Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Шаманаев А.Ю. 1 Сидехменова А.В. 1

---

1 ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН

Хроническая венозная недостаточность (ХВН) нижних конечностей является широко распространенным и трудно корректируемым заболеванием, имеющим тенденцию к увеличению числа больных. Одним из главных патологических факторов развития ХВН является нарушение лейкоцитарно-эндотелиального взаимодействия, что играет важную роль в запуске воспалительного каскада. Целесообразным в данном случае считается применение фармакологических средств с противовоспалительными, антиоксидантными и мембраностабилизирующими свойствами. В данной работе используется модель ХВН с частичной окклюзией нижней полой вены у крыс, при которой создается устойчивая гипертензия, а также значимо повышается адгезионная активность лейкоцитов. Курсовой (14 дней) внутрижелудочный прием композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана (50 и 250 мг/кг, соответственно) восстанавливает значения адгезии лейкоцитов до показателей ложнооперированных животных.

Статья в формате PDF

298 KB

адгезионная активность лейкоцитов

хроническая венозная недостаточность

дигидрокверцетин

арабиногалактан

1. Патент РФ № 2421215, 15.04.2010.

2. Bergan J.J. Chronic Venous Disease // N. Engl. J. Med. – 2006. – Vol. 355, № 5. – P. 488–498.

3. Bergan J.J. Molecular mechanisms in chronic venous insufficiency // Ann. Vasc. Surg. – 2007. – Vol. 21. – P. 260–266.

4. Bito Т. Flavonoids differentially regulate IFNγ-induced ICAM-1 expression in human keratinocytes: molecular mechanisms of action // FEBS Letters. – 2002. – Vol. 520. – P. 145–152.

5. Boisseau M.R., de La Giclais B. Chronic venous diseases: roles of various pathophysiological factors // Clin. Hemorheol. Microcirc. – 2004. – Vol. 31, № 1. – P. 67–74.

6. Gupta M.B. Anti-inflammatory activity of taxofolin // Japan J. Pharmacol. – 1971. – Vol. 21, № 3. – P. 377–382.

7. Hahn T.L., Unthank J.L., Lalka S.G. Increased hindlimb leukocyte concentration in a chronic rodent model of venous hypertension // J. Surg. Res. – 1999. – Vol. 81. – P. 38–41.

8. Hahn T.L. Evaluation of the role of intercellular adhesion molecule 1 in a rodent model of chronic venous hypertension // J. Surg. Res. – 2000. – Vol. 88, № 2. – P. 150–154.

9. Kaplan R.M. Quality of life in patients with chronic venous disease: San Diego population study // J. Vasc. Surg. – 2003. – Vol. 35, № 5. – P. 1047–1053.

10. Ojdana D. The inflammatory reaction during chronic venous disease of lower limbs // Folia Histochem. Cytobiol. – 2009. – Vol. 47, № 2. – P. 185–189.

11. Saharay M. Endothelial activation in patients with chronic venous disease // Eur. J. Vasc Endovasc. Surg. – 1998. – Vol. 15, № 4. – P. 342–349.

12. Sandra Marinović Kulišić, Dinko Lupi. Pharmacological treatment in patients with chronic venous disease // Acta. Dermatovenerol. Croat. – 2012. – Vol. 20, № 3. – P. 197–200.

13. Takase S. Leukocyte activation in patients with venous insufficiency // J. Vasc. Surg. – 1999. – Vol. 30, № 1. – P. 148–156.

14. Wang Y.H. Prevention of macrophage adhesion molecule-1 (Mac-1)-dependent neutrophil firm adhesion by taxifolin through impairment of protein kinase-dependent NADPH oxidase activation and antagonism of G protein-madiated calcium influx // Biochem. Pharmacol. – 2004. – Vol. 67, № 12. – P. 2251–2262.

15. Wang Y.H. Taxifolin ameliorates cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through its anti-oxidative effect and modulation of NF-kappa B activation // J. Biomed. Sci. – 2006. – Vol. 13, № 1. – P. 127–141.

Хроническая венозная недостаточность (ХВН) является самым распространенным заболеванием вен, которое сопровождается такими симптомами, как отеки, судороги, ощущение тяжести, покалывания и скованность ног, а также на поздних стадиях пигментацией кожи и трофическими язвами [5]. Все это в значительной степени снижает качество жизни больных, приводит к снижению трудовой и социальной активности [9].

Одним из патологических проявлений ХВН является чрезмерная активация лейкоцитов, их адгезия к эндотелию сосудов и миграция в периваскулярное пространство. Активное высвобождение лейкоцитами ряда веществ приводит к повреждению эндотелия, развитию воспалительного процесса в тканях и привлечению новых лейкоцитов, что ведет к прогрессированию патологии [4]. В недавнем исследовании показана роль лейкоцитов в повреждении венозных клапанов и липодерматосклерозе [3].

Как известно, в фармакотерапии ХВН широко применяются флавоноиды и другие вещества, обладающие противовоспалительными, антиоксидантными, мембраностабилизирующими свойствами [12]. Перспективным веществом, с этой точки зрения, является дигидрокверцетин (ДГК). В недавних экспериментах было показано, что при внутривенном введении ДГК способен снижать миграцию лейкоцитов в поврежденные ткани при моделирования ишемии головного мозга [15]. Вместе с тем известно, что использование ДГК в сочетании с арабиногалактаном (АГ) повышает его фармакологическую активность [1].

Целью данной работы стала оценка влияния композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана на адгезию лейкоцитов в условиях модели хронической венозной недостаточности.

Материалы и методы исследования

В работе использовали композицию, содержащую дигидрокверцетин и арабиногалактан в соотношении 1:5 (содержание ДГК и АГ 14,9 и 80,1 % соответственно). Субстанция для исследования предоставлена ЗАО «Аметис».

Эксперименты выполнены на 17 аутбредных крысах-самцах сток Вистар массой 300–350 г. Животные содержались в стандартных условиях вивария с 12/12 световым циклом и свободным доступом к воде и пище. Перед началом исследования было получено одобрение от Биоэтического комитета ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН.

Хроническую венозную недостаточность у крыс моделировали путем ограничения кровотока в нижней полой вене. Для этого у животных под эфирным наркозом проводили лапаротомию, выделяли участок нижней полой вены проксимальнее правой почечной вены и подводили под него лигатуру. После чего в бедренную вену вводили гепарин в дозе 250 ед./кг и осуществляли частичную окклюзию нижней полой вены (на 2/3) при помощи иглы с диаметром сечения 0,8 мм, которую прикладывали к вене в месте лигирования. После перевязки сосуда частично восстанавливали его просвет, извлекая иглу. У ложнооперированных животных полностью повторяли оперативное вмешательство, но без этапа окклюзии сосуда.

Композицию дигидрокверцетина и арабиногалактана вводили животным опытной группы (n = 6) внутрижелудочно ежедневно в дозе 300 мг/кг (50 мг ДГК и 250 мг АГ) в виде взвеси в воде очищенной. Животные контрольной (n = 6) и ложнооперированной (n = 5) групп получали воду очищенную в эквиобъемном количестве. Последнее введение веществ осуществляли за час до измерения параметров.

Измерение давления в полой вене проводили на 14-й день эксперимента. Перед измерением давления крыс наркотизировали диэтиловым эфиром, затем внутривенно вводили гепарин в дозе 250 ед./кг. Давление в нижней полой вене измеряли с помощью датчика TSD104A аппаратного комплекса «Biopac» (Biopac system, США). Доступ осуществляли через бедренную вену.

Для оценки адгезионной активности лейкоцитов пробы крови забирали у крыс из общей сонной артерии под эфирным наркозом. Фракцию лейкоцитов получали на градиенте плотности фиколл-верографина при центрифугировании. Для этого 4 мл цельной крови наслаивали на 1 мл смеси фиколла и верографина (7:16), после чего центрифугировали при 800 g в течение 25 мин. Полученное кольцо лейкоцитов собирали пипеткой и дважды отмывали в растворе Хэнкса без Са²⁺ и Mg²⁺ (0,8 % NaCl, 0,04 % KCl, 0,035 % NaHCO₃, 0,006 % Na₂HPO₄, 0,006 % KH₂PO₄, 0,1 % глюкоза, pH = 7,4) при 400g в течение 15 мин. После этого осадок ресуспендировали в 5 мл раствора Хэнкса без Са²⁺ и Mg²⁺. Полученную суспензию лейкоцитов помещали в капилляр, предварительно обработанный раствором Дюльбекко (0,8 % NaCl, 0,013 % CaCl₂×2H₂O, 0,01 % MgCl₂×6H₂O, 0,02 % KCl, 0,02 % NaHPO₄, 0,115 % NaH₂PO₄, pH = 7,4). Клетки инкубировали при 37 ^оС в течение 60 мин. Неадгезировавшие лейкоциты удаляли, поворачивая капилляр в вертикальное положение. После чего капилляр заполняли раствором Дюльбекко и при напряжении сдвига, создаваемом давлением 0,05 кгс/см², удаляли со стенок капилляра адгезировавшие лейкоциты. Число клеток подсчитали в исходной суспензии, а также первом и втором смыве, используя камеру Горяева. Количество клеток в смывах выражали в процентах от числа лейкоцитов в исходной суспензии.

Для оценки достоверности межгрупповых различий использовали непараметрический критерий Mann ‒ Whitney U test. Результаты исследований представлены в виде M ± m, где M – среднее значение, m – стандартная ошибка среднего значения. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета статистических программ «Statistica 6.0».

Результаты исследования и их обсуждение

У животных контрольной группы частичная окклюзия нижней полой вены приводила к развитию устойчивой гипертензии, что выражалось в повышении давления в 2,2 раза (p < 0,01) по сравнению с ложнооперированной группой (табл. 1). Вместе с тем в группе животных, получавших композицию ДГК и АГ, давление было достоверно ниже на 16 % по сравнению с контрольной группой.

Таблица 1

Давление в нижней полой вене у крыс на 14 день после ее частичной окклюзии

Примечание. * – достоверно по сравнению с ложнооперированными животными (р < 0,05); + – достоверно по сравнению с контролем (р < 0,05).

Из данных литературы известно, что используемая нами модель ХВН у животных характеризуется развитием стойкой, хотя и относительно умеренной, венозной гипертензии, которая, однако, провоцирует миграцию лейкоцитов в ткани [7]. При этом предварительная инъекция антител к белку ICAM-1 сильно ограничивает повышение уровня лейкоцитов [8].

В результате измерения адгезионной активности лейкоцитов было выявлено, что моделирование ХВН у крыс приводило к достоверному уменьшению доли неадгезировавших лейкоцитов в 2,6 раза и увеличению доли адгезировавших лейкоцитов в 1,7 раз по сравнению с ложноперированной группой (табл. 2).

В опытной группе животных применение композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана ограничивало повышение адгезионной активности лейкоцитов (табл. 2). Доли неадгезировавших и адгезировавших лейкоцитов были близки к значениям в ложнооперированной группе, причем доля последних значимо отличалась от контроля.

Таблица 2

Влияние композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана на адгезию лейкоцитов в условиях ХВН у крыс

Примечание. * – достоверно по сравнению с ложнооперированными животными (р < 0,05); + – достоверно по сравнению с контролем (р < 0,05).

В соответствии с гипотезой лейкоцитарной активации при ХВН наблюдается усиление «прилипания» белых клеток крови к эндотелию сосудов, что объясняется снижением скорости кровотока и повышением экспрессии молекул адгезии, включая ICAM-1 и VCAM-1, эндотелиоцитами [2, 13]. Причем изменения в уровне молекул адгезии и лейкоцитарная инфильтрация тканей ног развиваются даже у здоровых людей в ответ на естественное повышение давления в венах, вызванное длительным нахождением в положении стоя [11]. Поэтому важным является не только уровень конкретного белка, но, в большей мере, баланс между воспалительными реакциями и защитными механизмами.

Как известно, флавоноиды, в том числе ДГК, способны оказывать противовоспалительное действие, ингибируя ферменты, вовлеченные в этот процесс [6, 12]. ДГК является ингибитором фосфодиэстеразы 4 типа, локализованной в различных клетках, в том числе и в лейкоцитах [15]. Благодаря своим сильным антиоксидантным свойствам ДГК способен защищать ткани от свободных радикалов, активно продуцируемых лейкоцитами, что, в свою очередь, препятствует привлечению новых клеток [2]. Прямое действие ДГК может быть обусловлено его способностью снижать экспрессию молекул адгезии ICAM-1 в кератиноцитах и Mac-1-индуцированную адгезию нейтрофилов из периферической крови человека [2, 4]. Кроме того, на модели ишемии головного мозга было обнаружено, что применение ДГК ограничивало инфильтрацию лейкоцитов и вызванное этим повреждение тканей [1].

Выводы

Таким образом, на модели ХВН, вызванной частичной окклюзией нижней полой вены крыс, было показано выраженное повышение адгезионной активности лейкоцитов. Курсовой внутрижелудочный прием композиции дигидрокверцетина и арабиногалактана (50 и 250 мг/кг соответственно) восстанавливал адгезионную активность лейкоцитов до показателей ложнооперированных животных.

Рецензенты:

Плотникова Т.М., д.б.н., профессор кафедры фармакологии, ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Томск;

Суслов Н.И., д.м.н., профессор, заведующий лабораторией психофармакологии, ФГБУ «НИИ фармакологии имени Е.Д. Гольдберга» СО РАМН, г. Томск.

Работа поступила в редакцию 04.06.2014.

Библиографическая ссылка