Симбиотические ассоциации - это форма существования микрофлоры в экологических нишах тела человека. Самым многочисленным как по числу видов, так и в количественном отношении является ассоциативный симбиоз толстого кишечника. Доминантная микрофлора оказывает мутуалистическое влияние на организм хозяина (макросимбионта), включение же в этот симбиоз условно-патогенных микроорганизмов (ассоциативных микросимбионтов) может иметь разные последствия для макроорганизма. Это связано с тем, что межмикробные взаимодействия внутри ассоциаций - от синергизма до антагонизма - могут изменять биологические свойства микробов, что нередко является патогенетической основой формирования эндогенных инфекций [1, 2]. В связи с этим предупреждение микроэкологических нарушений на основе приема пробиотических препаратов, как способ снижения риска развития инфекционных осложнений эндогенного генеза у иммунокомпромиссных пациентов широко используют в различных областях медицинской практики. Применяемые средства коррекции микрофлоры, а точнее заместительная терапия пробиотиками с целью создания временного микробиоценоза, иногда не приносят ожидаемых результатов [6]. Связано это с тем, что используемые подходы в коррекции часто не учитывают особенностей микроорганизмов, формирующих микробиоценоз и их взаимоотношений друг с другом. Очевидным является необходимость в дифференцированном выборе принципов и средств для коррекции микрофлоры кишечника у ВИЧ-инфицированных детей с учетом патогенетических особенностей развития дисбиотических состояний и биологических свойств микробов.
Цель исследования - оптимизация принципов коррекции микроэкологических нарушений кишечника у ВИЧ-инфицированных детей.
Материалы и методы исследования
Исследование было построено по типу «случай-контроль». В опытную группу вошли 68 детей с ВИЧ-инфекцией (II‒III стадия), средний возраст которых составил 2,3 ± 0,2 года. Группа сравнения включала 45 ВИЧ-негативных относительно здоровых детей. Группы были сопоставимы по возрасту и полу. Объектом исследования были 378 микроорганизмов, выделенных из содержимого толстой кишки детей с ВИЧ-инфекцией и 223 штамма от детей группы сравнения.
Исследование кишечного микробиоценоза проводили с помощью количественного бактериологического метода. Для выделения облигатно-анаэробных бактерий применяли анаэростаты (BBL, США) и газогенерирующие пакеты (НПО «Новое дело», Санкт-Петербург). Идентификацию бактерий и грибов осуществляли с использованием коммерческих тест систем ANAERO-TEST 23 (Lachema, Чехия), ПБДС (Нижний Новгород), STREPTO-TEST 16 (Lachema, Чехия), AUXOCOLOR (BioRad, Франция), СИБ для энтеробактерий набор № 2 (НПО «Микроген», Нижний-Новгород). Интерпретацию результатов исследования кишечного микробиоценоза вели согласно региональным значениям нормы [3].
Адгезивные свойства микроорганизмов изучали согласно методике В.И. Брилиса [4]. Микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ ≤ 1,75; низкоадгезивными - от 1,76 до 2,5; среднеадгезивными - от 2,51 до 4,0 и высокоадгезивными при ИАМ ≥ 4,0.
Активность кислотообразования бифидобактерий и лактобацилл определяли титрометрическим методом. С этой целью к суточным культурам бактерий, выращенных на элективных жидких питательных средах, добавляли по 2 капли индикатора фенол-фталеина и титровали 0,1 н NaOH. Количество щелочи, пошедшей на титрование, соответствует количеству образуемой кислоты в 5 мл культуральной жидкости. Окончательный результат выражали в градусах Тернера: Т0 = А∙К×20, где А-количество 0,1 н щелочи, пошедшее на титрование 5 мл исследуемой жидкости, К-поправка к титру, определяемая при титровании 0,1 н раствора щелочи 0,1 н янтарной кислотой, Т0 - величина, выражающая количество 0,1 н щелочи, пошедшей на титрование 100 мл исследуемого образца.
Антагонистическую активность микроорганизмов определяли методом перпендикулярных штрихов на плотной питательной среде. На чашку с плотной питательной средой петлей 2 мм наносили полоску культуры бактерий и инкубировали 24-48 часов с учетом типа дыхания. Далее к выросшей культуре подсевали участников ассоциаций, предварительно выращенных на скошенном мясо-пептонном агаре в течение 18 часов. Посев производили петлей диаметром 1 мм в направлении от зоны роста изучаемых бактерий, не касаясь ее и перпендикулярно ей. Чашки инкубировали при температуре 37 С 24 часа. Учет результатов вели по величине зоны отсутствия роста микроба-ассоцианта в мм.
Липолитическую и ДНКазную активность условно-патогенных бактерий и грибов исследовали методом посева на Trybuthirit Base Agar (HiMedia) и DNA Base Agar (HiMediа). Изучение гемолитической активности микроорганизмов проводили на МПА с добавлением эритроцитов человека.
Определение антиоксидантной активности бифидобактерий проводили по методике И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили [5].
Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ Statistica (версия 6.1 лицензионное соглашение ВХХR 006ВО92218 FAN 11). Статистическая обработка информации строилась с учетом характера распределения данных, которое не соответствовало нормальному. Характер распределения переменных величин в рассматриваемой совокупности определяли с помощью построения гистограмм.
Результаты исследования и их обсуждение
По данным литературы, среди доминантных симбионтов в кишечном микробиоценозе чаще встречаются бифидобактерии и лактобациллы, основной функцией которых является формирование колонизационной резистентности [2, 6]. В свою очередь колонизационная резистентность поддерживается многочисленными механизмами, в том числе адгезивной активностью, способностью колонизировать биотоп, вступать в антагонизм с ассоциативными микросимбионтами. Установлено, что среди бифидобактерий, выделенных от детей с ВИЧ-инфекцией, преобладали штаммы со средней или низкой адгезивной активностью, доля которых в структуре бифидофлоры составила 81,2 %. В группе сравнения таковых культур было только 44,4 %, т.е. 55,6 % проявляли высокую способность к адгезии. Отмечали различия в видовом составе бифидобактерий. У детей с ВИЧ-инфекцией были идентифицированы следующие виды: Bifidobacterium breve (32,7 %), B. longum (31,1 %), B. dentium (15,5 %), B. bifidum (13,1 %), B. adolestentis (7,6 %). В группе сравнения структура бифидофлоры была иная - доминировали B. bifidum (48,2 %) и B. longum (44,6 %), у некоторых ВИЧ-негативных детей выделяли B. adolescentis (7,2 %).
Среди лактобацилл от детей с ВИЧ-инфекцией 51,2 % штаммов были отнесены к микроорганизмам со средней адгезивной активностью, а 44,6 % - к низкоадгезивным, на высокоадгезивные культуры приходилось не более 4,2 %. В группе сравнения среди лактофлоры преобладали также сренеадгезивные бактерии (48,7 %), однако доля высокоадгезивных штаммов была достоверно выше (46,4 %, p = 0,00). Преобладание среднеадгезивной активности у данных анаэробов обусловливает у ВИЧ-инфицированных детей низкий популяционный уровень бифидобактерий (7,5 lg КОЕ/г) и лактобацилл (6,3 lg КОЕ/г), при 8,9 lg КОЕ/г и 8,1 lg КОЕ/г соответственно у детей группы сравнения.
Существенную роль в поддержании колонизационной резистентности играет также антагонистическая активность доминантной микрофлоры [6]. Было установлено, что бифидофлора у детей с ВИЧ-инфекцией чаще проявляет антагонизм по отношению к факультативно-анаэробной индигенной микрофлоре - к Escherichia coli lac+ (38 на 100 штаммов) и Enterococcus faecalis (24 на 100 штаммов). Это свидетельствует об ослаблении распространения регулирующей функции бифидофлоры у ВИЧ-инфицированных детей на всех представителей кишечного микробиоценоза и сохранении ее только в отношении индигенных представителей, что, вероятно, связано с низкой кислотообразующей активностью данных микросимбионтов, которая в среднем составила 58,24° Т. У детей из группы сравнения активность кислотообразования бифидобактерий была в 1,5 раза выше (p = 0,06), а антагонистические взаимоотношения формировались с Klebsiella spp. (42 на 100 культур) Staphylococcus spp. (36,4 на 100 культур), E. coli lac + (23,3 на 100 культур). Появление в литературе данных об антиоксидантных свойствах доминантных микросимбионтов [2, 6] предопределило изучение данного признака у бифидофлоры, выделенной от ВИЧ-позитивных детей. В опытах in vitro было установлено, что B.breve обладали прооксидантными свойствами, которые усиливались пропорционально длительности инкубирования бактерий. Все остальные виды бифидофлоры характеризовались наличием антиоксидантной активности, в большей степени выраженной у B. bifidum и B. longum. Так как в структруре бифидофлоры у ВИЧ-инфицированных детей преобладали B. breve, а доля B. bifidum была достаточно низкой, то это позволяет предполагать накопление у таких детей токсических форм кислорода, что предопределяет необходимость проведения у них антиоксидантной терапии.
Лактобациллы как у детей основной группы, так и у детей группы сравнения обладали выраженной способностью к антагонизму, так как распространенность этого признака достигала 88 и 91 на 100 культур соответственно. Способность к кислотообразованию была выше у лактофлоры от здоровых детей и составила 97,6° Т, против 86,7° Т у детей с ВИЧ-инфекцией. Антагонистическая активность лактобацилл у детей основной группы была выражена в отношении условно-патогенных микросимбионтов: Candida albicans (21 на 100 культур), Staphylococcus spp (19 на 100 культур), Klebsiella spp (16 на 100 культур лактобацилл). Таким образом, у детей с ВИЧ-инфекцией регуляция числа условно-патогенных бактерий в кишечном биотопе осуществляется в основном
лактобациллами.
Дефицит анаэробной части доминантных микросимбионтов у детей с ВИЧ-инфекцией компенсируется высоким количественным уровнем типичных кишечных палочек (8,2 lg КОЕ/г), тогда как у детей группы сравнения их титр был ниже (7,8 lg КОЕ/г). Однако в популяции Escherichia coli lac+, выделенных от детей основной группы, преобладали низкоадгезивные штаммы, доля которых составила 53 %. Средней адгезивной активностью обладали 32,4 % штаммов, на высокоадгезивные эшерихии приходилось только 14,6 % культур. У детей группы сравнения 38,2 % штаммов типичных кишечных палочек были отнесены к высокоадгезиным (p = 0,03), 44,6 % к среднеадгезивным бактериям. Доля низкоадгезивных культур не превышала 17,2 % (p = 0,00). Распространенность антагонизма к условно-патогенной микрофлоре среди эшерихий, выделенных от детей с ВИЧ-инфекцией составила только 6,7 на 100 культур, от здоровых - 25,6 на 100 культур. Указанные характеристики микрофлоры при ВИЧ-инфекции, не позволяют типичным кишечным палочкам адекватно обеспечивать колонизационную резистентность, даже если их количественный уровень достаточно высок, что свидетельствует о специализации у микроорганизмов выполняемых в биотопе функций.
По данным литературы, к доминантным микросимбионтам, помимо бифидобактерий, лактобацилл и типичных кишечных палочек, относят Enterococcus faecalis [6]. Интенсивность колонизации слизистой кишечника данными бактериями у детей основной группы составила 6,5 lg КОЕ/г, против 7,5 lg КОЕ/г у детей группы сравнения, что свидетельствует о недостаточном популяционном уровне энтерококков в биоценозе ВИЧ-инфицированных детей. Фекальные энтерококки, изолированные из толстой кишки ВИЧ-инфицированных детей, не обладали антагонизмом по отношению к другим представителям микробиоценоза, но среди них были выявлены штаммы, проявляющие липолитическую и гемолитическую активность, распространенность признаков составила 26,5 и 34,5 на 100 культур соответственно. Среди энтерококков от детей группы сравнения гемолитических штаммов обнаружено не было, тогда, как распространенность липолитической активности была статистически ниже, чем в основной группе и составила 9,8 на 100 культур (p = 0,00). В связи с этим фекальные энтерококки у детей с ВИЧ-инфекцией можно позиционировать как ассоциативных микросимбионтов, которые могут играть этиологическую роль в возникновении гнойно-воспалительных процессов.
При изучении ассоциативных микросимбионтов у детей основной группы была установлена высокая распространенность бактериально-грибковых ассоциаций (66,1 из 100 ВИЧ-инфицированных детей). Среди детей группы сравнения ассоциации грибов и бактерий встречались реже (28 на 100 относительно здоровых детей). При этом у ВИЧ-инфицированных пациентов наибольшую распространенность имели трех- и четырехкомпонентные ассоциации грибов рода Candida и условно-патогенных бактерий (35,7 и 10,7 на 100 детей). У детей группы сравнения грибы Candida встречались не только в ассоциациях (28,4 на 100 здоровых детей), но и в монокультурах (31,4 на 100 здоровых детей).
При изучении количественного уровня условно-патогенной микрофлоры было установлено, что содержание стафилококков в кишечнике детей с ВИЧ-инфекцией в среднем составило 3,5 lg КОЕ/г, грибов рода Candida 4,1 lg КОЕ/г, условно-патогенных энтеробактерий - 6,96 lg КОЕ/г, актиномицетов 7,2 lg КОЕ/г. У детей группы сравнения количественный уровень грибов Candida spp. в ассоциациях не отличался от такового при ВИЧ-инфекции (3,9 lg КОЕ/г), тогда как в монокультурах титр данных эукариот достигал только 2,2 lg КОЕ/г. Интенсивность колонизации кишечника детей группы сравнения стафилококками и условно-патогенными энтеробактериями была ниже, чем в основной группе и составила 3 lg КОЕ/г и 5,2 lg КОЕ/г.
Было установлено, что микроорганизмы, входящие в состав ассоциаций, как у ВИЧ-инфицированных детей, так и у относительно здоровых детей не проявляют друг к другу антагонистических взаимоотношений, более того дрожжевые грибы рода Candida потенциируют рост клебсиелл. Серия опытов по совместному культивированию K.pneumoniae и C.albicans показала, что в течение 2 часов количество клебсиелл после инкубирования с грибами достигает 8 lg КОЕ/г, тогда как в контроле (монокультура Klebsiella spp.) для достижения такого количественного уровня требуется 6 часов.
Бактерии, входящие в состав минорных ассоциаций ВИЧ-инфицированных детей, проявляли антагонизм по отношению к доминантной микрофлоре. В антагонистические взаимоотношения с типичной кишечной палочкой вступали гемолизинпродуцирующие эшерихии (распространенность признака составила 18,2 на 100 культур), а с фекальными энтерококками разные виды стафилококков, входящих в ассоциации (22,2 на 100 культур). Распространение антагонизма среди ассоциативных микросимбионтов по отношению к доминантным бактериям у детей группы сравнения составило только 8,9 на 100 культур.
Формирование ассоциативных сожительств микроорганизмов способствует не только поддержанию определенного популяционного уровня условно-патогенных бактерий, но и более высокой экспрессии факторов вирулентности у отдельных представителей. Так, распространенность ДНКазной, липазной и гемолитической активности среди стафилококков в ассоциациях у ВИЧ-позитивных детей составила 27,78; 80,56 и 88,89 на 100 культур соответственно. Если стафилококки были выделены от детей группы сравнения, то распространенность ДНКазной и липазной активности не превышала 10,34 и 35,6 на 100 культур соответственно, а гемолитической - 28,56 на 100 штаммов (p = 0,02).
У грибов рода Candida, выделенных из ассоциаций у детей основной группы, распространенность гемолитической и липазной активности составила 39,29 и 71,43 на 100 культур соответственно. Микромицеты, выделяемые в монокультурах от детей группы сравнения характеризовались наличием только липазной активности, распространенность, которой не превышала 32,3 на 100 культур.
Выводы
1. У детей с иммунодефицитами, развившимися при ВИЧ-инфекции, установлено нарушение колонизационной резистентности кишечника за счет снижения способности бифидобактерий и лактобацилл к адгезии и колонизации данного биотопа. Нарушение продукции органических кислот, как основного фактора антагонизма доминантной микрофлоры, обусловливает формирование многокомпонентных бактериально-грибковых ассоциаций. В состав ассоциаций, независимо от числа участников, входят грибы рода Candida spp.
2. Микробы-ассоцианты вступают в антагонизм с доминантными симбионтами и вызывают их интерференцию (вытеснение) из биотопа. Межбактериальные взаимодействия по типу нейтрализма или синергизма внутри ассоциаций способствуют тому, что условно-патогенные микроорганизмы достигают высокого популяционного уровня и начинают экспрессировать факторы вирулентности, имеющие патогенетическое значение в формировании дисфункции слизистой кишечника.
3. Для снижения риска развития эндогенных бактериально-грибковых инфекций у ВИЧ-инфицированных детей необходимо проводить своевременную коррекцию микробиоценоза толстой кишки, которую необходимо вести в двух направлениях:
- устранение ассоциативных микробных сообществ;
- нормализация количества и функций доминантных микросимбионтов.
Практические рекомендации:
1. Для коррекции микроэкологических нарушений у детей с иммунодефицитами не целесообразно применять комбинированные пробиотики, в состав которых входят энтерококки, так как в составе симбиоза у этих детей они ведут себя, как микробы-ассоцианты, проявляющие вирулентные свойства.
2. При выборе пробиотика предпочтение следует отдавать монокомпонентным препаратам на основе B.bifidum с выраженными антагонистическими свойствами по отношению к условно-патогенным микроорганизмам.
3. Для устранения ассоциаций микросимбионтов у ВИЧ-позитивных детей первоочередным является элиминация грибов рода Candida, что позволит снизить темпы размножения условно-патогенных энтеробактерий.
4. В комплекс мероприятий по коррекции микроэкологических нарушений у детей с ВИЧ-инфекцией целесообразно вводить антиоксиданты.
Работа выполнена на средства Гранта Президента РФ МК-971.2010.7.
Рецензенты:
Галактионова Л.П., д.б.н., профессор ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» » Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Барнаул;
Лисаченко Г.В., д.м.н., профессор кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Кемерово.
Работа поступила в редакцию 27.10.2011.
Библиографическая ссылка
Захарова Ю.В., Сухих А.С., Марковская А.А. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДОМИНАНТНЫХ И АССОЦИАТИВНЫХ МИКРОСИМБИОНТОВ КИШЕЧНИКА У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ДЕТЕЙ // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 11-3. – С. 503-507;URL: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=29259 (дата обращения: 20.04.2024).