Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Зборовская И.А. 1 Алехина И.Ю. 1 Курбанова Р.Д. 1 Александрова Н.В. 1 Емельянова О.И. 1 Александров А.В. 1

---

1 ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальнойревматологии» РАМН

Расширение спектра иммунологических методов диагностики системных ревматических заболеваний может быть обеспечено внедрением в лабораторную практику иммуноферментного метода на основе иммобилизированных ферментов. Изучалось клинико-патогенетическое значение антител к гуаниндезаминазе у 60 больных системной красной волчанкой (СКВ). Обнаружена связь между уровнем антител к гуаниндез­аминазе в сыворотке крови больных СКВ и степенью активности патологического процесса. Предположительно, антитела к гуаниндезаминазе могут входить в состав циркулирующих иммунных комплексов, что может приводить к повышению их уровня у больных СКВ. Внедрение инновационных методов лабораторной диагностики может быть использовано для выявления антител к ферментам в сыворотке крови больных СКВ, что позволит более точно судить об активности патологического процесса и даст дополнительные возможности для своевременной коррекции терапевтического воздействия.

Статья в формате PDF

320 KB

системная красная волчанка

гуаниндезаминаза

антитела

1. Заводовский Б.В. Влияние терапии ксидифоном на гистохимические показатели больных системной красной волчанкой / Б.В. Заводовский, И.А. Зборовская, Е.Г. Трофимова, Л.Е Сивордова // Научно-практическая ревматология. – 2005. – № 3. – С. 44.

2. Ильин М.В. Клинико-патогенетическое значение определения показателей функциональной активности и апоптоза нейтрофилов у больных системной красной волчанкой / М.В. Ильин, П.А. Мальцева, Е.В. Речкина, Н.И. Коршунов // Практическая медицина. – 2011. – № 52. – С. 101–103.

3. Насонов Е.Л. Клинические рекомендации. Ревматология / под ред. Е.Л. Насонова. – М.: ГЭОТАР – Медиа, 2010. – 288 с.

4. Ревматология: национальное руководство / под ред. Е.Л. Насонова, В.А. Насоновой. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 720 с.

5. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. – М.: Медиасфера, 2006. – 312 с.

6. Романова Н.В. Окислительный стресс циркулирующих фагоцитов и поражения органов и систем при системной красной волчанке // Фундаментальные исследования. – 2005. – № 2. – С. 34.

7. Сорока Н.Ф. Апоптоз лимфоцитов перефирической крови у больных системной красной волчанкой: патогенетические и клинические аспекты / Н.Ф. Сорока, А.И. Свирновский, А.Л. Рекун // Научно-практическая ревматология. – 2006. – № 4. – С. 44–52.

8. Ahsan H. Oxygen free radicals and systemic autoimmunity / H. Ahsan, A. Ali, R. Ali // Clin. Exp. Immunol. – 2003. – Vol. 131, № 3. – Р. 398–404.

9. Deshmukh U.S. Mechanisms of autoantibody diversification to SLE-related autoantigens / U.S. Deshmukh,F. Gaskin, J.E. Lewis, C.C. Kannapell, S.M. Fu // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2003. – Vol. 987 – Р. 91–98.

10. Gordon C. Update on systemic lupus erythematosus: autoantibodies and apoptosis / С. Gordon, M. Salmon // Clin. Med. – 2001. – № 1. – Р. 10–14.

11. McConnell J. Neutrophils from systemic lupus erythematosus patients demonstrate increased nuclear DNA damage / J. McConnell, A. Crockard, A. Cairns // Clin. Exp. Rheumatol. – 2002. – № 20 (5). – P. 653–660.

12. Mevorach D. Systemic lupus erythematosus and apoptosis: a question of balance // Clin. Rev. Allergy Immunol. – 2003. – Vol. 25, № 1. – Р.49–60.

13. Uhlen M. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas / M. Uhlen, P. Oksvold, L. Fagerberg, E. Lundberg, K. Jonasson, M. Forsberg, M. Zwahlen, C. Kampf, K. Wester, S. Hober, H. Wernerus, L. Björling, F. Ponten // Nat. Biotechnol. – 2010. – Vol. 28(12). – P. 1248–50.

14. White S., Apoptosis in systemic lupus erythematosus / S. White, A. Rosen // Curr. Opin. Rheum. – 2003. – Vol.15, № 5. – Р. 557–562.

Системная красная волчанка (СКВ) является заболеванием, развивающимся на основе генетически обусловленного несовершенства иммунорегуляторных процессов, приводящего к возникновению иммунокомплексного воспаления и образованию широкого спектра аутоантител, которые могут быть ответственны за многие клинические проявления, имеющие важное значение в диагностике [3, 4].

Среди множества антител основная роль в развитии и поддержании патологического процесса при СКВ принадлежит антителам к ДНК, образующим с антигенами циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК). В настоящее время основными кандидатами на роль аутоантигена считаются нуклеосомы – комплексы ДНК с гистоном. Предположительно в основе патогенеза СКВ лежит генетически обусловленный дефект апоптоза («запрограммированной клеточной смерти»), способствующий высвобождению нуклеосом из клеток, персистированию и экспансии аутореактивных клонов Т- и В-клеток, приводящих к активации поликлональных В-лимфоцитов и формированию Т-зависимого иммунного ответа на аутоантигены. Контроль апоптоза имеет решающее значение для гомеостаза иммунной системы, а его дефекты играют определенную роль в индукции аутоиммунных заболеваний.

Предполагается, что программированная гибель мононуклеаров является одним из механизмов, приводящих к появлению аутоантигенов и усилению их иммуногенности. Увеличение скорости апоптоза лимфоцитов у больных СКВ было продемонстрировано как in vivo (в периферической крови), так и in vitro [7, 10], причем было отмечено, что данный процесс может сопровождаться возрастанием экскреции из клеток деградированной ДНК, нуклеосом, гистонов, компонентов комплекса Гольджи и митохондрий, а также модификацией и перемещением внутриклеточных макромолекул на поверхность мембраноассоциированных фрагментов (апоптотических телец). Следовательно, апоптотические клетки «поставляют» ранее скрытые аутоантигены, которые активируют аутореактивные лимфоциты, способствуют образованию аутоантител и формируют с ними активированные комплементом иммунные комплексы, откладывающиеся на базальных мембранах. Причем характерный для СКВ широкий спектр аутоантител обусловлен многообразием аутоантигенов, модифицированных и освобожденных в ходе апоптоза [12, 14].

В последнее время особый интерес вызывает тот факт, что достаточно часто мишенью аутоиммунных реакций становятся энзимы основных метаболических путей организма, к которым вырабатываются специфические антитела и их можно определить в сыворотке больных, используя современные высокочувствительные методы лабораторного анализа.

Гуаниндезаминаза (гуанинаминогидралаза, гуаназа, ГДА, Е.С. 3.5.4.3) – один из основных ферментов пуринового метаболизма, относится к группе гидролаз, действует на С–N-связи в структуре N–СН–N циклических аминов и катализирует гидролитическое дезаминирование гуанина с образованием ксантина и аммиака. ГДА сосредоточена в гепатоцитах и железистых клетках, выстилающих внутреннюю поверхность желчного пузыря, островках Лангерганса поджелудочной железы, клетках почечных канальцев и в меньшей степени присутствует в нервных клетках коры головного мозга, бокового желудочка и гиппокампа [13]. Активность гуаниндезаминазы в сыворотке крови человека является в первую очередь индикатором гепатоклеточных повреждений: появление активности фермента в сыворотке крови связано с нарушением функции печени.

Цель исследования: совершенствование методов иммунодиагностики СКВ с помощью иммобилизированных магнитоуправляемых антигенных наносистем (АНС) на основе гуаниндезаминазы.

Материалы и методы исследования

Критерии включения больных СКВ в исследование: возраст 18 лет (включительно) и старше; наличие информированного согласия; наличие у больного диагноза СКВ, соответствующего диагностическим критериям; срок, прошедший после установления диагноза, – не менее 6 месяцев.

Критерии исключения больных СКВ из исследования: беременность или лактация; алкогольная и (или) наркотическая зависимость; инфицирование вирусом иммунодефицита человека или возбудителями вирусных гепатитов В и С; наличие на момент отбора злокачественного новообразования любой локализации; тяжелая сопутствующая патология (сахарный диабет 1 или 2 типа, хроническая сердечная недостаточность 3, 4 функционального класса, хроническая почечная недостаточность в терминальной стадии, дыхательная недостаточность 2, 3 степени), требующая активного лечения.

Была сформирована группа больных СКВ численностью 60 человек, полностью соответствующая представленным критериям. Средний возраст больных СКВ составил 36,32 ± 15,27 (М ± SD) лет, среди больных СКВ преобладали женщины (91,7 %), абсолютное большинство составляли лица трудоспособного возраста (90 %), продолжительность СКВ составила 7,97 ± 7,36 лет, средний возраст дебюта болезни 28,5 ± 13,2 лет.

Активность СКВ оценивалась с помощью индексов SLEDAI (исходный показатель, М ± SD: 8,9 ± 5,7; 95 % доверительный интервал для М – 7,5…10,4) и ECLAM (исходный показатель, М ± SD: 5,3 ± 2,8; 95 % доверительный интервал для М – 4,6…6,0), а также по критериям, предложенным В.А. Насоновой (1985 г.): низкая – 9, умеренная – 34, высокая – 17 человек. Повреждение (необратимые изменения в состоянии здоровья) измерялось с помощью индекса SLICC/ACR (исходный показатель, М ± SD: 1,9 ± 1,7; 95 % доверительный интервал для М – 1,5…2,4).

Контрольную группу составили 30 практически здоровых лиц (17 женщин и 13 мужчин в возрасте от 25 до 47 лет).

Антитела к ГДА (анти-ГДА) определяли в сыворотке крови по модифицированной методике иммуноферментного анализа с использованием иммобилизированных магнитоуправляемых антигенных наносистем (АНС). В качестве антигена использовался коммерческий препарат ГДА («Sigma», США). Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля (Гонтарь И.П., 2002). Результаты учитывали на многоканальном микропланшетном спектрофотометре при длине волны 450 нм и выражали в единицах оптической плотности (ед.). Результаты считались положительными при превышении в дублированных образцах средних показателей оптической плотности средних значений нормальных сывороток (лиц контрольной группы) не менее чем на 2 стандартных отклонения.

Статистический анализ экспериментальных данных выполнялся с помощью программного пакета «STATISTICA 6.0 FOR WINDOWS» (StatSoft Inc., USA). Уровень статистической значимости различий сравниваемых показателей устанавливали с использованием t-критерия Стьюдента; непараметрического U-критерия Манна‒Уитни и Т-критерия Уилкоксона. Результат считался достоверным при р < 0,05 [5].

Результаты исследованияи их обсуждение

При поступлении на стационарное лечение у больных СКВ (60 человек) показатели уровня антител к ГДА (М ± SD) составили 1,272 ± 0,817 ед. (95 % доверительный интервал для М – 7,5…10,4). У больных СКВ по сравнению со здоровыми лицами было обнаружено увеличение содержания антител к ГДА (p < 0,001; дисперсионный анализ в варианте с неравными дисперсиями). Количество больных СКВ с повышенным уровнем антител к ГДА составило 52 %. Повышенный уровень антител к ГДА не был выявлен ни у одного обследованного в контрольной группе.

Была выявлена статистически значимая корреляция между уровнем антител к ГДА в сыворотке крови больных СКВ и активностью патологического процесса (индекс SLEDAI: r = 0,361, р = 0,012; индекс ECLAM: r = 0,333, р = 0,011). У больных с низкой активностью СКВ антитела к ГДА выявлялись в 22,2 % случаев, в то время как у больных с умеренной активностью − у 41,2 %, а при высокой активности – у 88,2 % больных СКВ. Данное обстоятельство предполагает возможность использования показателей уровня антител к ГДА в качестве дополнительного лабораторного маркера активности патологического процесса при СКВ (таблица).

Содержание антител к ГДА в зависимости от активности СКВ (M; SD)

Уровень антител к ГДА у больных с умеренной и высокой активностью был значимо выше, чем у больных с низкой активностью СКВ. При дальнейшем сравнении групп между собой были выявлены статистически значимые различия в содержании антител к ГДА между контрольной группой и больными СКВ с высокой активностью (p < 0,001; критерий Даннета), а также между контрольной группой и больными СКВ с умеренной активностью патологического процесса (p = 0,017; критерий Даннета).

Выявление различий между группами больных с различной активностью СКВ по наличию/отсутствию антител к ГДА (Критерий Крускала‒Уоллиса) позволило провести последующие множественные сравнения между данными группами (критерий Даннета). Сравнение больных с различной активностью СКВ, позитивных по антителам к ГДА, продемонстрировало следующие статистически значимые различия: между больными с минимальной и умеренной активностью СКВ (p = 0,039), минимальной и высокой активностью болезни (p = 0,034).

Анализ корреляционных связей антител к ГДА с лабораторными показателями у больных СКВ с минимальной активностью патологического процесса показал достоверную связь умеренной силы с уровнем СОЭ (r = 0,456, р = 0,032) и лейкоцитурией (r = 0,512, р = 0,029). Перед выпиской из стационара содержание антител к ГДА снизилось (F = 15,6; р < 0,0001), но оставалось достоверно выше уровня здоровых лиц (р < 0,001).

У больных с умеренной активностью СКВ была обнаружена корреляция наличия антител к ГДА с уровнем ЦИК (r = 0,684, p = 0,023), уровнем антител к нативной ДНК (r = 0,677, р = 0,017), уровнем антител к денатурированной ДНК (r = 0,402, р = 0,038). Предположительно, антитела к ГДА могут входить в состав циркулирующих иммунных комплексов, что наряду с вовлечением других компонентов в иммунные комплексы может приводить к повышению их уровня у больных СКВ.

После проведенного лечения у больных СКВ с умеренной активностью заболевания отмечена существенная динамика показателей содержания антител к ГДА (F = 81,3; р < 0,001). Содержание изучаемых антител в сыворотке крови больных СКВ данной группы после лечения оставалось достоверно высоким по сравнению с группой доноров (F = 75,5, р < 0,001).

У больных СКВ с высокой активностью патологического процесса уровень антител к ГДА статистически значимо отличался от больных с минимальной активностью (p = 0,008, критерий Даннета) и был сопоставим с уровнем антител у больных с умеренной активностью заболевания (p = 0,281). У больных СКВ данной группы по окончании курса стационарного лечения (по сравнению с поступлением) отмечено достоверное снижение показателей содержания антител к ГДА (р < 0,001).

Кроме того, в группе больных СКВ была отмечена отрицательная корреляция уровня анти-ГДА со значениями биохимической активности гуаниндезаминазы в сыворотке крови (r = –0,35). Наиболее высокие уровни анти-ГДА отмечались у больных СКВ с поражением печени (р = 0,024) и у больных с выраженным цитопеническим синдромом (р = 0,039). Следует подчеркнуть, что в группе больных СКВ, позитивных по анти-ГДА, также статистически значимо чаще выявлялось поражение печени (χ² с поправкой Йетса = 18,95, р = 0,001) и анемия (χ² с поправкой Йетса = 6,92, р = 0,009).

Собственные белки организма в нормальных условиях приводят, как правило, к развитию естественной толерантности, так как основные антигенные детерминанты этих белков распознаются Т-клетками и не могут вызвать образование антител. В случае изменения конформации белка на его поверхности появляются «скрытые эпитопы», то есть такие антигенные детерминанты, которые не участвовали в процессе выработки иммунологической толерантности, а, значит, распознаются как чужеродные антигены [9].

Одной из возможных причин конформационных изменений структуры белка могут явиться активные формы кислорода (АФК) и усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ). Общепризнано, что при СКВ имеет место накопление АФК, вторичных свободнорадикальных продуктов, которые активно реагируют с молекулами в ближайшем окружении [8], а в результате этих процессов происходит усиление пероксидации мембранных структур и нарастание дефектов в контроле апоптоза клеток. Отмечено, что развитие патологических процессов при СКВ сопровождается нарушением регуляции апоптоза лейкоцитов [6] и нейтрофилов [11], причем снижение уровня апоптоза нейтрофилов сопровождается усилением образования активных форм кислорода и уменьшением резервного потенциала клеток [2]. Дефекты апоптоза приводят к усилению секвестрации аутоантигенов в апоптотические тельца, что в итоге способствует срыву толерантности, созданию «новых эпитопов» и, как следствие, увеличению выработки аутоантител.

Чрезмерное образование свободных радикалов при СКВ вызывает повреждение мембран макрофагов, эритроцитов и других клеточных структур [1], а также способствует выходу в экстрацеллюлярное пространство многих биологически активных веществ, в том числе и ферментов. Наличие антигенных свойств у ферментов обеспечивает ответную реакцию при их выходе из клетки, а воздействие различных факторов воспаления усиливает антигенные свойства энзимов вследствие возможного окисления их функциональных групп. Поэтому становится понятной выявленная нами положительная корреляционная связь между активностью СКВ и уровнем антителогенеза к ГДА.

Заключение

Механизмы образования аутоантител при таких заболеваниях, как СКВ, до сих пор не определены. Внедрение инновационных методов лабораторной диагностики на основе АНС может быть использовано для выявления антител к ферментам, в том числе и к ГДА, в сыворотке крови больных СКВ, что позволит более точно судить об активности патологического процесса и даст дополнительные возможности для своевременной коррекции терапевтического воздействия.

Рецензенты:

Краюшкин С.И., д.м.н., профессор, зав. кафедрой амбулаторной и скорой медицинской помощи, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г. Волгоград;

Емельянов Д.Н., д.м.н., профессор, зав. кафедрой пропедевтики внутренних болезней, ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава РФ, г. Волгоград.

Работа поступила в редакцию 07.05.2013.

Библиографическая ссылка