Scientific journal

Fundamental research

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

Осложнения беременности, согласно докладу Исследовательской группы ВОЗ, являются одной из важнейших проблем здравоохранения и нередко непосредственной причиной материнской и перинатальной заболеваемости и смертности. Полученные к настоящему времени данные о молекулярных механизмах развития данной патологии позволяют рассматривать ее как многофакторное состояние, развитие которого определяется взаимодействием определенных наследственных и средовых факторов. Многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, показали, что в основе многих видов акушерской патологии лежит развитие генерализованной микроангиопатии и тромбофилии, связанных с аутоиммунными нарушениями, дефектами ангиогенеза и инвазии трофобласта, гипергомоцистеинемией и наследственной патологией гемостаза [1, 9].

Среди заболеваний с выраженным генетическим компонентом, развивающихся в ходе беременности, важнейшее место занимают преэклампсия (гестоз), являющаяся одой из основных причин перинатальной смертности и развития полиорганной недостаточности в акушерстве, и невынашивание беременности, встречающееся, по данным ВОЗ, в 15–20 % исходов всех беременностей. Для России проблема гестоза до сих пор актуальна, поскольку отмечается постоянный рост частоты данной патологии (11–16 % беременных), занимающей 3-е место среди причин материнской смертности [5]. Частота самопроизвольных выкидышей в России составляет около 20 % всех желанных беременностей, достигая показателя 40–50 % в I триместре [3] и, несмотря на прогресс медико-биологических исследований, остается стабильной, в первую очередь, вследствие многофакторности данной проблемы. Таким образом, прогнозирование развития, ранняя диагностика и профилактика вышеуказанных осложнений гестации имеют важное медико-социальное значение.

В последнее десятилетие пристальное внимание ученых и клиницистов обращено к проблеме наследственной тромбофилии как компоненту цепи патологических процессов, ведущих к осложненному течению беременности. По данным ряда авторов роль тромбофилии в структуре причин патологии беременности составляет от 40 до 80 % [6]. Столь высокая частота выявления тромбофилии позволяет рассматривать ее в качестве важнейшего этиопатогенетического фактора развития осложнений беременности. Среди множества наследственных маркеров тромбофилии, открытых на сегодняшний день, важная роль в структуре ранних репродуктивных потерь и акушерских осложнений показана для мутаций в генах фактора 5 (FV, 1691G > A, rs6025) и протромбина (FII, 20210G > A, rs1799963), однонуклеотидного полиморфизма (SNP) –455G > A (rs1800790) гена фибриногена (FGB), маркера 1565Т > С (rs5918) гена гликопротеина 3a (GP3A), аллельного варианта –675 5G > 4G (rs1799899) гена ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1) и полиморфизма С677Т (rs1801133) гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR). Однако необходимо отметить, что результаты исследований, посвященных этой проблеме, зачастую противоречивы, что, возможно, обусловлено этнической неоднородностью и/или клинической гетерогенностью обследуемых групп больных, малочисленностью выборок, некорректным подбором контрольной группы, а также этнической специфичностью наследственной предрасположенности к заболеванию. В связи с этим, выявление особенности структуры наследственной предрасположенности в зависимости от различных клинических форм осложненного течения беременности представляет собой научный и практический интерес.

Материалы и методы исследования

В рамках данной работы обследованы 360 русских женщин с осложненным течением беременности (157 пациенток с гестозом и 203 женщины с невынашиванием беременности). Группа пациенток с гестозом была неоднородной как по степени тяжести гестоза, так и по наличию ранее предшествовавших и сопутствующих фоновых заболеваний. Диагноз гестоза был установлен на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности – наличие протеинурии, отеков, гипертензии (повышение систолического давления от 135 мм рт. ст. и выше, диастолического давления от 85 мм рт. ст. и выше). Степень тяжести гестоза оценивалась по балльной системе по классификации Г.М. Савельевой (до 7 баллов– легкая степень тяжести; 8–11 баллов – средняя; 12 баллов и более – тяжелая). Более половины пациенток (64 % – 130 человек) из группы с невынашиванием беременности имели в анамнезе от 2 и до 5 случаев потери беременности в I и/или во II триместрах и были выделены в подгруппу с привычным невынашиванием беремености (ПНБ), 73 женщины с одним случаем потери беременности в анамнезе составили подгруппу с самопроизвольными абортами (СА). Контрольную группу (150 человек)составили недавно родившие женщины с физиологически протекавшей беременностью. Критериями отбора беременных женщин в данную группу являлось отсутствие в анамнезе тромбозов, хронических и инфекционных заболеваний, акушерских патологий. Все обследованные группы беременных были сопоставимы по возрасту, паритету родов и акушерскому анамнезу. Образцы крови обследуемых были собраны на базе Родильного дома № 4 и Центра перинатального здоровья, г. Томск.

У обследованных индивидуумов была выделена ДНК, проамплифицированы интересующие полиморфные локусы (методом ПЦР) с последующим рестрикционным анализом с помощью специфических эндонуклеаз. Продукты амплификации и рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 3 %-м агарозном геле, окрашивая бромистым этидием. Условия генотипирования описаны ранее [10]. Были изучены частоты следующих маркеров наследственной тромбофилии (табл. 1): аллельные варианты С677Т и A1298C гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), маркер G20210A гена протромбина (FII), полиморфизм G1691A гена пятого фактора свертывающей системы крови (FV), аллельный вариант –675 4G/5G гена ингибитора активатора плазминогена (PA1-I).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета статистических программ «Statistica 7.0». Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий Колмогорова–Смирнова. При проведении попарного сравнения частот аллелей и генотипов между анализируемыми группами использовали критерий χ2 с поправкой Йейтса или точный критерий Фишера. В исследуемых группах для SNPs вычисляли отношение шансов (OR) и доверительные интервалы (CI) для отношения шансов (95 % CI). Соответствие распределения частот аллелей и генотипов равновесию Харди–Вайнберга проверяли по критерию χ2. Различие двух сравниваемых величин считали статистически значимыми при достижении р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

По всем исследованным локусам частоты аллелей и генотипов находились в диапазоне мировых (табл. 2).

Таблица 1

Характеристика исследованных полиморфизмов генов-кандидатов

Таблица 2

Распределение частот аллелей и генотипов в исследованных группах

Примечание: N – количество индивидов в группе. р – уровень значимости, полученный при сравнении частот аллелей или генотипов между контрольной группой и группой больных гестозом (р*) или невынашиванием беременности (р**) критерием χ2 с поправкой Йейтса или точным критерием Фишера. р*** – уровень значимости получен при анализе на соответствие распределению Харди-Вайнберга. Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (р < 0,05).

Распределение частот генотипов во всех выборках соответствовало равновесию Харди-Вайнберга, за исключением группы пациенток с гестозом, в которой были обнаружены отклонения от данного распределения для маркера A1298C гена MTHFR. По всей видимости, это связано с тем, что группу больных нельзя рассматривать как случайные популяционные выборки, фактически в них включены индивиды, изначально предрасположенные к развитию гестационных осложнений. Другой возможной причиной отклонения от равновесия Харди-Вайнберга в данном случае является селективная значимость этого SNP или его сцепление с другим функционально значимым полиморфизмом гена MTHFR.

При анализе распределения частот аллелей и генотипов изученных полиморфизмов было выявлено статистически значимое повышение частоты генотипа 677ТТ гена MTHFR в группе женщин с гестозом (14 %) по сравнению с контрольной группой – 3 % (OR = 5,13; CI:1,87–14,07). Частота аллеля 677Т гена MTHFR также превалировала у беременных с гестозом по сравнению контрольной группой (OR = 1,87; CI:1,29–2,71).
Второй изученный маркер гена MTHFR – А1298С также показал статистически значимую ассоциацию с гестозом (при сравнении частот генотипов χ2 = 7,14, р = 0,03): генотип 1298СС в группе больных гестозом встречался в 2 раза чаще (21 %), чем в контрольной группе (10 %). Кроме того, в настоящем исследовании была показана ассоциация полиморфного варианта –675 4G/5G гена PAI-1 с развитием гестоза. В группе пациенток с гестозом генотип 4G/4G и аллель 4G встречался статистически значимо чаще, чем в выборке женщин с физиологическим течением беременности (для генотипа 4G/4G OR = 2,21, CI 1,37-3,55; для аллеля 4G OR = 1,71, CI 1,23-2,38).

В настоящем исследовании также были выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов между подгруппами больных гестозом с различной степенью тяжести и контрольной выборкой (табл. 3). Несмотря на то, что полиморфизм С677Т гена MTHFR ассоциирован с обеими клиническими формами гестоза (для генотипа ТТ OR = 6,84, CI 2,30–20,03 – для гестоза легкой степени тяжести и OR = 6,56, CI 2,24–19,20 – для подгруппы со средне-тяжелым и тяжелым гестозом), второй изученный маркер этого гена – А1298С показал ассоциацию только с развитием тяжелого и среднетяжелого гестоза (для генотипа СС OR = 2,92, CI 1,36–6,27). С данной клинической формой гестоза также ассоциированы аллели 4G гена PAI-1 (OR = 0,51, CI 1,03–2,24) и 1691А гена FV(OR = 3,16, CI 0,91–10,94). Наряду с этим, распределение частот генотипов и аллелей по локусу 1691А гена FV статистически значимо не отличалось между подгруппой с легкой формой гестоза и контрольной выборкой. Необходимо также отметить, что более высокая частота аллеля 4G (OR = 1,98, CI 1,29–3,05) и генотипа 4G/4G (OR = 2,71, CI 1,50–4,90) гена PAI-1 отмечалась в подгруппе женщин с легкой формой гестоза по сравнению с этими показателями в подгруппе с тяжелым и среднетяжелым гестозом и в контрольной выборке (табл. 3).

Таблица 3

Распределение частот аллелей и генотипов в подгруппах с гестозом различной степени тяжести

Примечание: N – количество индивидов в группе. р – уровень значимости, полученный при сравнении частот аллелей или генотипов между контрольной группой и группой больных гестозом легкой степени (р*) или выборкой пациенток со среднетяжелым и тяжелым гестозом (р**) критерием χ2 с поправкой Йейтса или точным критерием Фишера. р*** – уровень значимости получен при анализе на соответствие распределению Харди-Вайнберга. Жирным шрифтом выделены статистически значимые различия (р < 0,05).

Из всех изученных полиморфных вариантов ассоциация с невынашиванием беременности была установлена только для маркера С677Т гена MTHFR: в группе больных отмечалось статистически значимое повышение частоты генотипа ТТ (OR = 2,86; CI:1,04 – 7,87) и аллеля Т (OR = 1,57; CI:1,11-2,22) по сравнению с этими показателями у женщин с физиологической беременностью (см. табл. 2). При сравнительном анализе распределения частот генотипов и аллелей по полиморфизмам G1691A гена FV и G20210A гена FII статистически значимых отличий между исследованными группами не найдено.

Анализ распределения частот генотипов и аллелей при различных клинических формах НБ выявил статистически значимую ассоциацию полиморфизма С677Т гена MTHFR только с ПНБ (рисунок).

Распределение частот генотипов и аллелей полиморфного варианта С677Т гена MTHFR у пациенток с различными клиническими формами НБ и в контрольной группе.
Примечание: * обозначены статистически значимые отличия

Таким образом, в настоящей работе показана существенная роль факторов наследственной тромбофилии в развитии акушерской патологии. Согласно полученным данным, гестоз и НБ статистически значимо ассоциированы с полиморфизмом С677Т гена MTHFR, который представляет интерес в связи с патологическими состояниями, ведущими к накоплению гомоцистеина в организме и повреждению эндотелия сосудов. В конце XX века BaileyL. и GregoryJ. продемонстрировали invitro снижение активности метилентетрагидрофолатредуктазы у гомозигот по аллелю 677Т до 30 %, а у гетерозигот – до 65 % от обычного уровня, которое обусловлено заменой аминокислотного остатка аланина на валин в области связывания данного фермента с ко-фактором FAD (флавин-аденин-динуклеотид). Кроме того, было показано, что наличие ТТ-генотипа ведет к повышению уровня ГЦ примерно в 2 раза по сравнению с СС-субьектами [8]. Другим аллельным вариантом гена MTHFR, ассоциированным по результатам данной работы с развитием тяжелой формы гестоза, является точечная мутация А1298С, приводящая к замене остатка глутамина на остаток аланина в регуляторном домене фермента, что сопровождается небольшим снижением энзиматической активности. У лиц, гомозиготных по мутации А1298C, отмечается снижение каталитической активности метилентетрагидро-фолатредуктазы примерно до 60 % от нормы [12].

Ряд исследований показал, что носительство аллелей 677T и 1298С предрасполагает к развитию умеренной ГГЦ и повышению риска развития многих распространённых заболеваний, особенно на фоне снижения фолатного статуса. Результаты современных работ по выявлению ассоциации полиморфизмов С677Т и А1298С гена MTHFR с нарушением физиологического течения беременности достаточно противоречивы. Обнаружено, что гомозиготная форма 677ТТ в четыре раза чаще встречается в группе женщин с гестозом, чем в контроле. Имеется выраженная тенденция к прямой зависимости частоты встречаемости аллеля 677Т от тяжести гестоза. Также продемонстрировано, что у женщин с генотипом 677ТТ гена MTHFR статистически значимо повышен риск развития гестоза тяжелой степени при последующих беременностях [4]. Тем не менее, исследования, проведенные в шотландской, чешской, бразильской и чилийской популяциях, не выявили ассоциации аллеля Т с преэклампсией (ПЭ). Недавняя работа австралийских ученых также не подтвердила значения наследственной тромбофилии в патогенезе данной патологии [7].

Многие авторы рассматривают полиморфные варианты гена MTHFR как независимый фактор риска невынашивания беременности (НБ). Согласно данным Макацария А.Д. и Бицадзе В.О., гомозиготная форма 677ТТ гена MTHFR и сопровождающая ее ГГЦ были обнаружены у 45 % обследованных женщин с привычной потерей беременности. У пациенток с беременностью, осложненной плацентарной недостаточностью, ЗВУР, антенатальной гибелью плода, ГГЦ определялась в 22 % случаев [6]. Недавние исследования в корейской и казахской популяциях подтвердили, что носительство аллелей 677Т и 1298С является значимым фактором риска привычного невынашиванием беременности (ПНБ). Аналогичные результаты были получены для жительниц штата Иллинойс. Доказательства роли полиморфизмовгена MTHFR в наследственной компоненте НБ также были показаны для иранской, немецкой и мексиканской популяций. Так, в работе, проведенной в Национальном институте здравоохранения Мексики, было обнаружено пятикратное повышение риска спонтанной потери плода при наличии материнского генотипа 677ТТ или 1298АС. Мета-анализ 10 исследований случай-контроль идентифицировал значимую взаимосвязь ГГЦ и генотипа 677ТТ с ПНБ до 16 недель (OR 1.67; 95 % CI
1,21–2,31). В болгарской популяции также выявлена ассоциация аллеля 677Т гена MTHFR с ПНБ в первом триместре. Австрийскими учеными, обследовавшими в общей сложности 1675 пациенток с различными осложнениями гестации (преэклампсия, задержка внутриутробного развития плода, преждевременные роды), продемонстрирована роль полиморфизма С677Т как генетического маркера только невынашивания беременности. Тем не менее, результаты работы, проведенной в Центре планирования семьи и репродукции г. Москвы, не подтвердили данную ассоциацию, однако в этом исследовании было продемонстрировано влияние маркера С677Т на развитие тромботического процесса. Не было получено статистически значимых различий по частотам аллелей и генотипов полиморфизма С677Т в группе пациенток с НБ и контрольной выборке также и в популяции Колумбии [3, 7].

Важным звеном каскада антикоагуляционных реакций является ограничение тромбообразования активированным протеином C. Активированный протеин C является одним из главных физиологических антикоагулянтов, расщепляющих активированные факторы свертывания V и VIII. Одной из значимых причин тромбофилии является резистентность к действию протеина C, обусловленная мутацией Лейдена (G1691A), которая ассоциирована, по данным ряда автором, с такими репродуктивными нарушениями, как преэклампсия, плацентарная недостаточность, привычное невынашивание беременности и др. [17]. Например, в исследовании американских ученых частота мутации Лейден у больных тяжелым гестозом была значительно выше (26,5 %), чем в контрольной группе (6 %; р < 0,001) [15]. Аналогичная тенденция отмечена и в итальянской популяции, где частота носительства аллеля 1691А была также выше среди больных гестозом (10,4 %), чем в группе женщин с физиологической беременностью (2,3 %; р = 0,01) [13]. Работы отечественных авторов также подтверждают вышеописанные результаты, проведенные в различных популяциях мира. В частности, по данным Зайнулиной (2005), у 25 % женщин с тяжелым гестозом наблюдается мутация FV, тогда как при легкой форме гестоза вариант 1691AG присутствует в 3 % случаев, а при физиологической беременности – полностью отсутствует [4]. Результаты мета-анализа исследований случай-контроль также подтверждают ассоциацию мутации Лейден с тяжелой преэклампсией (OR = 2,24 СI: 1,28–3,94) [16]. С другой стороны, ряд крупных исследований и мета-анализов продемонстрировал, что носители мутации Лейден не подвержены повышенному риску акушерской патологии [14]. Необходимо отметить, что результаты нашего исследования свидетельствуют о возможной роли мутации Лейден в развитии именно тяжелой формы гестоза.

В настоящей работе также была показана ассоциация с гестозом полиморфизма –675 4G/5G, расположенного в промоторной области гена PA1-1, продукт которого является одним из важнейших факторов плазменного звена гемостаза. Аналогичные данные были получены также в исследованиях японских, немецких и отечественных авторов, а также результатах мета-анализа. Кроме того, показано, что у беременных с генотипом 4G/4G отмечается тенденция к более раннему появлению артериального давления и к его более высоким показателям, особенно в родах [2]. Известно, что протеин PAI-1 регулирует тканевый/уро-
киназный активаторы плазминогена. Носительство аллеля 4G приводит к повышенной экспрессии гена и увеличенному уровню PAI-1 в крови, снижению активности тромболитической системы, возрастанию риска тромбообразования и является фактором риска развития инфаркта миокарда и тромбоза.

Необходимо отметить, что данные по поводу ассоциации факторов наследственной тромбофилии с осложненным течением беременности достаточно неоднозначны. Эти противоречия могут являться следствием популяционной специфичности или гетерогенности анализа (некорректный выбор обследуемых и контрольной группы, малый объем выборок), ген-генными и/или ген-средовыми взаимодействиями. Так, в исследовании DalmazC. и соавт. показано отсутствие ассоциации отдельных факторов наследственной тромбофилии с преэклампсией, но было идентифицировано совместное влияние на развитие данной патологии полиморфизмов генов MTHFR, FII, FV и PAI-1 [10]. Роль комбинации генетически обусловленных факторов тромбофилии в генезе осложненного течения беременности была также продемонстрирована в работе Vefring и соавт. при сочетании гомозиготных вариантов 677ТТ гена MTHFR и 1691АА гена FV наблюдалось пятикратное повышение риска ПЭ, в то время как носительство генотипа 677ТТ увеличивало риск данной патологии только в два раза [18].

Таким образом, в настоящей работе выявлены особенности генетической архитектуры отдельных клинических форм осложненного течения беременности по генам, вовлеченным в развитие тромбофилии. Результаты проведенного исследования позволяют с большой долей вероятности предположить, что аллельные варианты 677Т и 1298С гена MTHFR, мутация Лейден и 4G/5G-полиморфизм гена PA1-1 вносят значительный вклад в развитие гестоза и невынашивания беременности в популяции русских и могут быть учтены при разработке патогенетически обоснованных мер профилактики гестационных осложнений.

Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 гг.» (Соглашения № 8118 и № 8042).