Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ НА РАЗВИТИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ ESCHERICHIA COLI И ЕЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ГЕНТАМИЦИНУ

Мирошниченко А.Г. 1 Брюханов В.М. 1 Бутакова Л.Ю. 1 Госсен И.Е. 1 Перфильев В.Ю. 1 Смирнов П.В. 1
1 ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России
Проведено исследование влияния антиоксидантов (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, метилэтилпиридинол) в концентрациях 0,5, 1, 2 и 4 мМ на развитие штамма Escherichia coli ATCC25922 и его чувствительность к гентамицину. Инкубирование и динамическое наблюдение за развитием штаммов проводились в течение 24 часов. Установлено, что восстановленный глутатион в концентрациях 0,25–0,5 мМ стимулирует развитие бактерий, в концентрациях 2 и 4 мМ оказывает угнетающее действие. Аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин и метилэтилпиридинол оказывают слабое антибактериальное действие, причем сила эффекта напрямую зависит от концентрации антиоксиданта. Все изучаемые антиоксиданты вызывают снижение чувствительности изучаемого штамма к гентамицину. Особенно сильно активность гентамицина снижает метилэтилпиридинол. Полученные данные необходимо учитывать при использовании гентамицина при инфекции, вызванной Escherichia coli.
антиоксиданты
гентамицин
аскорбиновая кислота
N-ацетилцистеин
метилэтилпиридинол
бактерия
Escherichia coli
1. Зайцев А.А., Синопальников А.И. Аминогликозиды с позиций современной практики лечения инфекций дыхательных путей // Лечащий врач. – 2009. – № 9. – С. 18–25
2. Краснов М.В., Краснов В.М. Сепсис у детей раннего возраста: современные критерии диагноза и принципы лечения // Практическая медицина. – 2010. – № 40. – С. 28–39.
3. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: Высш. шк., 1990 – 352 с.
4. Рачина С.А. Фокин А.А., Ишмухаметов А.А., Денисова М.Н.Анализ амбулаторного потребления антимикробных препаратов для системного применения в различных регионах РФ // Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. – 2008. – Т. 10. – № 1. – С. 59–69
5. Решедько Г.К. Аминогликозиды: перспективы клинического использования в стационарах России // Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. – 2008. – Т. 10. – № 3. – С. 260–269.
6. Решедько Г.К., Рябкова Е.Л., Кречикова О.И., Сухорукова М.В., Шевченко О.В., Эйдельштейн М.В. Резистентность к антибиотикам грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций в ОРИТ многопрофильных стационаров России // Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. – 2008. – Т. 10. – № 2. – С. 163–179
7. Bisi-Johnson M.A., Obi C.L. Escherichia coli and Salmonella species: molecular landscape and therapeutic considerations: a review // J. Med. Sci. Adv. – 2012. – Vol.1(1). – P. 1–16.
8. Kohanski M.A., Dwyer D.J., Wierzbowski J., Cottarel G., Collins J.J. Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death // Cell. – 2008. –Vol. 135. – P. 679–690.
9. Kosowera N.S., Vanderhoffa G.A., Kosowerb E.M. Glutathione VIII. The effect of glutathione disulfide on initiation of protein synthesis // Biochim. Biophys. Acta. – 1961. – Vol. 49. – P. 235–236.
10. Piccolomini R., Ilio C.D., Aceto A., Allocati N., Faraone A., Cellini L., Ravagnan G., Federici G. Glutathione transferase in bacteria: subunit composition and antigenic characterization // J. Gen. Microbiol. – 1989. – Vol. 135. – P. 3119–3125.
11. Rawat M., Newton G.L., Ko M., Martinez G.J., Fahey R.C., Av-Gay Y. Mycothiol-deficient Mycobacterium smegmatis mutants are hypersensitive to alkylating agents, free radicals, and antibiotics // Antimicrob. Agents Chemother. – 2002. – Vol. 46. – P. 3348–3355.
12. Vuilleumier S. Bacterial glutathione S-transferases: what are they good for? // J. Bacteriol. – 1997. – Vol. 179. – P. 1431–1441.

Распространение заболеваний, вызываемых резистентными к действию антибиотиков бактериями, требует совершенствования способов лечения соответствующих больных, а также вызывает необходимость изучения факторов формирования антибиотикорезистентности и методов ее преодоления [5]. Одними из широко применяемых в настоящее время антибиотиков являются аминогликозиды, входящие в перечень препаратов первого ряда при сепсисе и ряде других инфекционных заболеваний [1, 2]. Аминогликозиды наряду с карбапенемами и ингибиторозащищенными цефалоспоринами относятся к препаратам, применяемым для лечения инфекционных заболеваний, вызванных Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp., а также представителями семейства Enterobacteriaceae [6]. Нерациональное использование аминогликозидов в течение длительного времени привело к широкому распространению резистентных штаммов, затрудняющему проведение эффективной фармакотерапии с использованием этого класса антибиотиков. В Российской Федерации уровень резистентности к аминогликозидам (прежде всего к гентамицину) превышает таковой по сравнению с большинством развитых стран [4].

Хотя кишечная палочка является основным представителем нормальной микрофлоры толстого кишечника человека, она способна вызывать широкий спектр инфекционных заболеваний – кишечных инфекции, неонатального менингита, пневмонии, инфекций мочевыводящих путей, холецистита, бактериемии. Кроме того, Escherichia coli может являться причиной септического артрита, эндофтальмита, гнойного тиреоидита, синусита, остеомиелита, эндокардита, инфекций кожи и мягких тканей; 12–50 % внутрибольничных инфекций и 4 % случаев кишечных инфекций вызывается кишечной палочкой [7].

В связи с признанием универсальной роли усиления процессов свободнорадикального окисления в патогенезе различных заболеваний, в т.ч. инфекционных, в качестве вспомогательной терапии больным с бактериальными инфекциями могут назначаться антиоксиданты. Таким образом, в традиционную химиотерапевтическую схему «макроорганизм – антимикробное средство – микроорганизм» включается дополнительное лекарственное вещество, влияние которого на микроорганизм-возбудитель в подавляющем большинстве случаев не учитывается.

Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка влияния некоторых антиоксидантов (восстановленный глутатион, N-ацетилцистеин, аскорбиновая кислота, метилэтилпиридинол) на развитие штамма Escherichia coli ATCC25922 и его чувствительность к гентамицину.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на штамме Escherichia coli ATCC25922. Из указанного штамма готовили суточные культуры инкубацией на скошенном агаре при 35 °С, которые использовали для приготовления инокулятов – бактериальных суспензий в 0,9 % растворе хлорида натрия с оптической плотностью 1,0 по Мак-Фарланду. Перед инокуляцией методом разведения определяли минимальную подавляющую концентрацию (МПК) гентамицина. Для инкубации готовили смесь на основе минеральной питательной среды M9. В первой серии эксперимента в среду добавлялись изучаемые антиоксиданты (восстановленный глутатион, аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин, метилэтилпиридинол) до конечных концентраций 0,25, 0,5, 1, 2 и 4 мМ. Во второй серии помимо антиоксидантов также добавлялся гентамицин до сублетальной концентрации (0,3 мг/л), составляющей 50 % ранее определенной МПК. После инокуляции бактериальной суспензии смесь инкубировали в воздушном термостате при 35 °С в течение 24 часов. Для оценки развития штаммов использовали аппарат для определения оптической плотности бактериальных взвесей Densi-la-meter (Erba Lachema s.r.o., Чехия). Полученные данные сравнивали с данными контрольных инкубационных смесей. Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметического критерия Манна–Уитни с помощью программы Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc., США), различия считали значимыми при P < 0,05 (в табл. 1 и 2 уровень статистической значимости указан в верхнем индексе после значения) [3].

Результаты исследования и их обсуждение

В табл. 1 представлены результаты изучения влияния антиоксидантов на развитие изучаемого штамма. Как видно из представленных данных, лог-фаза развития культуры в заданных условиях начинается между четвертым и восьмым часом эксперимента. На восьмом часу инкубации впервые становится явным значимое пробактериальное действие восстановленного глутатиона в концентрациях 0,25 и 0,5 мМ, сохраняющееся до окончания опыта. В инкубационных смесях, содержащих глутатион в концентрации 1 мМ, значимое повышение оптической плотности бактериальной биомассы по сравнению с контролем отмечается лишь через восемь и через двенадцать часов. С дальнейшим увеличением концентрации глутатиона пробактериальный эффект антиоксиданта сменяется на антибактериальный. Так, к 24 часу инкубации оптическая плотность бактериальной суспензии, содержащей глутатион в концентрации 4 мМ, ниже контрольной на 9 %. Глутатион является естественным метаболитом кишечной палочки, и, следовательно, может использоваться в обмене веществ. Однако высокие концентрации глутатиона оказываются токсичными для бактерии, что, по-видимому, объясняется нарушением окислительно-восстановительных процессов. Похожим влиянием на рост бактериальной культуры обладает аскорбиновая кислота. По сравнению с глутатионом в минимальных концентрациях она не вызывает ни эпизодического, ни закономерного усиления развития штамма.

N-ацетилцистеин, являясь, как и глутатион, носителем активных сульфгидрильных групп, обладает слабо выраженным влиянием на развитие кишечной палочки. Слабое, но статистически значимое повышение оптической плотности бактериальных суспензий к 24 часу инкубации наблюдается в присутствии N-ацетилцистеина в концентрациях 0,5–2 мМ.

Выраженным антибактериальным действием обладает метилэтилпиридинол. Закономерное угнетение развития культуры Escherichia coli, степень которого прямо пропорциональна концентрации антиоксиданта, наблюдается с восьмого часа инкубации. К окончанию эксперимента оптическая плотность инкубационной смеси, содержащей метилэтилпиридинол в наибольшей концентрации (4 мМ), значимо меньше контрольной на 19,5 %.

Из табл. 2 видно, что все изучаемые антиоксиданты ослабляют антибактериальное действие гентамицина. Эффект носит явную прямо пропорциональную зависимость от концентрации каждого из антиоксидантов в инкубационной среде. Особенно выраженной антагонистической активностью по отношению к гентамицину обладает метилэтилпиридинол, который, как описано выше, обладает антибактериальной активностью.

Одним из возможных механизмов снижения чувствительности к гентамицину под действием тиоловых антиоксидантов (глутатион, N-ацетилцистеин) может быть биотрансформация антибактериального средства при участии глутатион-S-трансферазы, в результате которой в бактериальных клетках образуются конъюгаты антиоксидантов и гентамицина [10, 12]. Но гентамицин не содержит активных электрофильных групп, поэтому, вероятно, реакции конъюгации подвергается продукт N-ацетилирования антибиотика. Описанный механизм подтверждается на примере бактерий Mycobacterium smegmatis, которые синтезируют аналог глутатиона микотиол, и микотиол-дефицитные штаммы микроорганизма проявляют гиперчувствительность к антибактериальным средствам [11].

Таблица 1

Влияние аскорбиновой кислоты на развитие культуры Escherichia coli ATCC25922

Концентрация антиоксиданта

Оптическая плотность бактериальной биомассы, Me(25 %;75 %)P,усл. ед. по Мак-Фарланду

4 часа

8 часов

12 часов

24 часа

0 (контроль)

0,3(0,3;0,4)

2,6(2,6;2,9)

4,3(4,2;4,3)

4,1(4,1;4,2)

Восстановленный глутатион

0,25 мМ

0,4(0,3;0,4)0,313

3,1(3,0;3,2)0,035

4,5(4,4;4,6)0,010

4,4(4,2;4,4)0,021

0,5 мМ

0,3(0,3;0,4)0,765

3,1(3,0;3,1)0,040

4,6(4,5;4,7)0,002

4,4(4,4;4,4)0,002

1 мМ

0,4(0,4;0,4)0,011

3,0(3,0;3,0)0,061

4,6(4,5;4,6)0,003

4,2(4,2;4,3)0,067

2 мМ

0,3(0,3;0,4)0,765

2,4(2,4;2,4)0,003

4,5(4,4;4,5)0,004

4,0(3,9;4,0)0,010

4 мМ

0,4(0,4;0,4)0,090

1,8(1,7;2,0)0,002

3,9(3,9;3,9)0,002

3,7(3,6;3,8)0,002

Аскорбиновая кислота

0,25 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,6(2,6;2,7)0,795

4,3(4,3;4,3)0,946

4,2(4,1;4,2)0,342

0,5 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,4(2,4;2,4)0,003

4,2(4,2;4,3)0,384

4,1(4,1;4,1)0,162

1 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,6(2,5;2,6)0,143

4,2(4,2;4,2)0,042

4,0(4,0;4,1)0,134

2 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,3(2,3;2,3)0,003

4,2(4,1;4,2)0,016

4,0(3,9;4,0)0,010

4 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,4(2,4;2,5)0,009

3,9(3,8;3,9)0,002

3,7(3,6;3,8)0,002

N-ацетилцистеин

0,25 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,7(2,6;2,8)0,899

4,4(4,2;4,4)0,336

4,2(4,1;4,2)0,342

0,5 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,7(2,6;2,8)0,899

4,4(4,3;4,4)0,079

4,2(4,2;4,2)0,025

1 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,7(2,6;2,8)0,900

4,3(4,3;4,4)0,167

4,2(4,2;4,3)0,015

2 мМ

0,4(0,3;0,4)0,313

2,9(2,9;3,0)0,104

4,3(4,2;4,3)0,738

4,3(4,2;4,3)0,008

4 мМ

0,4(0,3;0,4)0,313

2,9(2,9;3,0)0,120

4,0(4,0;4,0)0,002

3,9(3,9;4,1)0,092

Метилэтилпиридинол

0,25 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,7(2,6;2,8)0,899

4,2(4,2;4,2)0,099

4,1(4,1;4,1)0,455

0,5 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,6(2,6;2,6)0,386

4,2(4,2;4,2)0,027

4,0(3,9;4,0)0,010

1 мМ

0,3(0,3;0,3)0,750

2,6(2,5;2,6)0,182

4,1(4,1;4,1)0,002

4,0(3,9;4,0)0,010

2 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,4(2,3;2,5)0,003

3,9(3,9;3,9)0,002

3,8(3,7;3,8)0,002

4 мМ

0,3(0,3;0,3)0,217

2,2(2,2;2,2)0,002

3,7(3,7;3,7)0,002

3,3(3,2;3,3)0,002

Таблица 2

Влияние аскорбиновой кислоты на активность гентамицина (0,3 мг/л) в отношении культуры Escherichia coli ATCC25922

Концентрация антиоксиданта

Оптическая плотность бактериальной биомассы, Me(25 %;75 %)P,усл. ед. по Мак-Фарланду

4 часа

8 часов

12 часов

24 часа

1

2

3

4

5

0 (контроль)

0,1(0,0;0,1)

0,1(0,1;0,1)

0,2(0,2;0,2)

3,7(3,7;4,1)

Восстановленный глутатион

0,25 мМ

0,1(0,1;0,1)0,313

0,2(0,2;0,2)0,038

0,3(0,3;0,3)0,038

4,0(4,0;4,0)0,213

0,5 мМ

0,1(0,1;0,1)0,313

0,2(0,2;0,2)0,009

0,5(0,4;0,5)0,001

4,1(4,0;4,2)0,080

1 мМ

0,1(0,1;0,1)0,072

0,3(0,2;0,2)0,004

0,6(0,6;0,7)0,002

4,0(3,9;4,0)0,320

2 мМ

0,1(0,1;0,2)0,021

0,3(0,3;0,3)0,003

0,8(0,7;0,8)0,001

3,9(3,8;3,9)0,419

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,4(0,4;0,4)0,002

1,0(1,0;1,0)0,001

3,4(3,3;3,5)0,054

Аскорбиновая кислота

0,25 мМ

0,1(0,1;0,1)0,040

0,2(0,1;0,2)0,118

0,2(0,2;0,3)0,375

4,2(4,2;4,2)0,009

0,5 мМ

0,1(0,1;0,1)0,072

0,2(0,2;0,2)0,009

0,3(0,3;0,3)0,038

4,1(4,1;4,2)0,035

1 мМ

0,1(0,1;0,1)0,072

0,2(0,2;0,2)0,038

0,3(0,3;0,3)0,008

4,0(4,0;4,1)0,035

2 мМ

0,2(0,2;0,2)0,004

0,2(0,2;0,2)0,007

0,4(0,4;0,4)0,001

4,0(3,9;4,0)0,237

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,3(0,3;0,3)0,002

0,5(0,5;0,6)0,002

3,7(3,7;3,7)0,387

N-ацетилцистеин

0,25 мМ

0,1(0,1;0,1)0,072

0,1(0,1;0,2)0,294

0,2(0,2;0,2)0,813

4,2(4,1;4,2)0,017

0,5 мМ

0,1(0,1;0,2)0,021

0,2(0,2;0,2)0,038

0,3(0,3;0,3)0,008

4,1(4,1;4,2)0,039

1 мМ

0,2(0,2;0,2)0,004

0,2(0,2;0,2)0,009

0,3(0,3;0,3)0,008

4,2(4,2;4,2)0,013

2 мМ

0,1(0,1;0,2)0,021

0,2(0,2;0,2)0,009

0,4(0,4;0,4)0,002

3,9(3,9;4,0)0,351

4 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,3(0,3;0,3)0,003

0,6(0,5;0,6)0,001

3,7(3,7;3,7)0,561

Метилэтилпиридинол

0,25 мМ

0,1(0,0;0,1)0,313

0,2(0,1;0,2)0,118

0,3(0,2;0,3)0,138

4,1(4,1;4,1)0,085

0,5 мМ

0,1(0,1;0,1)0,040

0,2(0,2;0,2)0,009

0,3(0,3;0,3)0,006

4,1(4,0;4,1)0,115

1 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,2(0,2;0,3)0,005

0,5(0,4;0,5)0,001

4,0(4,0;4,1)0,150

2 мМ

0,2(0,2;0,2)0,001

0,4(0,4;0,5)0,002

1,0(1,0;1,1)0,001

3,7(3,6;3,7)0,561

4 мМ

0,3(0,3;0,3)0,002

1,1(1,1;1,3)0,002

3,1(3,1;3,3)0,001

3,5(3,5;3,5)0,072

Особый интерес представляет собой взаимодействие метилэтилпиридинола и гентамицина. Оба вещества обладают антибактериальными свойствами, но антиоксидант уменьшает активность антибиотика. Поэтому логичным является предположение, что метилэтилпиридинол и гентамицин являются конкурентными антагонистами, и, возможно, подавляют развитие бактерий за счет угнетения синтеза белка на уровне 30S-субъединицы рибосомы. Поскольку метилэтилпиридинол оказывает значительно более слабое действие, а его молярная концентрация превышает таковую для антибиотика, гентамицин не реализует антибактериальный эффект в полной мере.

Общим механизмом снижения чувствительности к гентамицину под влиянием антиоксидантов может быть изменение окислительно-восстановительного потенциала бактериальной трансляционной машины, обеспечивающей синтез белка и являющейся первичной мишенью действия гентамицина. В подтверждение имеются некоторые исследования, демонстрирующие изменение синтеза белка под действием веществ, влияющих на процессы свободнорадикального окисления [9]. Кроме того, антиоксиданты могут нейтрализовать токсические активные формы кислорода, образующиеся в результате неправильной упаковки белков и активации бактериальных ферментных систем Cpx и Arc [8].

Выводы

Установлено, что восстановленный глутатион в концентрациях 0,25–0,5 мМ стимулирует развитие бактерий, в концентрациях 2 и 4 мМ оказывает угнетающее действие. Аскорбиновая кислота, N-ацетилцистеин и метилэтилпиридинол оказывают слабое антибактериальное действие, причем сила эффекта напрямую зависит от концентрации антиоксиданта. Все изучаемые антиоксиданты вызывают снижение чувствительности изучаемого штамма к гентамицину. Особенно сильно активность гентамицина снижает метилэтилпиридинол. Полученные данные необходимо учитывать при использовании гентамицина при инфекции, вызванной Escherichia coli.

Рецензенты:

Смирнов И.В., д.м.н., зав. кафедрой фармакогнозии и ботаники, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул;

Карбышева Н.В., д.м.н., профессор кафедры инфекционных болезней, ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава России, г. Барнаул.

Работа поступила в редакцию 11.04.2013.


Библиографическая ссылка

Мирошниченко А.Г., Брюханов В.М., Бутакова Л.Ю., Госсен И.Е., Перфильев В.Ю., Смирнов П.В. ВЛИЯНИЕ АНТИОКСИДАНТОВ НА РАЗВИТИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ ESCHERICHIA COLI И ЕЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ГЕНТАМИЦИНУ // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 5-2. – С. 339-343;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=31616 (дата обращения: 29.01.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074