Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ СУБСТАНЦИИ АДЕМЕТИОНИНА, ЕЕ АНАЛИЗ

Морозов А.В. 1 Кодониди И.П. 1
1 Пятигорский медико-фармацевтический институт-филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России
Разработан биосинтетический способ получения адеметионина. Суть метода заключается в накоплении адеметионина в клетках дрожжей в метионинсодержащей среде. Дрожжи промывают дважды избытком холодной воды, а затем лизируют в течение 2 часов путем добавления этилацетата в качестве селективного экстрагента, а также 0,15 М кислоты серной. После лизиса раствор, cодержащий адеметионин, отделяют от остатков дрожжей с помощью центрифугирования. Очистку полученного лизата проводят добавлением к лизату 10 % раствора пикролоновой кислоты. Образующийся пикролонат адеметионина отстаивают в течение 12 часов, после чего промывают дважды избытком холодной воды и высушивают. На заключительной стадии пикролонат адеметионина разрушают серной кислотой, п-толуолсульфокислотой в присутствии органического растворителя, не смешивающегося с водой – н-бутанола. Полученную смесь отстаивают в течение 20 минут, далее удаляют органический растворитель, а к водной фазе добавляют небольшое количество н-бутанола для удаления остатков пикролоновой кислоты. Получают водный раствор адеметионина, который осаждают этанолом. Полученную соль высушивают и добавляют к ней лактозу в соотношении 1:1.
адеметионин
двойная соль
биосинтез
1. Регистр лекарственных средств России РЛС-Энциклопедия лекарств. – 19-й вып. / под. ред. Г.Л. Вышковского. – М.: «РЛС-МЕДИА», 2010.– С. 80.
2. Aminosugar, glycosaminoglycan, and S-adenosylmethionine composition for the treatment and repair of connective tissue [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.google.ru/patents/US6271213.
3. Composition and use of ademetionine against ageing of the skin [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.google.com/patents/US4956173.
4. Stable salts of S-adenosylmethionine [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.google.ru/patents/US6276578.
5. Sulphonic acid salts of S-adenosilmethionine [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.google.com/patents/US4057686.

В настоящее время адеметионин (S-аденозил-L-метионин) является одним из эффективных гепатопротекторов. Он участвует в реакциях трансметилирования, является биосинтетическим предшественником цистеина, таурина, глутатиона. Наряду с высокой гепатопротективной активностью адеметионин оказывает противовоспалительное, обезболивающее, антидепрессивное действие [1].

В настоящее время субстанция адеметионина в РФ не производится.

Нами поставлена цель изучить существующие способы и разработать наиболее доступный способ получения стабильной субстанции адеметионина.

Из литературных данных известно, что наиболее успешным является биосинтетический способ получения адеметионина. Сущность метода заключается в накоплении адеметионина в дрожжевых клетках в питательной среде, обогащенной метионином, лизисе дрожжевых клеток и выделении адеметионина из лизата в виде стабильной соли.

Ранее нами была получена соль адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой. Главным недостатком полученной соли является то, что она гигроскопична, что снижает срок хранения соли [2].

Было найдено, что добавление к двойной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой лактозы в соотношении 1:1 приводит к уменьшению влажности полученной соли, а следовательно, повышает срок хранения.

Нами получена субстанция соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой с добавлением лактозы в соотношении 1:1 следующим образом.

В качестве продуцента адеметионина мы использовали сухие дрожжи рода Saccharomyces сerevisiae, а в качестве питательной среды была выбрана среда Шленка [3].

Дрожжи культивировали в течение 24–30 часов при постоянном перемешивании и аэрации при температуре 30 °С. Затем проводили лизис дрожжей, содержащих адеметионин, с помощью органического растворителя и разбавленной кислоты серной. Полученный лизат отделяли от остатков дрожжей при помощи центрифугирования.

На следующей стадии осуществляли очистку лизата. Для этого адеметионин из лизата осаждали 5 % водным раствором пикролоновой кислоты. Полученный осадок отстаивали, отфильтровывали и высушивали [4, 5].

На заключительной стадии получали стабильную двойную соль адеметионина с серной толуолсульфокислотой.

К высушенному осадку пикролоната адеметионина добавляли при энергичном встряхивании растворы 0,1 моль/л серной и толуолсульфокислоты, органический растворитель – н-бутанол. Отстаивали в течение 20 минут, органический слой удаляли, водный слой промывали н-бутанолом, до удаления следов пикролоновой кислоты. Затем к водному слою добавляли обесцвечивающий уголь, затем фильтровали.

К полученному бесцветному водному раствору добавляли этанол. Образующийся осадок отделяли декантацией, высушивали при температуре 0–5 °С.

Полученная таким образом соль адеметионина представляет собой гигроскопичный порошок, очень легко растворимый в воде, практически нерастворимый в этаноле, ацетоне и других органических растворителях.

Для уменьшения гигроскопичности к полученной соли добавляли лактозу в соотношении 1:1, высушивали в эксикаторе в течение 24 часов.

Для полученной субстанции соли нами были разработаны методики качественного и количественного анализа.

Для качественного анализа двойной соли адеметионина использовали известные химические реакции, а также УФ-спектроскопию.

УФ-спектроскопию использовали для идентификации полученной соли.

Приготовление раствора испытуемого образца. Точную массу соли (0,1 г, что эквивалентно 0,02 г адеметионин-иона) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл воды, растворяли, и доводили тем же растворителем до метки. Аликвоту в количестве 5 мл переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили водой до метки. Регистрировали спектр поглощения в области от 200 до 300 нм.

Приготовление раствора стандартного образца. Из точной массы СО адеметионина сульфата п-толуолсульфоната (0,12 г, что эквивалентно 0,025 г адеметионин-иона) получали раствор по методике, приведенной выше. Раствор сравнения – вода (рис. 1).

pic_92.tif

Рис. 1. Спектр поглощения: 1 – водного РСО адеметионина п-толуолсульфоната дисульфата 0,006 %; 2 – водного раствора соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой 0,005 %

Как видно из рис. 1, в спектре поглощения раствора испытуемого образца имеется 2 максимума при длинах волн 231 нм (п-толуолсульфокислота) и 256 нм (адеметионин), которые полностью совпадают и имеют одинаковые максимумы со спектром раствора стандартного образца.

С целью идентификации компонентов соли проводили гидролиз, для этого к водному раствору полученной соли адеметионина добавляли водный раствор натрия гидроксида 1М до значения рН среды 5,0, полученный раствор нагревали в течение 30 минут, после чего охлаждали и определяли наличие остатка метионина, тио-группы, а также сульфат-иона по следующим методикам:

К 2 мл гидролизата добавляли 1 мл водного раствора натрия гидроксида 1М и 0,5 мл свежеприготовленного водного раствора нитропруссида натрия 5 %, после кипячения на водяной бане в течение 10 минут появлялось красно-фиолетовое окрашивание (тио-группа).

К 2 мл гидролизата добавляли водный раствор натрия гидрокарбоната 5 % до значения рН среды 6,5–7,0, затем добавляли 1 мл водного раствора нингидрина 10 %, кипятили в течение 5 минут при температуре около 100 °С – появлялось фиолетовое окрашивание (первичная алифатическая аминогруппа).

К 2 мл полученного гидролизата добавляли 0,5 мл водного раствора бария хлорида 5 %, образовывался белый кристаллический осадок, нерастворимый в разведенных минеральных кислотах (сульфат-ион).

Для количественного определения компонентов соли нами разработана спектрофотометрическая методика анализа.

На первом этапе исследований нами были приготовлены водные растворы СО адеметионина сульфата и СО п-толуолсульфокислоты с целью определения возможности использования непосредственного спектрофотометрического метода.

На рис. 2 представлены спектры поглощения полученных растворов.

pic_93.tif

Рис. 2. Спектры поглощения: 1 – водного раствора СО адеметионина сульфата – 0,003 %; 2 – водного раствора СО п-толуолсульфокислоты – 0,002 %

Как следует из рис. 2, полосы поглощения веществ перекрываются и делают невозможным непосредственное спектрофотометрическое определение адеметионина и п-толуолсульфокислоты. Поэтому для определения их содержания нами был использован метод Фирордта.

Результаты определения адеметионина и п-толуолсульфокислоты в модельной смеси и двойной соли приведены в табл. 1 и 2.

Выводы

1. Разработан биосинтетический способ получения субстанции адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой с добавлением лактозы в соотношении 1:1.

2. Разработаны спектрофотометрические методики подлинности субстанции двойной соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой.

3. Разработаны методики количественного определения компонентов субстанции двойной соли при помощи спектрофотометрического метода Фирордта.

Таблица 1

Результаты определения адеметионина и п-толуолсульфокислоты в модельной смеси

Взято адеметионина, г

Найдено адеметионина

Взято п-толуолсульфокислоты, г

Найдено п-толуолсульфокислоты

г

%

г

%

0,0200

0,01957

97,85

0,1300

0,13236

101,82

0,0250

0,02598

103,92

0,1250

0,12238

97,90

0,0300

0,02935

97,83

0,1200

0,11802

98,35

0,0350

0,03621

103,46

0,1150

0,11796

102,57

0,0400

0,03989

99,73

0,1100

0,10955

99,59

0,0450

0,04511

100,24

0,1050

0,01025

97,62

 

Метрологические характеристики

moroz01.wmf

SD = 2,656

RSD = 2,643

 

Метрологические характеристики

moroz02.wmf

SD = 2,103

RSD = 2,111

   

Таблица 2

Результаты определения компонентов в соли адеметионина с серной и п-толуолсульфокислотой

Взято соли, г

Найдено адеметионина

Взято соли, г

Найдено п-толуолсульфокислоты

г

%

г

%

0,1500

0,03608

24,25

0,1500

0,01706

11,37

0,1800

0,04423

24,57

0,1800

0,02013

11,18

0,2100

0,04411

25,00

0,2100

0,02483

11,82

0,2400

0,05126

26,36

0,2400

0,02419

10,08

0,2700

0,06163

25,83

0,2700

0,02932

10,86

 

Метрологические характеристики

moroz03.wmf

SD = 2,044

RSD = 4,098

 

Метрологические характеристики

moroz04.wmf

SD = 1,300

RSD = 5,878

   

Рецензенты:

Компанцев В.А., д.фарм.н., профессор кафедры неорганической химии Пятигорского медико-фармацевтического института, филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ, г. Пятигорск;

Попова О.И., д.фарм.н., профессор кафедры фармакогнозии Пятигорского медико-фармацевтического института, филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ, г. Пятигорск.

Работа поступила в редакцию 26.03.2014.


Библиографическая ссылка

Морозов А.В., Кодониди И.П. РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ СУБСТАНЦИИ АДЕМЕТИОНИНА, ЕЕ АНАЛИЗ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 5-5. – С. 1049-1052;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=34043 (дата обращения: 12.08.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074