Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ – МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ДЕРИВАТОВ МЕТАБОЛИТОВ ЗОЛПИДЕМА И ПРОДУКТА ЕГО ГИДРОЛИЗА

Крылова Е.А. 1 Катаев С.С. 1 Хомов Ю.А. 2
1 ГКУЗОТ «Пермское краевое бюро судебно-медицинской экспертизы»
2 ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Получены и представлены аналитические данные по идентификации различных дериватов метаболитов золпидема и продукта его гидролиза методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии с ионизацией электронным ударом (GC-MS-EI). Предложенная методика предполагает малый расход биологического объекта (2 мл мочи), проведение ферментативного гидролиза для разрушения конъюгатов метаболитов золпидема, применение для изолирования аналитов твердофазной экстракции (ТФЭ), которая выполняется на обращённо-фазном сорбенте со свойствами сильного катионита. Для дериватизации использовались различные реакции: ацилирования, алкилирования, получения триметилсилильных эфиров, – это позволило получить летучие, термостабильные дериваты метаболитов золпидема и продукта его гидролиза, обладающих специфической масс-фрагментацией. Примененные аналитические подходы позволили описать газохроматографические и масс-спектральные характеристики различных дериватов метаболитов золпидема и продукта его гидролиза, что дает возможность с высокой чувствительностью проводить их идентификацию в моче при выполнении химико-токсикологических и судебно-химических исследований.
метаболиты золпидема
продукт гидролиза золпидема
твердофазная экстракция
дериватизация
газовая хроматография – масс-спектрометрия
1. Большой справочник лекарственных средств / под. ред. Л.Е. Зиганшиной, В.К. Лепахина, В.И. Петрова, Р.У. Хабриева. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. – С. 988–989.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. – 16-е изд., перераб., испр. и доп. – М.: Новая волна: Издатель Умеренков, 2010. – С. 32.
3. Hariri B. L’influence du processus de putrifaction sur l’identification du zolpidem dans les bio-liquids / B. Hariri, E.A. Krylova, Y.A. Khomov // Инновационные процессы в исследовательской и образовательной деятельности: I Международн. науч. конф.: тез. докл. – Пермь, 2012. – С. 106–107.
4. Hempel G. Direct determination of zolpidem and its main metabolites in urine using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection / G. Hempel, G. Blaschke // Journal of Chromatography B. – 1996. – Vol. 675, № 1. – P. 131–137.
5. Lewis J.H. A simple and rapid method for the identification of zolpidem carboxylic acid in urine / J.H. Lewis, J.H. Vine // Journal of Analitical Toxocology. – 2007. – Vol. 31, № 4. – P. 195–199.
6. Thermospray liquid chromatography tandem mass spectrometry: application to the elucidation of zolpidem metabolism / S. Vajta [et al.] // Biomedical and Environmental Mass Spectrometry. – 1988. – Vol. 15(4). – P. 223–228.

Золпидем – это небензодиазепиновый снотворный препарат, химическое название –N,N,6-триметил-2-(4-метилфенил)имидазо[1,2-а]пиридин-3-ацетамид. Золпидем быстро всасывается в тонком кишечнике, имеет короткий период полувыведения (0,7–3,5 ч) [2], метаболизируется до фармакологически неактивных метаболитов и экскретируется в неизменном виде менее чем на 1 % [1, 4]. Поэтому очевидна необходимость определения именно метаболитов для эффективного выявления факта приема золпидема при проведении химико-токсикологического анализа (ХТА).

Золпидем в своей структуре содержит амидную связь, которая способна гидролизоваться с образованием продукта гидролиза золпидема. Обнаружение этого продукта может иметь большое значение при анализе длительно хранившейся мочи, когда за счет разложения мочевины происходит увеличение pH образца и, как следствие – гидролиз золпидема, что приводит к значительному снижению концентрации нативного вещества [3], которое и так выводится в следовых количествах.

Сведения по анализу метаболитов золпидема в мировой научной литературе единичны и представляют собой разрозненные и несистематизированные материалы. Метаболиты золпидема и продукт его гидролиза содержат в своей структуре полярные функциональные группы (–OH и –COOH), придающие аналитам свойства труднолетучих в условиях газовой хроматографии (ГХ) веществ (табл. 1).

Таблица 1

Метаболиты золпидема, продукт его гидролиза и их некоторые физико-химические характеристики

Структурная формула

Название

pKa

(-COOH)

LogP (цвиттер-ион)

pic_86.wmf

Продукт гидролиза золпидема (ЗГ)

6,46 ± 0,70

(3,85 ± 0,10)

2,82 ± 0,61

(0,32 ± 1,0)

pic_87.wmf

4’-(карбокси)-золпидем (4’-КЗ)

5,02 ± 0,70

(3,23 ± 0,10)

1,46 ± 0,64

(1,01 ± 1,0)

pic_88.wmf

4’-(гидроксиметил)-золпидем (4’-ГМЗ)

4,96 ± 0,70

0,71 ± 0,64

pic_89.wmf

6-(гидроксиметил)-золпидем (6-ГМЗ)

5,15 ± 0,70

1,15 ± 0,64

pic_90.wmf

6-(карбокси)-золпидем (6-КЗ)

5,62 ± 0,50

(2,30 ± 0,20)

1,54 ± 0,65

(‒0,96 ± 1,0)

Поэтому для их исследования требуется получение летучих дериватов. В литературе описаны данные только о масс-фрагментации этильного деривата главного метаболита золпидема (4’-КЗ) [5], а также триметилсилильных производных 4’-ГМЗ, 6-ГМЗ, 4’-КЗ и 6-КЗ [6]. Данных о масс-спектрах различных производных продукта гидролиза золпидема в литературе не представлено.

Целью настоящей работы явилось изучение газохроматографических и масс-спектральных характеристик различных производных метаболитов золпидема и продукта его гидролиза после дериватизации с применением алкилирования метилйодидом, этанолом, изопропилйодидом, пентафторпропанолом, ацетилирования, получения триметилсилильных эфиров.

Материалы и методы исследования

Золпидема тартрат (порошок-субстанция, Испания, НД 42-13447-05); β-глюкуронидаза (Type HP-2, From Helix Pomatia, 101400 ЕД/мл, Sigma-ALDRICH Inc.); 2,2,3,3,3-пентафторпропанол и 2,2,3,3,3-пентафторпропионовый ангидрид («ICN Biomedicals», США); бис-триметилсилил-трифторацетамид (BSTFA), содержащий 1 % триметилхлорсилана (Sigma Chemical, Co; Sigma-ALDRICH CHEMI, Germany); метилйодид (Вектон, Шосткинский завод химреактивов), изопропилйодид (Вектон, Шосткинский завод химреактивов). Все используемые прочие растворители и реактивы имели чистоту х.ч. Применялись картриджи для ТФЭ AccuBond II EVIDEX и SampliQ Evidex – 200 мг – 3 мл (Agilent, США). Оборудование: газовый хроматограф Agilent 6850, оснащенный капиллярной кварцевой колонкой НР-5MS длиной 30 м с внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм. Масс-селективный детектор Agilent 5973N (Agilent, США). Для твердофазной экстракции применяли: систему с вакуумной камерой (манифолд) на 12 позиций (Supelico), насос низкого вакуума (AIR CADET, США). Для выполнения реакции гидролиза и процедур дериватизации использовались термоблок ПЭ-4030 (ОАО «Экрос», Россия) и микроволновая печь Rolsen MS 1770 SA (Россия). При выполнении работы также применялись: микровстряхиватель ПЭ-2 (ОАО «Экрос», Россия), полуавтоматические пипетки-дозаторы, позволяющие отбирать объемы жидкостей 4–40, 40–200, 200–1000 мкл и 1–5 мл. Исследовали образцы мочи испытуемых лиц, полученные после перорального приема однократной терапевтической дозы золпидема тартрата (10 мг). Параллельно анализировали контрольные образцы мочи, собранные у тех же лиц до приема золпидема тартрата. Полученные образцы мочи хранились при –20 °С, перед исследованиями мочу согревали до комнатной температуры.

Пробоподготовка образцов мочи: к 2 мл мочи прибавляют 0,5 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 6,0, 0,1 мл β-глюкуронидазы (10140 ЕД), перемешивают, герметично укупоривают и экспонируют в течение 2 часов при 45 °С. Полученный гидролизат центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 минут. Центрифугат отделяют от осадка, прибавляют 2,5 мл 1/15 М фосфатного буфера (pH 5,4) и подвергают ТФЭ по схеме: кондиционирование сорбента осуществляют последовательным промыванием 2 мл 95 % этанола и 2 мл 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4. Загрузку анализируемого образца мочи осуществляют со скоростью 1,0 мл/мин, после чего промывают сорбент последовательным пропусканием через него растворов объемами по 1 мл: 1/15 М фосфатного буфера рН 5,4; 0,1 М раствора уксусной кислоты и 3 мл 50 % раствора метанола в воде. Элюирование осуществляют в отдельный флакон со скоростью 1,0 мл/мин смесью дихлорметан–2-пропанол–25 % раствор аммиака (2:1:0,1) дважды порциями по 2 мл. Элюат испаряют досуха в токе азота при 60 °С.

Дериватизация метаболитов золпидема и продукта его гидролиза

Алкилирование метилйодидом (метилирование). К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 20–25 мг прокаленного калия карбоната, 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл йодистого метила и выдерживали в термоблоке в течение 45 минут при 60 °С. После охлаждения виалы вскрывали, 200 мкл ацетонового раствора испаряли досуха в токе азота при 60 °С.

Алкилирование изопропилйодидом. К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 20–25 мг прокаленного калия карбоната, 500 мкл безводного ацетона, 40 мкл изопропилйодида и выдерживали в термоблоке в течение 45 минут при 60 °С. После охлаждения виалы вскрывали, 200 мкл ацетонового раствора испаряли досуха в токе азота при 60 °С.

Алкилирование пентафторпропанолом. К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 25 мкл 2,2,3,3,3-пентафторпропанола и 75 мкл 2,2,3,3,3-пентафторпропионового ангидрида и далее реакционную смесь подвергали СВЧ-излучению мощностью 560 Вт в течение 5 мин. После охлаждения реагенты испаряли досуха в токе азота при 60 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл безводного этилацетата.

Ацетилирование. К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 40 мкл безводного пиридина и 60 мкл уксусного ангидрида; реакционную смесь подвергали СВЧ-излучению мощностью 560 Вт в течение 5 мин. После охлаждения реагенты испаряли досуха в токе азота при 60 °С. Сухой остаток растворяли в 200 мкл безводного этилацетата.

Силилирование. К сухому остатку в реакционной виале прибавляли 100 мкл бис-триметилсилил-трифторацетамида (БСТФА), содержащего 1 % триметилхлорсилана, герметично укупоривали и помещали в термоблок на 30 минут при 80 °С. После охлаждения виалы вскрывали и 1 мкл исследуемого раствора вводили в хромато-масс-спектрометр с использованием устройства для автоматического ввода проб.

Алкилирование этанолом проводили действием пентафторпропионового ангидрида при добавлении к образцу этанола; процедуру дериватизации осуществляли под действием СВЧ-излучения мощностью 560 Вт в течение 4 минут.

Газохроматографические и масс-спектральные условия: Режим работы ГХ/МС для проб в условиях скрининга: температура инжектора и интерфейса 250 и 280 °С, температура колонки: начальная 70 °С в течение 2 мин и прогрев до 280 °С со скоростью программирования 20 град/мин; выдержка при температуре 280 °С в течение 12 минут, затем прогрев до 300 °С со скоростью программирования 20 град/мин; выдержка при конечной температуре 5 мин. Ввод без деления потока газа-носителя. Регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования масс 45–450 а.е.

Результаты исследования и их обсуждение

Этап дериватизации сухих остатков после проведения ТФЭ из мочи необходим для дальнейшего определения методом ГХ полученных летучих производных метаболитов золпидема и продукта его гидролиза. Для определения гидроксиметаболитов золпидема возможно проведение ацетилирования, для карбоксиметаболитов и продукта гидролиза – алкилирования. Для всех метаболитов золпидема и продукта его гидролиза возможно получение их триметилсилильных эфиров.

В результате проведенных исследований стало возможным обнаружение метаболитов золпидема и продукта его гидролиза по полученным их газохроматографическим и масс-спектральным характеристикам, которые представлены в табл. 2.

Таблица 2

Газохроматографические и масс-спектральные характеристики производных метаболитов золпидема и продукта его гидролиза 

Метаболит

Производное

tR , мин

Характеристические ионы, m/z (интенсивность, %)

4'-ГМЗ

СН3С(О)-

20,60

293 (100); 233 (53); 294 (19,7); 365 (17,8); 271 (19,7);
 234 (13,1); 219 (12,2)

(СН3)3Si-

19,46

323 (100); 324 (27,3); 73 (19,3); 233 (17,6); 395 (15,5); 234 (8,3); 249 (8); 154 (6,1); 293 (5,7); 396 (5,7); 219 (4,9);
92 (4,7); 380 (3,8)

6-ГМЗ

СН3С(О)-

19,41

293 (100); 294 (15,9); 365 (9,4); 234 (7,5); 72 (5,5); 233 (5,4); 251 (5,1); 249 (4,5); 219 (3,9)

(СН3)3Si-

18,39

323 (100); 324 (27,1); 73 (10,8); 395 (9,4); 325 (7); 234 (5,9); 219 (5,2); 233 (4,9); 72 (3,1); 218 (3,1); 396 (2,8)

4'-КЗ

СН3-

20,00

279 (100); 219 (29,1); 280 (21,5); 220 (15); 351 (13,1); 92 (4,7); 72 (4,1); 65 (4,1)

СF3CF2СН2-

17,28

397 (100); 219 (23,3); 398 (22); 220 (12,5); 469 (9,4);
72 (3,8); 92 (3,3)

(СН3)3Si-

22,08

337 (100); 338 (26,7); 73 (24); 219 (17); 220 (14,3); 409 (13); 161 (11,6); 221 (8,4); 339 (7,8); 394 (7,8); 110 (7,7); 124 (7,4)

6-КЗ

СН3-

18,97

279 (100); 280 (20,3); 351 (11,1); 219 (6,4); 263 (4,5); 264 (3,9); 72 (3,5); 277 (3,2); 220 (2,9)

СF3CF2СН2-

16,52

397 (100); 398 (21,2); 469 (9,6); 219 (6,3); 72 (5,4); 381 (4,6); 220 (4,5); 205 (2,7)

(СН3)3Si-

19,96

337 (100); 338 (26,5); 409 (8,7); 339 (7,1); 219 (6,4); 220 (6,1); 72 (5,6); 73 (5,5); 205 (3,2); 394 (3,1); 321 (2,8);
322 (2,8); 278 (2,5)

ЗГ

СН3-

8,62

235(100), 294(24), 219(12)

СН3СН2-

13,96

235(100), 308(27), 219(11)

(СН3)2СН2-

13,93

235(100), 322(19), 219(9)

СF3CF2СН2-

12,80

235(100), 412(25), 219(9)

(СН3)3Si-

13,76

235(100), 352(16), 219(10)

При интерпретации масс-спектров полученных производных была выявлена закономерность, характерная для производных основных метаболитов золпидема, заключающаяся в том, что при их масс-фрагментации образуются соответствующие молекулярные ион-радикалы и фрагментные ионы [M-72]+, имеющие выраженные пики на хроматограммах (рисунок).

Применение того или иного вида дериватизации в каждой отдельно взятой химико-токсикологической или судебно-химической лаборатории зависит от ее технического и материального оснащения, сложившихся традиционных предпочтений и имеющихся в наличии масс-спектральных библиотек. Но необходимо отметить, что получение ТМС-производных удобно на практике, т.к. силилирование позволяет одновременно в одной пробе получить триметилсилильные эфиры гидрокси- и карбоксиметаболитов золпидема, а также продукта его гидролиза.

Заключение

Применение различных способов дериватизации в сочетании с ТФЭ для последующего ГХ/МС анализа позволяет выявить при совместном присутствии золпидем, его метаболиты, а также продукт гидролиза, которые значительно различаются по физико-химическим свойствам. Без дериватизации продукт гидролиза золпидема и ни один из его метаболитов не обнаруживается. Методики могут быть использованы на практике врачами клинической лабораторной диагностики химико-токсикологических лабораторий и врачами судебно-медицинскими экспертами бюро судебно-медицинской экспертизы.

pic_91.wmf

Схема образования и стабилизации иона [M-72]+ из молекулярного ион-радикала золпидема и производных его основных метаболитов (4’-ГМЗ, 6-ГМЗ, 4’-КЗ, 6-КЗ)

Рецензенты:

Михалев А.И., д.фарм.н., профессор, зав. кафедрой биологической химии, ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь;

Гейн В.Л., д.х.н., профессор, зав. кафедрой общей и органической химии, ГБОУ ВПО ПГФА Минздрава России, г. Пермь.

Работа поступила в редакцию 26.03.2014.


Библиографическая ссылка

Крылова Е.А., Катаев С.С., Хомов Ю.А. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ – МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ ДЕРИВАТОВ МЕТАБОЛИТОВ ЗОЛПИДЕМА И ПРОДУКТА ЕГО ГИДРОЛИЗА // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 5-5. – С. 1044-1048;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=34042 (дата обращения: 05.07.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074