Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Павленко В.В. 1 Александрова С.Б. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Минздрава России

Обследованы 45 пациентов с язвенным колитом в динамике лечения различными комбинациями лекарственных препаратов. Содержание нейропептидов в ткани толстой кишки определяли методом иммуноферментного анализа. Установлено, что в период обострения язвенного колита содержание вещества Р и нейротензина в ткани толстой кишки повышено, а уровень вазоинтестинального пептида снижен. Наибольшая концентрация вещества Р и нейротензина в слизистой толстой кишки и наименьшие показатели вазоинтестинального пептида выявлены при тяжелом течении ЯК. Более высокие показатели вещества P, нейротензина и низкие – вазоинтестинального пептида наблюдались при 3-й степени активности воспалительно-деструктивного процесса в слизистой оболочке толстой кишки. Выявлена прямая зависимость между индексом клинической активности (индекс Рахмилевича) и уровнями вещества Р и нейротензина в ткани толстой кишки, и обратная – c вазоинтестинальным пептидом. Используемые в терапии язвенного колита лекарственные препараты способны модулировать уровень изучаемых нейропептидов в ткани толстой кишки больных активным язвенным колитом.

Статья в формате PDF

377 KB

язвенный колит

нейропептиды

1. Ливзан М.А. Воспалительные заболевания кишечника: современные аспекты диагностики и лечения / М.А. Ливзан, М.А. Макейкина // Consilium mtdicum (прил. Гастроэнтерология). – 2010. – № 2. – С. 60–65.

2. Неспецифические воспалительные заболевания кишечника / под ред. Г.И. Воробьева, И.Л. Халифа. – М.: Миклош, 2008. – 400 с.

3. Неспецифический язвенный колит / Ф.И. Комаров, А.М. Осадчук, М.А. Осадчук, И.М. Кветной. – М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008. – 256 с.

4. Ткаченко Е.В. Гастроинтестинальные гормоны в клинической гастроэнтерологии / Е.В. Ткаченко, Г.Г. Варванина // Тер. архив. – 2009. – Т.81, № 2. – С. 87–90.

5. Ardizzone, S. Biologic therapy for inflammatory bowel disease. / S. Ardizzone, G. Bianchi Porro // Drugs. – 2005. – Vol. 65. – P. 2253–2286.

6. Brun P. Neuropeptide neurotensin stimulates intestinal wound healing following chronic intestinal inflammation / P. Brun, C. Mastrotto, E. Beggiao [et al.] // J. Am. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2005. – Vol. 288. – P. 621–629.

7. Neunlist, М. Changes in chemical coding of mysenteric neurones in ulcerative colitis / M. Neunlist [et al.] // Gut. – 2003. – Vol. 52. – P. 84–90.

8. Kara, J. Role of Neuropeptides in Inflammatory Bowel Disease / J. Kara, M.D. Gross, M.D. Charalabos Pothoulakis // Inflammatory Bowel Diseases. – 2007. – Vol. 13. – Р. 918–932.

9. Karagiannides, I. Induction of colitis causes inflammatory responses in fat depots: evidence for substance P pathways in human mesenteric preadipocytes / I. Karagiannides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. – Vol. 103. – P.5207–5212.

10. Koon, H.W. Immunomodulatory Properties of Substance P. The Gastrointestinal System as a Model / H.W. Koon, C. Pothoulakis // N.Y. Ann. Acad. Sci. – 2006. – Vol. 1088. – P. 23–40.

11. Sartor, R.B. Mechanisms of disease: pathogenesis of Crohn’s disease and ulcerative colitis. / R.B. Sartor // Nat Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. – 2006. – Vol. 3. – P. 390–407.

12. Ter Beek, W.P. Substance P receptor expression in patients with inflammatory bowel disease. Determination by three different techniques, storage phosphor autoradiography, RT-PCR and immunohistochemistry / W.P. ter Beek, I. Biemond [et al.] // Neuropeptides. – 2007. – Vol.41. – P. 301–306.

Язвенный колит (ЯК) – полиэтиологическое заболевание, в происхождении которого могут участвовать генетический, инфекционный, аллергический, пищевой и иммунологический факторы. Однако последовательность тех или иных механизмов возникновения ЯК остается малоизученной и требует дальнейшего анализа [2, 3]. В последнее время большой интерес уделяется иммунологическим аспектам патогенеза ЯК. Одним из способов регуляторного воздействия на течение и исход воспалительного процесса, наряду с иммунной регуляцией, становится передача информации с помощью нейрогормонов, которые вырабатываются как в ЦНС, так и в диффузной эндокринной системе (ДЭС) желудочно-кишечного тракта [6, 7, 8]. В последние годы были обнаружены новые функции некоторых нейропептидов в регуляции воспалительных реакций. Показано, что эффекторные клетки (энтероциты) содержат рецепторы для нейропептидов, а клетки иммунной системы (лимфоциты, макрофаги) способны вырабатывать коммуникационные нейропептиды [4, 6, 7, 8].

Считается, что взаимодействие нервной и иммунной систем на уровне кишечника становится одним из патофизиологических факторов развития инфекционной диареи и воспалительного процесса в кишечнике, в том числе и при ЯК [6, 8]. У здоровых лиц в желудочно-кишечном тракте постоянно поддерживается баланс между провоспалительными (SP, VIP, нейротензина и др.) и противовоспалительными нейропептидами (CGPR, соматостатин, бомбезин и др.). Нарушение указанного баланса вносит определенный вклад в патофизиологию ЯК [6, 7, 8]. В клинической практике и при экспериментальном колите вещество Р и нейротензин были способны регулировать моторную и секреторную деятельность кишечника, увеличивать капиллярную проницаемость, вызывать дегрануляцию тучных клеток, оказывать влияние на продукцию иммуноглобулинов, хемотаксис и фагоцитоз иммуноцитов, нейтрофильное лизосомальное высвобождение, потенцируя таким образом иммуновоспалительную реакцию в толстой кишке [4, 6, 7, 8, 9]. VIP оказывает ряд эффектов на физиологию кишечника, участвуя в регуляции секреции электролитов и воды, кровоснабжения кишечника и его моторики, вовлекается в нейропластические реакции, заключающиеся в перестройке нервной системы кишечника в ответ на ее повреждение [6, 7, 8].

Цель исследования – изучить содержание провоспалительных нейропептидов – вещества Р, вазоинтестинального пептида и нейротензина в ткани толстой кишки (СОТК) больных язвенным колитом в динамике лечения..

Материалы и методы исследования

Обследованы 45 больных активным ЯК (18 мужчин и 27 женщин) в возрасте от 20 до 60 лет с различной тяжестью заболевания в динамике лечения (в среднем через 6 недель). У 24 пациентов выявлено рецидивирующее течение ЯК, у 13 – непрерывное течение, острый колит – у 8 пациентов. Для определения тяжести ЯК использовали индекс активности Рахмилевича. Легкая форма ЯК установлена у 11 пациентов (индекс клинической активности – 1–5 баллов), среднетяжелая – у 24 пациентов (индекс клинической активности 6–15 баллов), тяжелая – у 10 пациентов (индекс клинической активности 16–30 баллов). В зависимости от тяжести заболевания использовали препараты 5-АСК, глюкокортикостероиды (ГКС), цитостатики, биологическую терапию (Инфликсимаб), антибактериальную и симптоматическую терапию.

Кусочки биоптатов, полученные во время эндоскопии, взвешивали (5–10 мг), гомогенизировали в ледяном растворе 0,9 % NaCl, помещали в полипропиленовую пробирку, содержащую ЭДТА (этилендиаминтетрауксусную кислоту) в качестве антикоагулянта и апротинин в качестве ингибитора протеаз, при 4 °C гомогенизировали в ледяном соляном растворе фосфатного буфера (pH 7,4), содержащем протеазные ингибиторы (1 мкмоль фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина. Гомогенаты центрифугировали при 20.000хg в течение 10 минут при температуре 4 °C, после чего надосадочную жидкость (супернатант) собирали в полипропиленовую пробирку и хранили при –50 °C. Содержание нейропептидов – вещества Р (SP), нейротензина (NT) и вазоактивного интестинального полипептида (VIP) в супернатанте определяли методом ИФА с помощью стандартных тест-систем (Peptide Ensyme Immunoassay, Peninsula Laboratories, LLC, USA) согласно прилагаемой инструкции. Результаты выражали в нг/г сырой ткани.

Контрольную группу составили 15 здоровых добровольцев. Содержание SP в СОТК контрольной группы составило 0,198 ± 0,02 нг/г, NT – 0,03 ± 0,01 нг/г, VIP – 0,178 ± 0,01 нг/г.

При статистической обработке результатов исследования использовали t-критерий Стьюдента, коэффициент ранговой корреляции Спирмена (rs), точный критерий Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение

В период обострения заболевания содержание SP и NТ в СОТК больных ЯК было повышено (0,553 ± 0,11 и 0,641 ± 0,19 нг/г соответственно, Р < 0,001), а уровень VIP снижен (0,037 ± 0,02 нг/г, Р < 0,001). Был проведен анализ изучаемых показателей у больных с различной тяжестью течения заболевания (табл. 1).

Таблица 1

Содержание SP, NT, VIP в СОТК больных с различной тяжестью ЯК

Примечания:

* – P < 0,05 в сравнении с контролем; P1-2 – различия показателей 1-й и 2-й групп; Р1-3 – различия показателей 1-й и 3-й групп; Р2-3 – различия показателей 2-й и 3-й групп.

Установлено, что в период выраженных клинических проявлений ЯК содержание SP и NT в СОТК было повышено во всех исследуемых группах. Наиболее высокие уровни SP и NT и наименьшие показатели VIP выявлены при тяжелом ЯК.

Учитывая тот факт, что тяжесть течения ЯК определяется выраженностью воспалительно-деструктивного процесса в толстой кишке, нами проведен анализ содержания SP, NT и VIP в СОТК в зависимости от обсуждаемого критерия (табл. 2).

Таблица 2

Содержание SP, NT, VIP в СОТК больных ЯК в зависимости от степени активности воспалительного процесса в толстой кишке

Примечания:

* – P < 0,05 в сравнении с контрольной группой. P1-2 – различия показателей 1-й и 2-й групп;

Р1-3 – различия показателей 1-й и 3-й групп; Р2-3 – различия показателей 2-й и 3-й групп.

Установлено, что более высокие показатели SP и NT наблюдались при 2-й и, особенно, 3-й степени (2-я и 3-я группы) активности воспалительно-деструктивного процесса в СОТК. При этом уровень VIP находился в обратной зависимости от степени эндоскопической активности ЯК.

Нами был проведен корреляционный анализ между продукцией изучаемых нейропептидов в СОТК и клиническим индексом активности ЯК (индекс Рахмилевича) с использованием непараметрического метода ранговой корреляции Спирмена (табл. 3).

Таблица 3

Взаимосвязь между содержанием SP, NT, VIP в СОТК и показателями индекса клинической активности по Рахмилевичу

Примечание. * – P < 0,05.

Выявлена прямая достоверная зависимость между индексом клинической активности и уровнем SP и NT, и обратная – c VIP в СОТК.

В период формирования клинической ремиссии на фоне проводимой терапии (в среднем через 6 недель) отмечалась тенденция к нормализации SP и NT в CОТК. В эти же сроки отмечалось повышение уровня VIP в СОТК, но не до контрольного уровня.

С целью изучения влияния фармакологических препаратов и их комбинаций, используемых в терапии ЯК, на содержание изучаемых нейропептидов больные были разделены на группы в зависимости от вида лечения. Первой группе больных (13 пациентов с легким течением ЯК) назначались препараты 5-аминосалициловой кислоты (5-АСК) в виде монотерапии. Вторая группа (20 пациентов среднетяжелым ЯК) получала комбинацию препаратов 5-АСК с ГКС (преднизолон, метипред, гидрокортизон). Третьей группе (7 больных с тяжелой формой ЯК) назначалась сочетанная терапия гормонами и азатиоприном в рекомендованных дозировках. Четвертую группу составили 5 пациентов с высокой степенью клинической активности ЯК, получившие в дополнение к базисной терапии Инфликсимаб (Ремикейд) по индукционной схеме в дозе 5 мг/кг массы тела.

Установлено (рисунок), что формирование клинической ремиссии ЯК сопровождалось снижением уровня SP и NT и повышением уровня VIP в СОТК у всех больных, независимо от комбинации используемых препаратов. В группе больных тяжелого ЯК c изначально более низкими показателями VIP и более высокими показателями SP и NT в СОТК, рефрактерных к традиционной базисной терапии, после трехкратного внутривенного введения Ремикейда (Инфликсимаба) отмечалась нормализация изучаемых нейропептидов уже на 6-й неделе лечения.

Установленные закономерности в содержании изучаемых нейропептидов в СОТК больных различными клиническими формами ЯК подтверждают их причастность к патофизиологическим процессам в толстой кишке.

Динамика содержания SP, NT и VIP в CОТК в зависимости от вида лечения: * – P < 0,05 с контролем; ** – P < 0,05 между группами до и после лечения

Известно, что вещество Р высвобождается в ответ на повреждение слизистой толстой кишки [3, 6, 7, 9, 11, 12]. Увеличение экспрессии SP наблюдается как в тканях [5, 6, 7, 9], так и в нервных волокнах толстой кишки больных ЯК [3, 6, 8]. Повышение уровня SP у пациентов с ЯК также коррелирует с активностью заболевания [6, 8]. Эффекты SP опосредованы тремя рецепторами, принадлежащими к суперсемейству G-протеиновых рецепторов: NK-1, NK-2 и NK-3. Исследования на моделях животных четко указывают на важную роль SP и рецепторов NK-1 в патофизиологии ЯК. Провоспалительная активность вещества Р была подтверждена in vivo с использованием нескольких моделей экспериментального колита. Исключительно раннее увеличение числа NK-1-рецепторов наблюдается в слизистой оболочке подвздошной кишки у крыс при воспалении, вызванном токсином А (Clostridium difficile) с особенно возрастающей экспрессией в кишечном эпителии [6, 7, 8, 12], что наблюдалось у больных с Clostridium difficile-ассоциированным колитом [8, 12, 65]. При энтероколите у крыс, индуцированном токсином А (Clostridium difficile), специфический антагонист вещества Р CP-96,345 (Pfizer Diagnostics), блокирующий NK-1-рецепторы, значительно снижал секрецию жидкости, вызванную токсином А, проницаемость маннитола, высвобождение протеазы II тучных клеток, а также подавлял процессы воспаления и повреждения слизистой оболочки [6, 11, 12]. Вероятно, что ФНО-α также вовлечен в эти процессы, так как увеличение содержания этого цитокина в макрофагах собственной пластинки слизистой толстой кишки в ответ на инъекцию токсина А можно было ингибировать in vivo и in vitro при помощи антагониста вещества Р – СР-96,345 [8] или антител к веществу Р [6, 8, 10].

Нейротензин демонстрировал способность активировать несколько типов иммунных и воспалительных клеток посредством взаимодействия с R1 – рецепторами (дегрануляцию тучных клеток в тонкой и толстой кишке; транспорт, фагоцитоз и адгезию нейтрофилов и лимфоцитов, продукцию IL-1β, ПГЕ2), модулируя таким образом кишечное воспаление [4, 6, 8]. На материале in vivo получены доказательства того, что нейротензин участвует в процессах как острого, так и хронического воспаления. Так, при остром колите, индуцированном токсином А (Clostridium difficile), нейротензин активизирует дегрануляцию тучных клеток и усиливает приток нейтрофилов, что способствует более выраженному повреждению тканей [6, 8, 11].

Содержание VIP при патологии кишечника мало изучено. Отмечено снижение содержания VIP в слизистом/подслизистом слое пациентов с БК и ЯК [3, ,7 8]. Эти данные недавно подтвердились в независимых исследованиях биоптатов слизистой, полученных от пациентов с ЯК [3, 5, 7]. Повышение числа VIP-иммунореактивных нервных волокон недавно обнаружено в биоптатах слизистой оболочки пациентов с ЯК, перенесших колпроктэктомию [8].

Положительный эффект используемых лекарственных средств при разнообразных формах ЯК связан с их прямым или опосредованным действием на различные каскады воспаления. Препараты 5-АСК при ЯК способствуют снижению выработки производных арахидоновой кислоты, уменьшают пролиферацию Т-лимфоцитов и антителообразование В-лимфоцитами, блокируют продукцию, рецепторное связывание и эффективность ФНО-α, интерлейкинов [1, 2, 3]. ГКС при ЯК способствуют снижению адгезии лейкоцитов, участвуют в подавлении фагоцитоза, снижении экспрессии молекул адгезии, подавлении продукции антител, ингибиции клеточно-опосредованной цитотоксичности и высвобождения воспалительных медиаторов. Аутоиммунная природа ЯК обусловливает повышенный интерес клиницистов к использоваанию цитостатиков. Азатиоприн, являясь структурным аналогом аденина, гипоксантина и гуанина, входящих в состав нуклеиновых кислот, блокирует клеточное деление и пролиферацию тканей, включаясь в метаболические реакции, нарушает синтез нуклеиновых кислот, конкурирует с гипоксантином и гуанином за гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазу, при участии которой происходит образование тиоинозиновой кислоты из меркаптопурина. Иммунодепрессивное действие азатиоприна направлено преимущественно на реакции замедленной гиперчувствительности и клеточную цитотоксичность.

Биологические методы широко применяют при лечении ЯК [1, 2, 5]. Ингибитор ФНО-α Инфликсимаб оказался способным быстро купировать рецидив, обеспечивать длительную ремиссию и уменьшать потребность в гормонах у значительного числа больных с гормонорезистентными и гормонозависимыми формами ЯК. Использование нами биологической терапии у больных с резистентными формами ЯК привело к нормализации уровней вещества Р, вазоинтестинального пептида и нейротензина в СОТК уже в период формирования клинической ремиссии ЯК. Механизмы, посредством которых ингибиторы ФНО-α подавляют продукцию провоспалительных нейропептидов, в настоящее время изучаются. Известно, что ФНО-α активирует синтез вещества Р в симпатических ганглиях посредством последовательной индукции интерлейкина-1 и фактора ингибирования лейкемии. В то же время SP может усиливать прямые провоспалительные реакции в клетках-мишенях, в том числе секрецию IL-1β, IL-6 и мощных хемоаттрактантов – IL-8 и ФНО-α [6, 8]. Инфликсимаб обладает высокой аффинностью к ФНО-α, быстро связывается и образует устойчивое соединение с обеими его формами (растворимой и трансмембранной), снижая его функциональную активность и подавляя воспалительную реакцию в кишечнике [5, 6, 8].

Полученные данные позволяют считать SP, VIP и NT важными медиаторами нейроиммунных реакций при развитии ЯК. Способность нейропептидов модулировать кишечное воспаление позволяет предположить, что эти вещества могут стать перспективной мишенью в терапии воспалительных заболеваний кишечника.

Выводы

1. В период обострения ЯК содержание SP и NT в СОТК повышено, а VIP – снижено.

2. Показатели вещества P и NT в СОТК больных с тяжелым течением ЯК были наиболее высокими, а уровень VIP наиболее низким.

3. Наиболее высокие показатели SP, NT и наиболее низкие показатели VIP наблюдались в 3-й степени активности воспалительно-деструктивного процесса в СОТК.

4. Содержание SP и NT в СОТК больных активным ЯК находилось в прямой связи с тяжестью ЯК, а показатели VIP – в обратной.

5. Формирование клинической ремиссии ЯК сопровождается снижением содержания SP, NT и повышением уровня VIP в СОТК.

6. Динамика содержания исследуемых нейропептидов зависит от используемых в лечении ЯК лекарственных препаратов.

Рецензенты:

Ткачев А.В., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой пропедевтики внутренних болезней Ростовского государственного медицинского университета, г. Ростов-на-Дону;

Гейвандова Н.И., д.м.н., профессор кафедры госпитальной терапии Ставропольского государственного медицинского университета, г. Ставрополь.

Работа поступила в редакцию 09.10.2013.

Библиографическая ссылка