Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Журавлева З.Н. 1 Ермаков А.А. 1 Журавлев Г.И. 2

---

1 ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН»

2 ФГБУН «Институт биофизики клетки РАН»

Проводили ультраструктурное изучение гигантских синаптических окончаний аксонов гранулярных клеток гиппокамповой формации (мшистых волокон) в норме и в гетеротопических трансплантатах зубчатой фасции после цинк-йод-осмиевой (ЦИО) импрегнации. Для аллотрансплантации в соматосенсорную область неокортекса взрослых крыс использовали закладку зубчатой фасции из 20-дневных плодов; трансплантаты развивались в течение 5 месяцев. Показано, что в обеих экспериментальных группах гигантские бутоны содержали гетерогенную популяцию синаптических везикул: часть (более 40 %) малых светлых пузырьков реагировала с ЦИО-смесью, остальные малые пузырьки, а также большие везикулы с электронноплотной сердцевиной, митохондрии и постсинаптические области были ЦИО-негативны. На основании обнаруженных особенностей окрашивания синаптических органелл в гигантских синапсах и анализа соответствующей литературы можно предположить, что ЦИО-позитивные органеллы имеют физиологическое значение. Кроме того, сравнительная оценка показала, что по общему числу везикул и количеству ЦИО-позитивных органелл синаптические окончания трансплантатов значительно отстают от синапсов интактного гиппокампа. Полученные данные свидетельствуют о сниженной функциональной активности гигантских синапсов в нейротрансплантатах.

Статья в формате PDF

395 KB

гетеротопический трансплантат

гиппокамповая формация

мшистые волокна

гигантские синаптические окончания

синаптические везикулы

ЦИО-импрегнация

1. Журавлева З.Н. Дифференцировка нейронов и синапсов мшистых волокон в трансплантатах зубчатой фасции, развивающейся в неокортексе крыс // Онтогенез. – 1998. – Т. 29, № 2. – С. 85–91.

2. Журавлева З.Н., Ермаков А.А., Журавлев Г.И. Вовлечение нейропептидных механизмов в процесс интеграции гетеротопических трансплантатов зубчатой фасции с мозгом реципиента // Журн. высш. нервн. деят. – 2007. – Т. 57, № 2. – С. 205–209.

3. Журавлева З.Н., Журавлев Г.И., Муганцева Е.А. Синаптические взаимодействия трансплантатов нервной ткани с мозгом животного-реципиента // Фунд. исслед. – 2011. – № 10, часть 3. – С. 577–580.

4. Журавлева З.Н., Хуцян С.С. Структурные признаки динамичного состояния синаптических контактов между нейротрансплантатом и мозгом // Бюлл. экспер. биол. мед. – 2013. – Т. 156, № 10. – С. 433–437.

5. Akert K., Kawana E., Sandri C. ZIO-positive and ZIO-negative vesicles in nerve terminals // Prog. Brain Res. – 1971. – Vol. 34. – P. 305–317.

6. Cordeiro J.M., Boda B., Gonçalves P.P., Dunant Y. Synaptotagmin 1 is required for vesicular Ca(2+) /H(+) -antiport activity // J. Neurochem. – 2013. – Vol. 126, № 1. – P. 37–46.

7. De lraldi A.P. Localizing-SH groups in monoaminergic synaptic vesicles with the mixture of zinc iodide-osmium tetroxide (ZIO) // Brain Res. – 1975. – Vol. 94. – P. 363–367.

8. Gilloteaux J., Naud J. The zinc-iodide osmium tetroxide staining-fixative of Maillet. Nature of the precipitate studied by X-ray microanalysis and detection of Ca++-affinity subcellular sites in a tonic smooth muscle // Histochem. – 1979. – Vol. 63. – P. 227–243.

9. Gutierrez R. The dual glutamatergic-GABAergic phenotype of hippocampal granule cells // Trends Neurosci. – 2005. – Vol. 28. – P. 297–303.

10. Henze D.A., Urban N.N., Barrionuevo G. The multifarious hippocampal mossy fiber pathway: a review // Neurosci. – 2000. – Vol. 98, № 3. – P. 407–427.

11. Nicoll R.A., Schmitz D. Synaptic plasticity at hippocampal mossy fibre synapses // Nat. Rev. Neurosci. – 2005. – Vol. 6. – P. 863–876.

12. Nishiki T., Augustine G.J. Synaptotagmin I synchronizes transmitter release in mouse hippocampal neurons // J. Neurosci. – 2004. – Vol. 24, № 27. – P. 6127–6132.

13. Rollenhagen A., Lübke J.H. The morphology of excitatory central synapses: from structure to function // Cell Tissue Res. – 2006. – Vol. 326. – P. 221–237.

14. Rollenhagen A., Sätzler K., Rodríguez E.P., Jonas P., Frotscher M., Lübke J.H. Structural determinants of transmission at large hippocampal mossy fiber synapses // J. Neurosci. – 2007. – Vol. 27, № 39. – P. 10434 –10444.

15. Toni N., Laplagne D.A., Zhao C., Lombardi G., Ribak C.E., Gage F.H., Schinder A.F. Neurons born in the adult dentate gyrus form functional synapses with target cells // Nat. Neurosci. – 2008. – Vol. 11. – P. 901–907.

Гиппокамповая формация мозга, имеющая большое значение для процессов обучения и памяти, состоит из собственно гиппокампа и зубчатой фасции. Гранулярные нейроны зубчатой фасции получают информацию из неокортекса и передают ее в гиппокамп через свои аксоны, так называемые мшистые волокна. Пучки тонких немиелинизированных аксонов следуют вдоль слоя апикальных дендритов пирамидных нейронов поля СА3 и образуют на них гигантские синаптические комплексы. Нервные элементы этой афферентной системы гиппокампа являются чрезвычайно пластичными и подвергаются структурной и функциональной перестройке в ответ на разные внутренние и внешние воздействия [11]. Способность нейронов зубчатой фасции к пластической реорганизации проявляется также в том, что они могут генерироваться в течение всей жизни и функционально встраиваться в уже существующие нейронные сети [15]. В условиях гетеротопической нейротрасплантации они формируют синаптические взаимодействия с нейронами, с которыми в норме не контактируют [3, 4]. По-видимому, столь высокая функциональная пластичность гранулярных нейронов зубчатой фасции обусловлена их сложным и гетерогенным нейрохимическим составом. Основным нейромедиатором синаптических окончаний гранулярных нейронов является глутамат. Во время постнатального развития и при повышенной активности дополнительно к глутамату в них экспрессируется гамма-аминомасляная кислота [9]. Гранулярные клетки, их аксоны и синаптические терминали имеют самое большое в мозге количество ионов цинка. Кроме того, они содержат нейропептидные ко-трансмиттеры и богаты ростовыми факторами [10]. Ранее мы показали, что при формировании синапсов мшистых волокон с несвойственными им в норме нейрональными мишенями роль нейропептидных котрансмиттеров значительно возрастает [3, 4]. Целью настоящей работы было изучение нейрохимических особенностей синапсов мшистых волокон в норме и после нейротрансплантации с помощью цинк-йод-осмиевой импрегнации.

Материал и методы исследования

Исследование проведено на крысах породы Вистар в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 10993-2-2009. Объектами для изучения были гиппокамповая формация интактного мозга и гетеротопические трансплантаты зубчатой фасции. Донорским материалом для трансплантации служили закладки фасции 20-дневных плодов, которые выделяли в растворе Игла под стереомикроскопом. В качестве реципиентов использовали крыс-самцов (n = 5) возрастом 3 мес. Трансплантацию производили в полость в соматосенсорной области неокортекса, где эмбриональная ткань развивалась в течение 5 месяцев. Более детально процедура нейротрансплантации описана ранее [1, 2]. Образцы ткани, взятые из нормального мозга (зона окончания мшистых волокон – str. lucidum) и из нейротрансплантатов, фиксировали 4 % раствором формальдегида на фосфатном буфере, разрезали его на кусочки объемом 1 мм³ и дофиксировали 6,25 % раствором глутарового альдегида. После промывки в трис-HCl буфере образцы импрегнировали в течение 16 час. при 4 °С в цинк-йод-осмиевой смеси, которую готовили следующим образом. Раствор А – 6 г цинка в порошке и 2 г перекристаллизованного йода растворяли в 40 мл дистиллированной воды. Раствор Б – 4 мл фильтрованного раствора А доводили 4 мл трис-HCl до рН 7,4. Перед употреблением к 8 мл полученной смеси добавляли 2 мл 2 % раствора четырехокиси осмия. Затем материал обезвоживали в спиртах восходящей крепости и абсолютном ацетоне и заливали в эпон 812. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе. Гигантские синапсы мшистых волокон идентифицировали благодаря большим размерам синаптической терминали (до 4–6 мкм) и другим структурным признакам, известным из литературы и собственных наблюдений [1, 14]. Сравнительный количественный анализ общего числа синаптических везикул и ЦИО-положительных органелл в гигантских синапсах гиппокамповой формации in situ и нейротрансплантатов проводили с помощью компьютерной программы UTHSCSA Image Tool. Для этого использовали отцифрованные электронно-микроскопические изображения гигантских синаптических бутонов и производили подсчет на площади 1 мкм² (по 25 квадратов в 4 разных вариантах эксперимента); достоверность различий определяли по критерию Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

При исследовании полутонких срезов под световым микроскопом было обнаружено, что цинк-йод-осмиевый реагент проник в кусочки ткани не на всю глубину. Поэтому для электронной микроскопии использовали только поверхностные участки образцов. Сохранность ткани была хорошей и гигантские синаптические окончания мшистых волокон легко распознавались среди других нервных элементов как в контрольном, так и в экспериментальном материале. Огромные аксонные расширения диаметром около 5–6 мкм, густо заполненные синаптическими пузырьками, широко распластывались по апикальным дендритам пирамидных нейронов гиппокампа, образуя с ними преимущественно симметричные адгезивные соединения. Вместе с тем мшистые волокна формировали синаптические контакты с асимметричными активными зонами на инвагинированных в терминали дендритных шипиках. Хотя в трансплантированной ткани зубчатой фасции наблюдались некоторые нетипичные для нормального гиппокампа функциональные взаимодействия, их изучение не входило в задачу настоящей работы. Основные особенности ультраструктуры гетеротопических нейротрансплантатов были нами описаны ранее [1]. Электронно-микроскопическое изучение обоих типов образцов после проведения ЦИО-импрегнации показало, что продукт реакции выявлялся не только в гигантских аксональных бутонах, но и в более мелких синаптических профилях. К сожалению, достоверно определить происхождение синаптических бутонов малого размера не представлялось возможным, и они для настоящего анализа не использовались, хотя и могли быть перерезанными фрагментами крупных терминалей мшистых волокон.

Характер распределения продукта импрегнации в гигантских синаптических окончаниях нормальной гиппокамповой формации и в нейротрансплантатах зубчатой фасции был аналогичен. При этом была выявлена определенная специфичность проведенной реакции, выражающаяся в том, что реакционный продукт четко ассоциировался с малыми (около 40 нм в диаметре) светлыми синаптическими пузырьками, в то время как митохондрии и постсинаптические плотности были всегда негативны (рисунок). Большие везикулы диаметром 80–120 нм с осмиофильной сердцевиной, которые в гигантских синапсах мшистых волокон являются вместилищем нейропептидных ко-трансмиттеров, также никогда не реагировали с ЦИО-реагентом. Гранулы ЦИО-преципитата по размеру варьировались от 20 до 60 нм в диаметре и распределялись по аксоплазме не равномерно, а формировали не очень выраженные скопления. Редкие везикулы с положительной реакцией наблюдались также в непосредственном контакте с плазматической мембраной. В некоторых синаптических окончаниях, как правило, имеющих более осмиофильный матрикс, окрашенные везикулы концентрировались в области активных зон. В большинстве синаптических везикул продукт реакции плотно заполнял внутренний объем, а особенно крупные, грубые конгломераты неправильной формы даже выходили за границу пузырьков. В то же время некоторые пузырьки были заполнены продуктом реакции только частично, а иногда ЦИО-окрашенные зерна точечного размера лишь контурировали везикулярные мембраны. Часть окрашенных пузырьков имела овальную форму, напоминая эллипсоидные синаптические везикулы, которые типичны для тормозных синапсов, хранящих гамма-аминомасляную кислоту. Возможно, окрашенные эллипсоидные везикулы в нашем материале также имеют отношение к хранению тормозного нейромедиатора. В пользу такого предположения говорят данные об обнаружении в системе мшистых волокон помимо основного нейромедиатора глутамата гамма-аминомасляной кислоты, количество которой увеличивается при развитии и функциональной нагрузке [9]. Визуальная оценка наших препаратов указывает на возрастание числа эллипсоидных везикул в гигантских синапсах трансплантированной зубчатой фасции. Взаимодействие ЦИО-реагента с везикулами разной нейромедиаторной природы свидетельствует о том, что он имеет химическое сродство не к самим трансмиттерам, а к неким субстратам, связанным с их метаболизмом или функционированием. Кроме синаптических пузырьков реакционный продукт выявлялся в тубулярных цистернах эндоплазматического ретикулума и лизосомоподобных телах, которые присутствуют в пресинаптических бутонах мшистых волокон и участвуют в рециклировании везикул.

Гигантский синаптический бутон мшистого волокна из гиппокамповой формации in situ. Темные гранулы – ЦИО-положительные синаптические везикулы; 1 – ЦИО-негативные митохондрии. Масштаб – 0,5 мкм

Сравнительная количественная оценка везикулярного состава в расчете на 1 мкм² поперечных сечений гигантских окончаний в нормальном гиппокампе и в трансплантатах показала уменьшение числа как ЦИО-положительных, так и ЦИО-отрицательных органелл в трансплантированной ткани. Наиболее заметная разница средних величин была обнаружена при подсчете числа ЦИО-положительных гранул (101,1 ± 5,5 в норме и 83,0 ± 3,0 в нейротрансплантатах; p < 0,01). Менее значимые различия двух экспериментальных групп были выявлены при сравнении общего пула синаптических пузырьков (226,3 ± 9,0 в норме и 200,1 ± 6,1 в нейротрансплантатах; p ≤ 0,025). При этом доля ЦИО-положительных пузырьков в общей популяции синаптических везикул также была ниже в категории синапсов из трансплантатов зубчатой фасции. Если в синаптических окончаниях нормального гиппокампа она составляла 0,450 ± 0,012 (или 45 %), то в синапсах нейротрансплантатов – только 0,414 ± 0,013 (или 41,4 %); различия достоверны при p ≤ 0,05. Известно, что число везикул в терминальных бутонах наряду с другими параметрами синаптических окончаний коррелирует с функциональной активностью синапсов [13]. Проведенный нами анализ общего количества везикул свидетельствует о том, что гигантские синапсы, развивающиеся в гетеротопических трансплантатах зубчатой фасции, функционируют менее активно, чем таковые в мозге in situ. Кроме того, из полученных данных следует, что метаболиты синаптических везикул, вступающие в реакцию с ЦИО-смесью, также ответственны за интенсивность нейропередачи в этом типе синапсов.

Химическая основа окрашивания ЦИО-реагентом пока окончательно не ясна. Сначала его предлагали применять для обнаружения ацетилхолина в синаптических пузырьках нервно-мышечных синапсов [5]. Затем другие авторы обнаружили, что при определенных условиях в симпатических ганглионарных нервах он выявляет моноаминергические нейромедиаторы [7]. Рентгено-структурный анализ ЦИО-преципитата показал, что осмиевокислый цинк ассоциируется с субклеточными местами, обладающими высокой аффинностью к бивалентным ионам кальция. При этом ЦИО-смесь взаимодействует с этими локусами через сульфгидрильные группы, замещая ионы кальция в белковых макромолекулах [8]. В условиях наших экспериментов основными ЦИО-положительными субклеточными органеллами были синаптические везикулы малого размера. Из литературы известно, что в них присутствует несколько Са(2+)-связывающих белков, таких как синаптофизин, синаптотагмин, синаптобревин. Синаптотагмин 1, например, вовлекается в быстрый процесс везикулярного захвата и секвестирования ионов кальция, используя Са(2+)/Н(+) антипорт [6]. Этот белок также участвует в эндо-экзоцитозе синаптических пузырьков и в синхронизации синаптической передачи [12]. Однако следует отметить, что в нашем материале ЦИО-реакция затрагивает не все интраклеточные хранилища ионов кальция. Во-первых, продукт реакции не выявляется в главном депо кальция, синаптических митохондриях, осуществляющих основной гомеостатический контроль этих ионов в пресинаптических бутонах. Во-вторых, лишены преципитата постсинаптические отделы синаптических комплексов, содержащие кальций-связывающие белки потенциал-зависимых ионотропных каналов. Известно, что в гигантских синапсах гиппокамповой формации важные модулирующие влияния на синаптическую передачу оказывают ионы цинка, которые также локализуются в малых светлых глутаматергических везикулах [10]. Возможно, в условиях нашего эксперимента с реагентами ЦИО-смеси через сульфгидрильные группы могут взаимодействовать также бивалентные ионы цинка.

Заключение

Таким образом, данные ультраструктурного и цитохимического анализа показали, что окончания мшистых волокон гиппокамповой формации как в норме, так и после ее гетеротопической трансплантации в неокортекс, содержат гетерогенную популяцию синаптических пузырьков. При этом более 40 % малых светлых синаптических везикул реагировали с ЦИО-реагентом, остальные везикулы малого размера и крупные пузырьки с осмиофильной сердцевиной не содержали ЦИО-преципитата. Митохондрии и постсинаптические плотности также не взаимодействовали с реакционной смесью. Характер распределения ЦИО-позитивных везикул внутри синаптических бутонов был сходным в обеих экспериментальных вариантах. Вместе с тем количественный анализ везикулярного состава обнаружил между ними значительную разницу. В синаптических бутонах трансплантатов по сравнению с нормой было уменьшено не только общее количество пузырьков, но и число ЦИО-положительных органелл. Это свидетельствует о сниженной функциональной активности синапсов в трансплантатах. При сопоставлении полученных и литературных данных сделано заключение, что реагенты ЦИО-смеси взаимодействуют с локусами синаптических везикул, обладающими химическим сродством к бивалентным ионам, таким как кальций и цинк. В связи с этим можно заключить, что ЦИО-импрегнация субсинаптических органелл может быть одним из маркеров интенсивности функциональных процессов в гигантских синапсах мшистых волокон.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 12-04-00812).

Рецензенты:

Куликов А.В., д.б.н., зав. сектором, ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН», г. Пущино;

Павлик Л.Л., д.б.н., ведущий научный сотрудник, ФГБУН «Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН», г. Пущино.

Работа поступила в редакцию 30.11.2013.

Библиографическая ссылка