Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,087

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОДЕЛИ КАТЕТЕР-АССОЦИИРОВАННОЙ ИНФЕКЦИИ В УСЛОВИЯХ ИММУНОСУПРЕССИИ НА ФОНЕ ДЕЙСТВИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО КАТИОННОГО ПЕПТИДА ВАРНЕРИНА

Литвинов В.В. 1
1 ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия» им. ак. Е.А. Вагнера» Минздрава Российской Федерации
Выраженная резистентность клеточных компонентов биопленок к классическим антибиотикам требует поиска новых, альтернативных широко используемым антибактериальным препаратам соединений, способных подавлять жизнеспособность клеточных компонентов биопленок. В специальных экспериментах были получены первые результаты относительно ингибирующего действия на формирование биопленок низкомолекулярного катионного пептида варнерина, синтезируемого бактериями Staphylococcus warneri KL-1. Цель работы. Применение низкомолекулярного катионного пептида варнерина на модели катетер-ассоциированной инфекции с последующей морфологической оценкой состояния тканей вокруг катетера. Материалы и методы. Исследования проводились на 60 белых беспородных мышах весом 25–30 грамм, разделенных на контрольную и опытную группу. Животным обеих групп под эфирным наркозом под кожу спины имплантировали фрагмент пластикового катетера длиной 0,5 см. Всем животным внутримышечно вводили циклофосфамид в дозе 200 мг/кг. На части фрагментов катетеров в течение двух суток перед имплантацией выращивали бактериальные пленки Staphylococcus epidermidis 33. В опытной группе использовали низкомолекулярный катионный пептид варнерин 54 серии с активностью 1/512 тысяч условных единиц, который в виде инъекции вводили в ткани, окружающие катетер. В зависимости от предварительной обработки отрезков катетеров животные каждой группы были разделены на три подгруппы. Животных выводили из эксперимента путем передозировки эфира в первые, вторые и третьи сутки, после чего проводили гистологическое исследование тканей. Заключение. Введение варнерина в виде инъекций при отсутствии бактериального обсеменения не оказывает влияния на клеточный состав инфильтрата вокруг катетера. Применение варнерина в виде инъекций при имплантации катетеров как с предварительно выращенными биопленками, так и при ежесуточном введении взвеси стафилококка в ткани, окружающие катетер, ведет к уменьшению и исчезновению колоний микроорганизмов, а также к снижению выраженности воспалительной реакции.
модель катетер-ассоциированной инфекции
низкомолекулярный пептид варнерин
морфология
1. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В., Акименко В.К. Выделение и характеристика нового низкомолекулярного антибактериального пептида семейства лантибиотиков // Микробиология. – 2010. – Т.79, № 2. – С. 228–238.
2. Коробов В.П., Лемкина Л.М., Полюдова Т.В. Варнерин – новый лантионинсодержащий пептид: структура, свойства, антибактериальное действие // Вестник Пермского научного центра Уральского отделения РАН. – 2009. – № 4. – С. 22–26.
3. Коробов В.П., Полюдова Т.В., Лемкина Л.М. Пептидные факторы микробного антагонизма – природные антибиотики широкого спектра действия // Пермский медицинский журнал. – 2005. – Т. 22, № 1. – С. 134–144.
4. Литвинов В.В., Лемкина Л.М., Фрейнд Г.Г., Коробов В.П. Экспериментальные подходы к созданию модели катетер-ассоциированной инфекции, обусловленной биопленками стафилококков // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2011. – Т. 38,№ 4. – C. 105–106.
5. Майборода А.А. Динамическая структура очага воспаления // Морфофизиологические критерии адаптивных состояний: сб. – Иркутск, 1979. – С. 38–49.
6. Bouza E., San Juan R., Munoz P., Pascau J., Voss A., Desco M.A European perspective on intravascular catheter-related infections: report on the microbiology, workload, etiology and antimicrobial susceptibility (ESGNI-005 Study) // Clin. Microbiol. Infect. – 2004. – Vol. 10. – P. 838–842.
7. Donlan R. M. Biofilms: microbial life on surfaces // Emerg. Infect. Dis. – 2002. – Vol. 8. – P. 381–390.
8. Fontana M.B.C., Bastos M.C., Brandelli A. Bacteriocins Pep5 and epidermin inhibit Staphylococcus epidermidis adhesion to catheters // Curr. Microbiol. – 2006. – Vol. 52. – P. 350–353.
9. Mermel L., Farr B., Sheretz R. Guidelines for the management of intravascular catheter-related infections // Clin. Infect. Dis. – 2001. – Vol. 32. – P. 1249–1272.
10. Levine A.S., Schimpf S.C., Graw R.G., Young R.C. Hematologic malignancies and other marrow failure states: progress in the management of complicating infections // Semin. Hematol. – 1974. – Vol. 11. – P. 141–202.
11. O Toole G. A. To build a biofilm // J. Bacteriol. – 2003. – Vol. 185. – P. 2687–2689.
12. Safdar N., Maki D.G. The pathogenesis of catheter-related bloodstream infection with noncuffed short-term central venous catheters // Inten. Care Med. – 2004. – Vol. 30. – P. 62–67.
13. Warren D.K., Zack J.E., Elward A.M., Cox M.J., Fraser V.J. Nosocomial primary bloodstream infections in intensive care unit patients in a nonteaching community medical center: a 21-month prospective study // Clin. Infect. Dis. – 2001. – Vol. 33. – P. 1329–1335.

Катетер-ассоциированные инфекции составляют более 60 % госпитальных бактериемий в европейских странах и 11–37 % всех нозокомиальных инфекций [9, 13, 6]. Стафилококки являются ведущими возбудителями катетер-ассоциированных инфекций, из них превалируют коагулазонегативные стафилококки с преобладанием Staphylococcus epidermidis [12]. Имеется ряд доказательств наличия микробных биопленок стафилококка на установленных катетерах, причем не только в области просвета катетера, но и на внешней его стороне [7, 11].

Выраженная резистентность клеточных компонентов биопленок к антибиотикам требует поиска новых соединений, альтернативных широко используемым антибактериальным препаратам [3].

К стратегиям подавления образования биопленок можно отнести ингибирование первого этапа их формирования – бактериального прикрепления и колонизации имплантатов за счет использования биоматериалов, импрегнированных антимикробными агентами, среди которых в качестве перспективных рассматриваются низкомолекулярные катионные пептиды [8]. В этой связи особое внимание уделяется группе лантибиотиков – низкомолекулярных катионных пептидов, одним из ярких представителей которых является Низин [1].

В специальных экспериментах были получены первые результаты относительно ингибирующего действия низкомолекулярного катионного пептида Варнерина, синтезируемого бактериями Staphylococcus warneri KL-1. Подавляющий эффект пептида проявлялся как на стадии образования, так и на сформированных пленках при концентрациях, превышающих минимальную ингибирующую концентрацию для планктонной культуры [2].

При разработке методов предупреждения формирования и функционирования бактериальных пленок целесообразно использование экспериментальных моделей катетер-ассоциированных инфекций. Особенно важно проведение таких исследований на фоне подавления иммунных реакций организма, которое, в частности, может быть вызвано введением циклофосфамида, важнейшим эффектом которого является развитие нейтропении [10].

Патоморфологические исследования при моделировании катетер-ассоциированной инфекции для обоснования возможностей применения Варнерина не проводились и представляют большой интерес.

Целью настоящей работы стало применение низкомолекулярного катионного пептида варнерина на модели катетер-ассоциированной инфекции в условиях иммуносупрессии циклофосфамидом с последующей морфологической оценкой состояния тканей вокруг катетера.

Материалы и методы исследования

Исследования проводились на 60 белых беспородных мышах весом 25–30 грамм, разделенных на контрольную и опытную группы. Животным обеих групп под эфирным наркозом под кожу спины имплантировали фрагмент пластикового катетера длиной 0,5 см. Всем животным внутримышечно вводили циклофосфамид в дозе 200 мг/кг. На части фрагментов катетеров в течение двух суток перед имплантацией выращивали бактериальные пленки Staphylococcus epidermidis 33 [4]. В опытной группе использовали низкомолекулярный катионный пептид варнерин 54 серии с активностью 1/512 тысяч условных единиц [2]. В зависимости от предварительной обработки отрезков катетеров животные каждой группы были разделены на три подгруппы.

Первой подгруппе имплантировали стерильные катетеры, и в эту же область однократно вводили 1 мл варнерина. Второй подгруппе имплантировали катетеры с предварительно выращенными на них в течение двух суток биопленками, в эту же область ежесуточно вводили 1 мл варнерина. Третьей подгруппе вводили стерильные катетеры и затем в операционную рану после ее закрытия ежесуточно вводили 0,5 мл взвеси стафилококка в физиологическом растворе, содержащем 109 КОЕ/мл, после чего ежесуточно вводили 1 мл варнерина. Животные контрольной группы были разделены на аналогичные подгруппы, но без применения варнерина.

Животных всех групп выводили из эксперимента путем передозировки эфира в первые, вторые и третьи сутки, после чего для гистологического исследования забирали ткани вокруг катетера, которые фиксировали в 10 % растворе формалина. Обработку препаратов проводили по общепринятой методике и окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону, по Броун-Хопсу.

Результаты исследования и их обсуждение

В первой подгруппе при имплантации стерильных катетеров и однократного введения 1 мл варнерина отмечалась последовательная смена фаз воспаления вокруг катетеров в течение трех суток. В первые сутки преобладающей была лейкоцитарная фаза, которая характеризовалась наличием фибринозно-лейкоцитарной инфильтрации. На вторые сутки в инфильтрате появлялись макрофаги в большом количестве, т.е. наступала макрофагальная фаза. На третьи сутки регистрировалось большое количество грануляционной ткани с наличием фибробластов и тонких коллагеновых волокон, т.е. наступала фибропластическая фаза. Данная картина и сроки смены фаз характерны для развития воспалительных реакций на инородное тело в коже у мышей [5]. При этом значимых отличий в клеточном составе и морфологии окружающих катетер тканей при введении варнерина не было выявлено (рис. 1).

Во второй подгруппе при имплантации катетеров с предварительно выращенными на них двухсуточными биопленками и ежесуточном введении варнерина в протекании фаз воспаления имелись следующие особенности. В первые сутки отмечался отек и повышенное кровенаполнение окружающих катетер тканей с выпадением фибрина. Инфильтрат был представлен макрофагами и лимфоцитами. На вторые стуки фибрин обнаруживался не только снаружи, но и в просвете катетера. Отмечалось очаговое скопление клеток – лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов с образованием «гнойных телец» и скоплений микроорганизмов. По периферии катетера обнаруживались единичные нейтрофилы, макрофаги, фибробласты (рис. 2).

pic_10.tif

Рис. 1. Грануляционная ткань, слой фибрина и очаговая инфильтрация макрофагами, лимфоцитами и фибробластами вблизи имплантированного стерильного катетера после однократного введения 1 мл варнерина в окружающие ткани. Третьи сутки (Окраска гематоксилином и эозином, ×200)

pic_11.tif

Рис. 2. Скопления микроорганизмов, фибрин внутри и вокруг катетера при имплантации катетеров с предварительно выращенными на них двухсуточными биопленками и ежесуточном введении 1 мл варнерина. Вторые сутки (Окраска гематоксилином и эозином, ×10)

На третьи сутки воспалительный инфильтрат был представлен единичными лимфоцитами, макрофагами, нейтрофилами, а фибробласты формировали ограничительный вал вокруг катетера.

По сравнению с аналогичной подгруппой без использования варнерина при его ежесуточном введении в область имплантации катетера с биопленками отмечается исчезновение скопления микроорганизмов и уменьшение объема воспалительного инфильтрата. Данная тенденция особенно выражена со вторых суток.

В третьей подгруппе с ежесуточным введением взвеси стафилококка в зону имплантации катетера и последующим ежесуточным введением 1 мл варнерина протекание фаз воспаления имело следующие особенности. Уже на первые сутки в лейкоцитарную фазу отмечалось скопление микроорганизмов на поверхности катетера, по периферии отмечалось формирование воспалительного инфильтрата из нейтрофилов, макрофагов и фибрина с формированием микроабсцесса. На вторые сутки морфологическая картина оставалась прежней с тенденцией к уменьшению объема скоплений микроорганизмов (рис. 3).

pic_12.tif

Рис. 3. Скопление микроорганизмов, фибрин и воспалительный инфильтрат из нейтрофилов и макрофагов при ежесуточном введении взвеси стафилококка в зону имплантации катетера и с последующим ежесуточным введением туда же 1 мл варнерина. Вторые сутки (Окраска гематоксилином и эозином, ×100)

На третьи сутки в инфильтрате появились фибробласты, синтезирующие коллаген, и обилие лимфоцитов. При этом объем воспалительного инфильтрата и скопления микроорганизмов уменьшались (рис. 4).

pic_13.tif

Рис. 4. Широкая зона фибрина, небольшие скопления микроорганизмов вокруг катетера при ежесуточном введении взвеси стафилококка в зону имплантации катетера и с последующим ежесуточным введением туда же 1 мл варнерина. Третья группа, третьи сутки (Окраска гематоксилином и эозином, ×100)

По сравнению с аналогичной подгруппой без использования варнерина при его ежесуточном введении в область имплантации катетера на фоне массивного бактериального обсеменения также отмечается тенденция к уменьшению объема воспалительного инфильтрата и скоплений микроорганизмов.

Выводы

  1. Введение в виде инъекции в зону имплантации стерильного катетера низкомолекулярного катионного пептида варнерина не оказывает влияния на клеточный состав инфильтрата вокруг катетера.
  2. Применение низкомолекулярного катионного пептида варнерина в виде инъекций при имплантации катетеров как с предварительно выращенными биопленками, так и при ежесуточном введении взвеси стафилококка в ткани, ведет к уменьшению и исчезновению скоплений микроорганизмов, а также к снижению выраженности воспалительной реакции.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, грант 12-04-01431.

Рецензенты:

Лебединская О.В., д.м.н., профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е.А. Вагнера, г. Пермь;

Карпунина Т.И., д.м.н., профессор кафедры микробиологии Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е.А. Вагнера, г. Пермь.

Работа поступила в редакцию 18.04.2014.


Библиографическая ссылка

Литвинов В.В. МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОДЕЛИ КАТЕТЕР-АССОЦИИРОВАННОЙ ИНФЕКЦИИ В УСЛОВИЯХ ИММУНОСУПРЕССИИ НА ФОНЕ ДЕЙСТВИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО КАТИОННОГО ПЕПТИДА ВАРНЕРИНА // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 7-1. – С. 92-96;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=34398 (дата обращения: 09.08.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074