраживания (ОПОС) – 64,5 г/л. Исследована возможность получения биоэтанола на среде ферментативного гидролизата лигноцеллюлозного субстрата мискантуса с помощью дрожжей Saccharomyces сerevisiae ВКПМ Y-1693. При ППОС синтезируется биоэтанол с выходом 70,9 % от теоретического, выход биоэтанола из 1 т мискантуса составляет 19,4 дал. При ОПОС биоэтанол синтезируется с выходом 83,7 % от теоретического, а выход биоэтанола из 1 т мискантуса – 22,6 дал. Показано, что при проведении процессов осахаривания-сбраживания выход биоэтанола увеличивается в 1,2 раза по сравнению с последовательным процессом. ОПОС позволяет сократить продолжительность стадий в 1,5 раза и исключить фильтрацию промежуточного продукта – ферментативного гидролизата.
биоэтанол
лигноцеллюлозный субстрат
мискантус
ферментативный гидролизат
спиртовое брожение
1. Гисматулина Ю.А. Исследование химического состава мискантуса сорта Сорановский урожая 2013 года // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 1–1. – С. 47–50.
2. ГОСТ Р 51135-2003. Изделия ликеро-водочные. Правила приемки и методы анализа. Технические требования. – Введ. 1998-03-02. – М.: ИУС, 2003. – 116 с.
3. ГОСТ Р 51786-2001. Водка и спирт этиловый из пищевого сырья. Газохроматографический метод определения подлинности. – М.: Изд-во стандартов, 2001. – 8 с.
4. Baibakova O.V., Skiba E.A. Biotechnological Aspects of Ethanol Biosynthesis from Miscanthus // Russian Journal of Genetics: Applied Research. – 2015. – Vol. 5, № 1. – Р. 69–74.
5. Gismatulina Yu.A., Budaeva V.V., Veprev S.G., Sakovich G.V., Shumny V.K. Cellulose from Various Parts of Soranovskii Miscanthus // Russian Journal of Genetics: Applied Research. – 2015. – Vol. 5, № 1. – Р. 60–68.
6. Hu F., Ragauskas A. Pretreatment and Lignocellulosic Chemistry // Bioenerg. Res. – 2012. – № 5. – P. 1043–1066.
7. Somerville C., Youngs H., Taylor C., Davis S.C., Long S.P. Feedstocks for lignocellulosic biofuels // Science. – 2010. – V. 329. – P. 790–792.
8. Wagschal K. Plant cell walls to ethanol // Biochem. J. – 2012. – № 442. – P. 241–252.

Биомасса является возобновляемым ресурсом и привлекает внимание в качестве альтернативы ископаемому топливу, а производство этанола из биомассы (биоэтанол) представляет собой практическую альтернативу бензину. Преобразование растительных клеточных стенок представляет собой получение биоэтанола второго поколения [8]. Лигноцеллюлоза – это самая распространенная биомасса на земле. Однако прочность биомассы стала главным фактором, влияющим на производство биотоплива [7]. Целлюлозосодержащее сырье представляет собой прочную матрицу, образованную целлюлозой, гемицеллюлозой и лигнином; взаимосвязь этих компонентов обусловливает устойчивость матрицы ко всем внешним воздействиям, поэтому для ее деструкции применяют различные способы предобработки. Следовательно, предобработка служит важным этапом устранения прочности сырья и повышения выхода сбраживаемых сахаров на этапе энзиматического разрушения [6]. Наиболее перспективным для России сырьем в производстве биоэтанола является непищевое целлюлозосодержащее сырьё (древесина, солома, отходы обработки зерна), поскольку крахмало- и сахаросодержащее сырьё дорого и в наших природно-климатических условиях может быть использовано только для выработки спирта пищевого и медицинского назначения. В ИПХЭТ СО РАН в качестве сырья используется возобновляемый источник сырья: биомасса энергетической злаковой культуры – Мискантус китайский (М). Сейчас это растение позиционируют в качестве перспективного целлюлозосодержащего сырья для производства целлюлозы и продуктов ее модификации [1, 4–5]. Целью данной работы являлось исследование ферментативного гидролиза в водной среде лигноцеллюлозного субстрата (ЛЦС) из мискантуса и последующее получение биоэтанола, а также изучение влияния последовательности технологических стадий осахаривания-сбраживания на процесс биосинтеза этанола.

Материалы и методы исследования

Субстратом для получения биоэтанола являлся ЛЦС мискантуса, полученный на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН в одну стадию обработкой мискантуса разбавленным раствором азотной кислоты при температуре 90–96 °С. Определение основных характеристик субстрата (массовой доли (м.д.) целлюлозы по Кюршнеру, м.д. пентозанов, м.д. кислотонерастворимого лигнина, зольность) проводилось по стандартным методикам. Характеристики ЛЦС М представлены в табл. 1.

Таблица 1

Характеристики используемого субстрата

Характеристики м.д., %

ЛЦС М

Целлюлоза по Кюршнеру

88,6

Пентозаны

7,9

Кислотонерастворимый лигнин

10,8

Зольность

4,8

В работе использовались ферментные препараты «Целлолюкс-А» (производитель ПО «Сиббиофарм», Бердск) и «Брюзайм BGX» (производитель «Polfa Tarchomin Pharmaceutical Works S.A.», Польша, для компании «Diadic International Inc.», США). Препарат «Целлолюкс-А» позиционируется на рынке как целлюлаза для расщепления некрахмалистых полисахаридов, «Брюзайм BGX» – как гемицеллюлаза.

Технологические стадии осахаривания и сбраживания в данной работе проводились последовательно и одновременно. Для проведения процессов в колбу Эрленмейера емкостью 1000 мл помещали навеску субстрата и дистиллированную воду. Концентрация субстрата составила 90 г/л.

При последовательном процессе осахаривания-сбраживания (ППОС) ферментолиз проводился в водной среде при рН 4,6–4,7 и при непрерывном перемешивании на платформе «ПЭ – 6410 М» с частотой 150 мин-1. Температура гидролиза составляла (46 ± 2) °С, продолжительность – 72 ч. Мультиэнзимная композиция вносилась следующим образом: «Целлолюкс – А» в расчете 0,04 г фермента на 1 г субстрата и «Брюзайм BGX» в расчете 0,2 г фермента на 1 г субстрата. Полученный ферментативный гидролизат стерилизовался методом автоклавирования при 0,5 атм в течение 40 мин.

При одновременном процессе осахаривания–сбраживания (ОПОС) ферментолиз проводился в приведённых выше условиях, но его продолжительность составила 24 ч, после этого среда охлаждалась до 28 °С, вносились засевные дрожжи и в течение трех последующих суток проводилось спиртовое брожение, совмещенное с осахариванием.

Концентрация редуцирующих веществ (РВ) в пересчете на глюкозу определялась спектрофотометрически с помощью реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты на «UNICO UV-2804». Выход редуцирующих веществ (РВ) рассчитан с учетом коэффициента 0,9, обусловленного присоединением молекулы воды к ангидроглюкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате ферментативного гидролиза.

Ферментативные гидролизаты ЛЦС М сбраживались с помощью дрожжей Saccharomyces сerevisiae Y-1693 (ФГУП «ГосНИИГенетика», г. Москва). Доза инокулята составляла 10 %. Дрожжи находились в экспоненциальной фазе развития имели следующие характеристики: общее количество – 141,5 млн КОЕ/мл, из них почкующихся – 27,6 %. Спиртовое брожение проводилось в анаэробных условиях при 28 °С в течение трех суток.

Объемная доля спирта в бражках определялась ареометром в дистилляте, полученном перегонкой спирта из бражки согласно ГОСТ Р 51135-2003 [2]. По крепости полученных бражек и концентрации РВ в исходной среде рассчитывался выход биоэтанола. Теоретическая концентрация этанола рассчитывалась по стехиометрическому уравнению брожения, выход биоэтанола – как отношение экспериментальной концентрации этанола к теоретической. Полученные образцы биоэтанола концентрировались методом простой перегонки, дополнительной очистки не проводилось. Анализ этанола выполнен методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) по ГОСТ Р 51786-2001 [3] на газовом хроматографе с пламенно-ионизационным детектором «Кристалл 2000М» фирмы «СКБ Хроматэк».

Результаты исследования и их обсуждения

На рисунке представлена зависимость концентрации РВ от продолжительности процессов осахаривания-сбраживания ЛЦС М, проводимых последовательно и одновременно.

Полученные результаты показали, что при ППОС накопление РВ происходит через 72 ч и составляет 65,4 г/л, а при ОПОС – через 32 ч и составляет 64,5 г/л. Это можно объяснить тем, что при добавлении дрожжей в ОПОС через 24 ч от начала процесса РВ начинают расходоваться на синтез этанола, то есть они отводятся из системы, и, таким образом, равновесие суммарной ферментативной реакции гидролиза целлюлозы постоянно смещается в сторону образования продуктов реакции. Этим достигается интенсификация процесса осахаривания.

Эффективность конверсии целлюлозы в РВ для ППОС составила 72,6 %, а для ОПОС – 71,6 %. Таким образом, химическая предобработка мискантуса в одну стадию методом азотнокислой варки позволяет получать качественный субстрат с высокой реакционной способностью к ферментолизу. Результаты спиртового брожения ферментативного гидролизата ЛЦС мискантуса при проведении процессов осахаривания-сбраживания последовательно и одновременно представлены в табл. 2.

baib1.wmf

Зависимости концентрации РВ от продолжительности процессов при последовательном и одновременном осахаривании-сбраживании ЛЦС М

Таблица 2

Результаты ферментолиза и спиртового брожения при проведении технологических стадий последовательно и одновременно для ЛЦС М

Показатель

ППОС

ОПОС

Концентрация РВ в ферментативном гидролизате, г/л

65,4

64,5

Крепость бражки, об. %

3,0

3,5

Остаточная концентрация РВ в бражке, г/л

10,0

8,3

Выход биоэтанола, % от теоретического

70,9

83,7

Выход биоэтанола из 1 т сырья, дал

19,4

22,6

Таблица 3

Содержание примесей в опытных образцах биоэтанола из ЛЦС М

Показатель

Опытные образцы биоэтанола при

ППОС

ОПОС

Массовая концентрация альдегидов, в пересчёте на безводный спирт, мг/дм3, не более

6100

4100

Массовая концентрация сивушного масла, в пересчёте на безводный спирт, мг/дм3, не более

2500

2400

Массовая концентрация эфиров, в пересчёте на безводный спирт, мг/дм3, не более

70

100

Содержание метанола в пересчёте на безводный спирт, об. %, не более

0,002

0,002

При ППОС синтезируется биоэтанол с выходом 70,9 % от теоретического, выход биоэтанола из 1 т М составляет 19,4 дал. При ОПОС биоэтанол синтезируется с выходом 83,7 % от теоретического, а выход биоэтанола из 1 т М – 22,6 дал. Сравнение синтеза биэтанола, полученного при проведении процесса осахаривания-сбраживания последовательно и одновременно, показывает, что при одновременном процессе выход этанола увеличивается в 1,2 раза по сравнению с последовательным процессом.

Кроме того, при ОПОС исключается стадия фильтрования ферментативного гидролизата и в 1,5 раза сокращается продолжительность технологических стадий: для ППОС требуется 6 суток, для ОПОС – 4 суток. При ОПОС остаточная концентрация редуцирующих веществ в бражке ниже на 1,7 г/л, чем при ППОС, что также указывает на повышение эффективности процесса.

Результаты качества полученных образцов биоэтанола приведены в табл. 3.

В опытных образцах объёмная доля метанола крайне мала – 0,002 об. %. Также в опытных образцах мало эфиров, что косвенно может указывать на чистоту культуры дрожжей при брожении и благоприятные условия для биосинтеза этанола. Довольно высокая концентрация альдегидов в опытных образцах (от 4100 мг/дм3 до 6100 мг/дм3) связана с природой сырья, поскольку исключено накопление фракции альдегидов (фурфурола и оксиметилфурфурола) в процессе ферментативного гидролиза, так как процесс проводился при температуре (46 ± 2) °С и рН 4,6-4,7. Массовая концентрация сивушного масла значительно высокая (2400–2500 мг/дм3),что объяснимо, так как ректификация опытного образца не проводилась. Таким образом, ферментативный гидролиз ЛЦС М позволяет получить доброкачественный гидролизат с низким содержанием вредных примесей и обуславливает низкое содержание побочных и вторичных продуктов спиртового брожения в бражках.

Выводы

Выявлено, что химическая предобработка мискантуса раствором азотной кислоты в одну стадию позволяет получать субстрат с высокой реакционной способностью к ферментативному гидролизу: выход РВ при ППОС составил 65,4 г/л, при ОПОС – 64,5 г/л.

Получен биоэтанол на среде ферментативного водного гидролизата ЛЦС М с помощью штамма Saccharomyces сerevisiae Y-1693. При ППОС синтезируется биоэтанол с выходом 70,9 % от теоретического, выход биоэтанола из 1 т М составляет 19,4 дал. При ОПОС биоэтанол синтезируется с выходом 83,7 % от теоретического, а выход биоэтанола из 1 т М – 22,6 дал.

Установлено, что при проведении процессов осахаривания-сбраживания выход биоэтанола увеличивается в 1,2 раза по сравнению с последовательным процессом. Проведение технологических стадий одновременно позволяет сократить продолжительность процесса в 1,5 раза и исключить фильтрацию промежуточного продукта – ферментативного гидролизата. Это позволит уменьшить затраты при получении биоэтанола и упростить технологический процесс, что важно для его успешного масштабирования.

Показано, что спирты, полученные из ЛЦС М, характеризуются низким содержанием эфирной фракции и метанола.

Рецензенты:

Новожилов Е.В., д.т.н., профессор, заведующий кафедрой биотехнологии и биотехнических систем, Северный (Арктический) федеральный университет, г. Архангельск;

Комарова Л.Ф., д.т.н., профессор, заведующая кафедрой химической техники и инженерной экологии, ФГБОУ ВПО «Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова», г. Барнаул.

Работа поступила в редакцию 01.04.2015.


Библиографическая ссылка

Байбакова О.В. БИОКОНВЕРСИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНОГО СУБСТРАТА МИСКАНТУСА В ЭТАНОЛ // Фундаментальные исследования. – 2015. – № 2-13. – С. 2783-2786;
URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=37561 (дата обращения: 28.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674