Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Юсенко Е.В. 1 Полынцева Е.А. 1

---

1 ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет»

Диагностика пиелонефрита – инфекционного заболевания почек – заключается в обнаружении нитрит-ионов тест-методами в моче человека. Чувствительность такого медицинского анализа низкая и выявляет только 60 % случаев. В работе показана возможность высокочувствительного количественного определения нитрит- и нитрат-ионов в моче человека методом ионной хроматографии (ИХ) со спектрофотометрическим детектированием и применением анионообменной колонки Shodex IC-SI-90 (250×4,0 мм). Линейные диапазоны определяемых содержаний нитрит- и нитрат-ионов в разработанной методике составили 0,05–50 и 0,009–10 мг/л, пределы обнаружения 0,015 и 0,002 мг/л соответственно, что существенно ниже по сравнению с существующими методами. Проведено определение нитрит- и нитрат-ионов в образцах мочи. Среднее содержание нитрит-иона составило 85,4 мг/л, нитрат-иона – 54,4 мг/л. По данным корреляционного анализа установлено, что содержания нитрита и нитрата в моче человека связаны между собой. На основании полученных данных сделаны выводы о возможности применения разработанной методики в анализе биологических объектов.

Статья в формате PDF

361 KB

ионная хроматография

спектрофотометрический детектор

нитрит-ион

нитрат-ион

моча

1. Медведев В.В., Волчек Ю.З. Клиническая лабораторная диагностика: справочник для врачей. – СПб.: Гиппократ, 1995. – 208 с.

2. Особенности диагности малосимптомного течения хронического пиелонефрита / С.В. Шатохина, Л.А. Дасаева, И.С. Шатохина, В.Н. Шабалин, Е.М. Шилов // Клиническая медицина. – 2012. – Т. 90. – № 1. – С. 69-71.

3. Bories P.N., Scherman E., Dziedzic L. Analysis of Nitrite and Nitrate in Biological Fluids by Capillary Electrophoresis // Clinical Biochemistry. – 1999. – Vol. 32. – № 1. – P. 9–14.

4. Jobgen W.S., Jobgen S.C., Li H., Meininger C.J., Wu G. Analysis of nitrite and nitrate in biological samples using high-performance liquid chromatography // Journal of Chromatography B. – 2007. – Vol. 851. – P. 71–82.

5. Morcos E., Wiklund P.N. Nitrite and Nitrate Measurements in Human Urine by Capillary Electrophoresis // Methods in Molecular Biology. – 2004. – Vol. 279. – P. 21–34.

6. Tsikas D. Mass Spectrometry-Validated HPLC Method for Urinary Nitrate // Clinical Chemistry. – 2004. – Vol. 50. – № 7. – P. 1259–1261.

7. Tsikas D. Simultaneous derivatization and quantification of the nitric oxide metabolites nitrite and nitrate in biological fluids by gas chromatography-mass spectrometry // Anal Chem. – 2000. – Vol. 72. – P. 4064–4072.

8. Tsikas D., Gutzki F., Stichtenoth D. Circulating and excretory nitrite and nitrate as indicators of nitric oxide synthesis in humans: methods of analysis // Eur J Clin Pharmacol. – 2006. – Vol. 62. – P. 51–59.

9. Tsikas D., Suchy M., Mitschke A., Beckmann B., Gutzki F. Measurement of Nitrite in Urine by Gas Chromatography-Mass Spectrometry // Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. – 2012. – Vol. 844. – P. 277–293.

Пиелонефрит – инфекционно-воспалительное заболевание почек. Встречается у всех групп населения, чаще у молодых женщин, детей, больных диабетом и мужчин старше 45 лет. Обычно диагностируется только на поздних стадиях, поскольку протекает бессимптомно [2].

Диагностика пиелонефрита заключается в обнаружении нитрит-ионов тест-методами в моче. Но чувствительность такого медицинского анализа низкая и выявляет только 60 % случаев. Целесообразнее определять нитриты в моче хроматографическими методами: газовой с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) [7], высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием [8, 4] и капиллярным электрофорезом (КЭ) [3, 5]. Эти методы позволяют одновременно определять еще и нитрат-ионы. Для анализа ГХ необходима сложная и длительная пробоподготовка с предварительной дериватизацией. В ВЭЖХ низкая селективность определения и наблюдается мешающее влияние больших концентраций хлорид-ионов, присутствующих в моче. А в методе КЭ – низкая воспроизводимость из-за мешающего влияния органических компонентов матрицы. Наиболее эффективным методом их исследования в моче является ионная хроматография со спектрофотометрическим детектированием, но таких публикаций не встречалось.

Целью работы являлась разработка методики одновременного определения нитрит- и нитрат-ионов в моче методом ионной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием.

Материалы и методы исследования

Реактивы. Рабочие растворы нитрит-, нитрат-ионов готовили из стандартных образцов (ГСО «Уральский завод химических реактивов», Россия, 1 г/л), добавляя соответствующие аликвоты растворов в мерную колбу и доводя до метки деионизованной водой (aquaMAX™-Ultra Younglin, Корея). Градуировочные растворы (0,01–20 мг/л) готовили последовательным разбавлением модельных растворов непосредственно перед анализом. Для приготовления элюентов использовали карбонат и гидрокарбонат натрия («Sigma-Aldrich», США). Для пробоподготовки мочи применяли этиловый спирт (ч.д.а, 96 %).

Оборудование. В работе использован высокоэффективный жидкостной хроматограф LC-20 Prominence (Shimadzu, Япония), укомплектованный спектрофотометрическим детектором, разделяющей колонкой 250×4,0 мм IC SI-90 4E 9 мкм (Shodex, Япония), подавительной колонкой 200×6 мм СПС-SAC 50 мкм (Аквилон, Россия) и предколонкой IC SI-90G 9 мкм (Shodex, Япония). Рабочий элюент: 1,8 мМ Na2CO3 и 1,7 мМ NaHCO3, объемная скорость 1,0 мл/мин и температура колонки 33 °С. Объем вводимой пробы 20 мкл. Управление прибором и обработку хроматограмм осуществляли с помощью комплекса программного обеспечения LCsolution.

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного обеспечения SPSS 15.0 для Windows. Для проверки формы распределения полученных результатов применяли тест Шапиро–Уилкса, поскольку объем выборки был менее 50 наблюдений. Доверительный интервал, в котором находится среднее значение с вероятностью 95 %. Значимость вероятности ошибки была р < 0,05.

Образцы и их пробоподготовка. Пробы мочи были отобраны у пациентов, проживающих на территории Красноярского края, наблюдающихся в урологическом отделении Красноярской краевой клинической больницы.

Методика пробоподготовки образцов мочи состояла из следующих стадий. На первом этапе моча была центрифугирована в течение 10 минут, полученный осадок отделен от центрифугата. Затем в центрифугате осаждены белки, для этого добавлен этиловый спирт (1 мл мочи и 2 мл этилового спирта). Далее раствор был помещен в шейкер на 10 минут и проводено повторное центрифугирование (10 мин), удален осадок (белки), а жидкость отфильтрована через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм (Whatman, США) для удаления механических примесей. Полученный фильтрат был разбавлен в 10 раз деионизированной водой и введен в хроматограф.

Результаты исследования и их обсуждение

Для установления времен удерживания нитрит- и нитрат-ионов и оптимальных длин их детектирования по максимумам светопоглощения проведен анализ модельного раствора, содержащего нитрит- и нитрат-ионы при спектрофотометрическом детектировании (рис. 1).

Рис. 1. Хроматограмма модельной смеси анионов NO2- (0,75 мг/л), NO3- (0,75 мг/л). Хроматографические условия описаны в разделе «Оборудование», λ = 199 нм

Определены времена удерживания нитрит- и нитрат-ионов tR = 6,81 ± 0,01 мин; tR = 8,18 ± 0,01 мин соответственно и оптимальные длины волн детектирования λNO2- = 208 нм; λNO3- = 199 (рис. 2).

Поскольку пики нитрит- и нитрат-ионов имеют разные максимумы поглощения, определять их возможно только на разных длинах волн, что приводит к необходимости проводения обработки двух хроматограмм и, следовательно, увеличению времени анализа. Для упрощения обработки полученных результатов рассчитаны коэффициенты их разрешения при 199 и 208 нм они составили Rs(199нм) = 2,77 и Rs(208нм) = 2,51 соответственно. Разрешение при 199 нм оказалось наилучшим и позволило количественно определять компоненты, поэтому дальнейшие эксперименты проводили при данной длине волны. Установлено время удерживания нитрит-иона при 199 нм tR = 6,81 ± 0,01 мин. Некоторые метрологические характеристики определения нитрит- и нитрат-ионов представлены в табл. 1.

Таблица 1

Характеристики определения нитрит- и нитрат-ионов при λ = 199 нм

Примечание. * С – концентрация иона, мг/л; S – площадь пика. ** n = 5; p = 0,95; Диапазон определяемых содержаний приведен без учета возможного разбавления/упаривания пробы.

Рис. 2. Спектры поглощения нитрит- и нитрат-ионов

Проведена пробоподготовка образцов мочи для ионохроматографического анализа. Сложность пробоподготовки заключалась в удалении белков, присутствующих в моче, которые губительны для разделяющей колонки. Их осаждение проводили этиловым спиртом с последующим центрифугированием. Для проверки на полноту осаждения спирт был добавлен несколько раз. В результате установлено, что полное осаждение белков в пробах мочи достигается при использовании 2-кратного избытка этилового спирта. Далее проведен анализ образцов мочи (рис. 3).

Рис. 3. Хроматограммы: образца мочи (1), модельной смеси анионов NO2– (0,75 мг/л), NO3– (0,75 мг/л) (2). Хроматографические условия описаны в разделе «Оборудование», λ = 199 нм

Идентификацию компонентов проводили по временам удерживания для каждого аниона, сравнивая хроматограммы образца и модельного раствора. Из рис. 3 видно, что в образце мочи присутствуют нитрит- и нитрат-ионы, результаты их определения представлены в табл. 2.

Все анализы были проведены в пяти параллельных измерениях, относительное стандартное отклонение (Sr) определяемых ионов не превышало 5 %. Диапазон содержаний нитрит- и нитрат-ионов в исследуемых образцах мочи варьировался от 17 до 235 мг/л и от 2,10 до 197 мг/л соответственно. Среднее содержание нитрит-иона составило 85,4 мг/л, нитрат-иона 54,4 мг/л. Из работ [9, 4] известно, что у здорового человека содержание нитритов и нитратов в моче составляет 0,2–0,4 и 70–90 мг/л соответственно. В данной работе содержание нитритов значительно выше, это может быть объяснено тем, что образцы мочи были взяты не у здоровых людей, а у пациентов, наблюдающихся в урологическом отделение клинической больницы. Другой причиной высоких содержаний нитритов могли стать условия отбора пробы (перед проведением данного анализа пациент должен съесть накануне достаточное количество овощей (шпинат, капуста, морковь) и должна быть отменена антибактериальная терапия). Либо возможно вторичное бактериальное загрязнение, связанное с хранением образцов [1].

Таблица 2

Результаты определения нитрит- и нитрат-ионов в моче (n = 5; p = 0,95)

Правильность определения нитрита и нитрата проверена с применением метода добавок, результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты ИХ определения нитрит- и нитрат-ионов методом добавок в образцах мочи (n = 5; Р = 0,95)

Проведено сравнение разработанной методики определения нитратов и нитритов в моче с существующими, результаты представлены в табл. 4.

В ионохроматографической методике время удерживания нитрит- и нитрат-ионов больше в два раза по сравнению с методиками ВЭЖХ и КЭ, но при этом она позволяет снизить пределы обнаружения нитрата на два порядка по сравнению с ВЭЖХ и на один порядок по сравнению с КЭ; для нитрит-иона предложенная методика снизила предел обнаружения на один порядок по сравнению с КЭ и ВЭЖХ.

Из полученных результатов рассчитан коэффициент корреляции (r) между содержаниями нитрита и нитрата в моче, он составил r = 0,5, что свидетельствует о средней силе связи между этими иона.

В данной работе показана возможность высокочувствительного количественного определения нитрит- и нитрат-ионов в моче методом ионной хроматографии со спектрофотометрическим детектированием. Полученные результаты показали, что достоинством разработанной методики являются значительно более низкие пределы обнаружения нитрита и нитрата по сравнению с существующими. Характеристики методики позволяют рекомендовать ее для применения в анализе биологических объектов. Установлено, что существует зависимость между содержаниями нитрит- и нитрат-ионов в моче.

Таблица 4

Сравнительная характеристика методик определения нитрит- и нитрат-ионов в моче (n = 5; р = 0,95)

Рецензенты:

Ефремов А.А., д.х.н., профессор, зав. лабораторией хроматографических методов анализа центра коллективного пользования Сибирского федерального университета, г. Красноярск;

Киселев В.П., д.т.н., доцент кафедры химии Сибирского федерального университета, г. Красноярск.

Работа поступила в редакцию 08.04.2013.

Библиографическая ссылка