Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Осиков М.В. 1 Агеев Ю.И. 1 Черепанов Д.А. 1 Гизингер О.А. 1 Аклеев А.А. 2 Федосов А.А. 2

---

1 Научно-образовательный центр «Проблемы фундаментальной медицины»

2 ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России

Изменение иммунного статуса при ХПН (хронической почечной недостаточности) и, как следствие развитие сердечно-сосудистой, инфекционной патологии, заболеваний воспалительного генеза может быть связано с процессами гибели лимфоцитов путем апоптоза или некроза. Проверка гипотезы выполнена на 14 больных ХПН-пациентах отделения диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Группа контроля (n = 14) представлена клинически здоровыми людьми-добровольцами. Для изучения влияния плазмы больных ХПН на апоптоз интактных лимфоцитов в суспензию лимфоцитов здоровых людей добавляли плазму больных ХПН, после чего инкубировали в условиях термостата при 37 °С в течение 30 мин. Апоптоз лимфоцитов оценивали при окрашивании клеток аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) из набора «Annexin 5 – FITC/7-AAD kit» («Beckman Coulter», США) на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США) с дифференцировкой интактных клеток (Annexin-5-FITC–/7-AAD–), клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD–), клеток с поздними признаками апоптоза и частично некротических клеток (Annexin-5-FITC+/7-AAD+), клеток с признаками некроза (Annexin-5-FITC–/7-AAD+). Установлено, что у больных ХПН, находящихся на гемодиализной терапии, в периферической крови увеличивается количество лимфоцитов с ранними признаками апоптоза на 63 %, одновременно поздними признаками апоптоза и признаками некроза – на 640 %, признаками некроза – на 383 % и, как следствие, снижается количество интактных лимфоцитов на 15 % при сравнении с группой здоровых людей. Факторами активации гибели лимфоцитов выступают вещества, находящиеся в плазме крови, т.к. добавление плазмы крови больных ХПН к лимфоцитам здоровых людей приводит к увеличению количества клеток с одновременно поздними признаками апоптоза и признаками некроза и клеток с признаками некроза.

Статья в формате PDF

281 KB

лимфоциты

апоптоз

хроническая почечная недостаточность

1. Осиков М.В. Влияние гемодиализа на процессы свободно-радикального окисления у больных хронической почечной недостаточностью / М.В. Осиков, В.Ю. Ахматов, Л.В. Кривохижина // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. – 2007. – № 16 (71). – С. 95–97.

2. Осиков М.В. Гемостазиологические эффекты альфа-1-кислого гликопротеина при экспериментальном септическом перитоните / М.В. Осиков, Е.В. Макаров, Л.В. Кривохижина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 8. – С. 143–145.

3. Осиков М.В. Влияние альфа-1-кислого гликопротеина на процессы свободнорадикального окисления при экспериментальной печеночной недостаточности // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 7. – С. 29–31.

4. Осиков М.В. Роль орозомукоида в регуляции активности систем плазменного протеолиза при экспериментальной почечной недостаточности / М.В. Осиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 148, № 7. – С. 27–30.

5. Осиков М.В. Анализ гематологических эффектов эритропоэтина у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на диализе / М.В. Осиков, К.В. Ахматов, Л.В. Кривохижина, В.Ю. Ахматов // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. – 2009. – № 20 (153). – С. 79–82.

6. Осиков М.В. Роль эритропоэтина в коррекции нарушений сосудисто-тромбоцитарного гемостаза у больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев // Фундаментальные исследования. – 2011. – № 9–3. – С. 462–466.

7. Осиков М.В. Эфферентные и антиоксидантные свойства эритропоэтина при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, Ю.И. Агеев // Эфферентная терапия. – 2011. – Т. 17, № 4. – С. 7–13.

8. Осиков М.В. Влияние эритропоэтина на функциональную активность тромбоцитов / М.В. Осиков, Т.А. Григорьев, А.А. Федосов, Козочкин Д.А., Ильиных М.А. // Современные проблемы науки и образования. – 2012. – № 6. – С. 195–195.

9. Осиков М.В. Уровень эритропоэтина и иммунный статус организма у больных хронической почечной недостаточностью, находящихся на гемодиализе / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 4. – С. 158.

10. Осиков М.В. Патофизиологические аспекты изменения и коррекции врожденного иммунитета при хронической почечной недостаточности / М.В. Осиков, Л.Ф. Телешева, Ю.И. Агеев, Д.А. Черепанов, А.А. Федосов // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – № 5. – С. 274.

11. Betjes, M.G. Immune cell dysfunction and inflammation in end-stage renal disease / M.G. Betjes // Nat. Rev. Nephrol. – 2013. – Vol. 5. – Р. 255–265.

12. Eleftheriadis, T. Plasma indoleamine 2,3-dioxygenase and arginase type I may contribute to decreased blood T-cell count in hemodialysis patients / T. Eleftheriadis, E. Yiannaki, G. Antoniadi et al. // Ren. Fail. – 2012. – Vol. 34(9). – P. 1118–1122.

13. Kim, K.W. B cell-associated immune profiles in patients with end-stage renal disease (ESRD) / K.W. Kim, B.H. Chung, E.J. Jeon et al. // Exp. Mol. Med. – 2012. – Vol. 44(8). – Р. 465–472.

14. Meijers R.W. Uremia causes premature ageing of the T cell compartment in end-stage renal disease patients / R.W. Meijers, N.H. Litjens, E.A. de Wit et al. // Immun Ageing. – 2012. – Vol. 9(1). – Р. 19.

15. Vaziri, N.D. Effect of uremia on structure and function of immune system / N.D. Vaziri, M.V. Pahl, A. Crum, K. Norris // J. Ren. Nutr. – 2012. – Vol. 1. – Р. 149–156.

Хроническая почечная недостаточность (ХПН) – клинико-лабораторный синдром, вызванный необратимой гибелью нефронов и проявляющийся прогредиентным поражением различных органов и систем, в том числе кроветворения и иммуногенеза. Ранее нами продемонстрированы изменения у больных ХПН в системе гемостаза, функционального состояния вегетативного и соматического отделов нервной системы, иммунного статуса, процессов свободно-радикального окисления [1–10]. Следует учитывать, что развитие сердечно-сосудистой, инфекционной патологии, заболеваний воспалительного генеза у данной категории больных связано с дисфункцией иммунной системы в связи с изменением количественного состава, функциональной активности и кооперации между полиморфно-ядерными лейкоцитами, моноцитами/макрофагами, другими антигенпрезентирующими клетками и лимфоцитами [11]. В частности, депрессия адаптивного звена иммунитета является ведущим механизмом развития инфекционной патологии, а активация врожденного звена иммунитета и связанная с ней манифестация локального и системного воспаления способствует развитию и прогрессированию сердечно-сосудистых заболеваний. Одним из механизмов дисфункции иммунного ответа может выступать изменение апоптоза иммунокомпетентных клеток, что, с одной стороны, может способствовать элиминации активированных фагоцитов, с другой – приводить к прогрессированию иммунной недостаточности, т.е. дисбаланс между про- и антиапоптогенными механизмами может занимать ключевую позицию в патогенезе осложнений при ХПН. Цель работы – исследовать влияние плазмы крови больных ХПН на выраженность апоптоза лимфоцитов.

Материалы и методы исследования

Для реализации поставленной цели использована кровь больных людей с ХПН-пациентов отделения диализа ГБУЗ «Челябинская областная клиническая больница». Первоначально обследовано 150 больных с терминальной стадией ХПН в возрасте от 21 до 60 лет, получающих гемодиализную терапию на аппаратах «Искусственная почка» 4008S/BIBAG фирмы Fresenius (Германия) 3 раза в неделю в течение 4 часов. Критерии исключения:

1) больные после трансплантации почки;

2) наличие на момент исследования гнойно-септических осложнений;

3) наличие у больных увеличенных лимфатических узлов любой локализации;

4) больные, принимающие глюкокортикостероидную и/или цитостатическую терапию;

5) злокачественные и доброкачественные опухоли любой локализации;

6) ВИЧ-инфекция, гепатит С, гепатит В;

7) аутоиммунные и/или аллергические заболевания. После рандомизации в исследование включено 14 больных.

Кровь для исследований у больных забиралась из артериального колена артериовенозной фистулы до процедуры гемодиализа. Группа контроля (n = 14) представлена клинически здоровыми людьми-добровольцами, не имеющими соматической патологии и сопоставимыми по возрасту и полу с основной группой. Для изучения влияния плазмы больных ХПН на апоптоз интактных лимфоцитов проведен эксперимент в условиях in vitro. В суспензию лимфоцитов здоровых людей добавляли аутологичную плазму (контроль) или плазму больных ХПН (опыт), после чего инкубировали в условиях термостата при 37 °С в течение 30 мин. Лимфоциты из периферической крови выделяли на двойном градиенте плотности фиколла и урографина, концентрацию лимфоцитов в суспензии доводили до 3·106/л. Апоптоз лимфоцитов оценивали при окрашивании конъюгированным с флюорохромом аннексином V (Annexin-5-FITC) и 7-аминоактиномицином D (7-AAD) из набора «Annexin 5 – FITC/7-AAD kit» («Beckman Coulter», США) на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman Coulter», США) с дифференцировкой интактных клеток (Annexin-5-FITC–/7-AAD–), клеток с ранними признаками апоптоза (Annexin-5-FITC+/7-AAD–), клеток с поздними признаками апоптоза и частично некротических клеток (Annexin-5-FITC+/7-AAD +), клеток с признаками некроза (Annexin-5-FITC–/7-AAD +). Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 8.0. Проверку статистических гипотез проводили с использованием критериев Манна‒Уитни, Вальда-Вольфовитца, Вилкоксона.

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что у больных ХПН в периферической крови снижается количество лимфоцитов без признаков некроза и апоптоза (Annexin-5-FITC–/7-AAD–) за счет увеличения количества клеток, несущих признаки раннего апоптоза, позднего апоптоза и некроза (табл. 1). Наблюдается увеличение количества лимфоцитов, экстернализирующих на наружной поверхности мембраны фосфатидилсерин (Annexin-5-FITC+/7-AAD–), на 63 %, экстернализирующих фосфатидилсерин и одновременно проницаемых для катионного красителя (Annexin-5-FITC+/7-AAD+) – на 640 %, только проницаемых для катионного красителя (Annexin-5-FITC–/7-AAD+) – на 383 %. Таким образом, гибель лимфоцитов при ХПН обусловлена процессами апоптоза и некроза клеток. Ранее нами было показано, что у больных с терминальной стадией ХПН снижается количество Т-лимфоцитов и их субпопуляций, В-лимфоцитов, NK-клеток в периферической крови [9]. Снижение количества лимфоцитов в крови приводит к дефициту клеточного и гуморального адаптивного иммунитета, дефектам презентации антигенов иммунокомпетентным клеткам и, как следствие, росту заболеваемости и неблагоприятным исходам различной инфекционной патологии при ХПН.

Другими исследователями показано, что неоднозначные результаты при оценке апоптоза лимфоцитов у больных ХПН связаны с видом заместительной терапии (гемодиализ или перитонеальный диализ), биосовместимостью мембраны диализатора, скоростью потока диализной жидкости и др. факторами. Установлено, что наличие маркеров апоптоза в Т-лимфоцитах (аннексин V, CD95+, фрагментация ДНК) коррелирует с признаками их ранней активации (CD69 +) и усиливается процедурой гемодиализа. С использованием метода измерения длины теломер у больных ХПН установлено преждевременное старение CD8 + Т-лимфоцитов [14]. В-лимфопения у больных терминальной ХПН может быть связана с гибелью клеток путем апоптоза в связи с пониженной экспрессией Bcl-2, повышенной экспрессией длинной изоформы BLNK (B cell LiNKer protein), которая подавляет активацию митоген-активируемой протеинкиназы р38, JNK, повышает экспрессию с-Fos и активирует BCR-индуцированный апоптоз В-лимфоцитов. При использовании метода ПЦР в реальном времени показано, что у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, а также в преддиализной группе по сравнению со здоровыми людьми значительно повышен уровень мРНК длинной изоформы BLNK [13].

Таблица 1

Показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови у больных ХПН (M ± m)

Примечание. * – статистически значимые (p < 0,05) различия с группой здоровых людей.

Таблица 2

Влияние плазмы больных ХПН на показатели апоптоза лимфоцитов периферической крови здоровых людей (M ± m)

Примечание. * – статистически значимые (p < 0,05) различия с группой 1.

На следующем этапе работы нами исследовано влияние уремической плазмы на апоптоз интактных лимфоцитов. Предпосылками для проведения эксперимента явились данные о том, что факторами преждевременной гибели Т- и В-лимфоцитов, дендритных клеток при ХПН выступают азотемия, избыток в крови продуктов пероксидации липидов, паратиреоидного гормона, железа и окисленных липопротеинов низкой плотности [15]. Одним из механизмов Т-лимфоцитопении выступает повышение концентрации в плазме крови у больных ХПН, находящихся на гемодиализе, индоламина-2,3-диоксигеназы (IDO) и аргиназы I типа (ARG), участвующих в катаболизме соответственно триптофана и аргинина. Установлены проапоптотическое и антипролиферативное действие IDO и ARG на Т-клетки, их концентрация в крови обратно пропорциональна абсолютному количеству Т-лимфоцитов у диализных больных [12]. Кроме того, IDO рассматривают как фермент с иммуномодулирующими свойствами, возможно, участвующий в регуляции выраженности воспалительного процесса, прогрессировании атеросклероза и ИБС при ХПН, уровень IDO в плазме отрицательно коррелирует с концентрацией ИЛ-6 и СРБ.

Нами установлено, что инкубация уремической плазмы с интактными лимфоцитами приводит к увеличению количества лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране маркеры одновременно позднего апоптоза и некроза (Annexin-5-FITC+/7-AAD+), а также маркеры некроза (Annexin-5-FITC–/7-AAD+) (табл. 2). Количество клеток с признаками раннего апоптоза, а также количество интактных лимфоцитов значимо не изменилось. По данным других исследователей, инкубация изолированных от здоровых доноров лимфоцитов с уремической плазмой приводила к снижению количества жизнеспособных и функционально активных клеток, что связывают с эффектами окисленными липопротеинами низкой плотности (OxLDL). В условиях in vitro OxLDL дозо-зависимо активируют апоптоз и снижают количество Tregs в связи с повышением уровня в клетках р27Kip1, ингибитора циклин-зависимой киназы, блокирующих клеточный цикл в фазе G1. Кроме того, OxLDL активируют Fas-опосредованный апоптоз CD4 + Т-лимфоцитов в связи со снижением экспрессии рецептора к ИЛ-2.

Таким образом, у больных ХПН, находящихся на гемодиализной терапии, в периферической крови увеличивается количество лимфоцитов с ранними и поздними признаками апоптоза, признаками некроза и, как следствие, снижается количество интактных лимфоцитов. Факторами активации гибели лимфоцитов выступают вещества, находящиеся в плазме крови, т.к. добавление плазмы крови больных ХПН к лимфоцитам здоровых людей приводит к увеличению количества клеток с признаками некроза и апоптоза.

Рецензенты:

Куренков Е.Л., д.м.н., профессор, заведующий кафедрой анатомии человека, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск;

Абрамовских О.С., д.м.н., профессор кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, клинической лабораторной диагностики, ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Челябинск.

Работа поступила в редакцию 04.02.2014.

Библиографическая ссылка