Научный журнал
Фундаментальные исследования
ISSN 1812-7339
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 1,074

МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ ЧЕРНОЙ СУБСТАНЦИИ СРЕДНЕГО МОЗГА КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ 2-ОКСО-1-ПИРРОЛИДИНАЦЕТАМИДА НА ФОНЕ БИЛАТЕРАЛЬНОЙ ОККЛЮЗИИ ОБЩИХ СОННЫХ АРТЕРИЙ

Васильев Ю.Г. 1 Вольхин И.А. 1 Берестов Д.С. 1 Канунникова О.М. 2
1 ФГБОУ ВПО «Ижевская государственная сельскохозяйственная академия»
2 Физико-технический институт УрО РАН
Проведен анализ строения черной субстанции 234 белых крыс после острой транзиторной окклюзии общих сонных артерий и его коррекции формами пирацетама на 3, 7, 14, 30, 60 сутки после эксперимента. Механоактивация пирацетама производилась в шаровой планетарной мельнице АГО-2С. Полученный препарат подвергся рентгеноструктурному анализу порошков на дифрактометре Bruker D8 Advance с использованием CuKα – излучения, биохимическому и физикохимичекому исследованию. Где было показано, что пирацетам изменяет конформационную структуру без изменения химической структуры вещества. Пирацетам вводили крысам в аналогичных средних терапевтических дозах 300 мг/кг. После чего выводили животных из эксперимента на 3, 7, 14, 30, 60 сутки после проведенных манипуляций. Выявлена терапевтическая эффективность применения механоактивированного пирацетама в шаровой мельнице планетарного типа в виде снижения апоптозов, уменьшения числа погибших нейронов, снижения уровня глиоза, изменений микроциркуляции.
средний мозг
черная субстанция
острая транзиторная ишемия
пирацетам
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. – М.: Медицина, 1990. – 384 с.
2. Васильев Ю.Г. Нейро-глио-сосудистые отношения в центральной нервной системе (морфологическое исследование с элементами морфометрического и математического анализа) / Ю.Г. Васильев, В.М. Чучков. – Ижевск. : Изд-во АНК. – 2003. – 164 с.
3. Варлоу Ч.П., Меннис М.С., Жван Гейн и др. Инсульт. Практическое руководство для ведения больных //Пер. с англ. – СПб. – 1998. – С. 629.
4. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. //-М. -2001. – С.328.
5. Физико-химические и биологические свойства водных растворов кристаллических модификаций I, II, (II + FE) 2-оксо-1-пирролидин-ацетамида/ О.М. Канунникова, Д.С. Берестов, Ю.Г. Васильев и др.// Вест. УдГУ. 2012. № 4.-С. 082–092.

Дисфункциональные нарушения, связанные с изменением сосудисто-трофического обеспечения головного мозга, являются одной из важных проблем неврологии. Эти нарушения могут возникнуть как в раннем онтогенезе, так и в позднем возрасте, проявляясь при этом выявлением ишемизированных зон, инсультами и другими нарушениями (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001). В связи с этим важен поиск эффективных способов коррекции таких нарушений. В течение длительного времени для лечения дисциркуляторных повреждений мозга используются ноотропы, эффективность которых и по настоящее время ставится под сомнение (Варлоу Ч.П., М.С. Меннис и др. 1998). Механоактивация ноотропов, приводящая к их конформационным изменениям, может играть существенную роль в усилении терапевтического эффекта. (О.М. Канунникова, 2012).

Цель исследования – выяснить влияние пирацетама и его механоактивированной формы на морфологическое строение черной субстанции ствола головного мозга крыс после острой транзиторной ишемии.

Материал и методы исследования

Объектами исследования служили 234 белые лабораторные крысы-самцы 6 месяцев постнатального онтогенеза на 3, 7, 14, 30, 60 сутки после билатеральной 30-минутной окклюзии общих сонных артерий (ОСА). Эксперименты над животными осуществляли в соответствии с правилами проведения работ с экспериментальными животными. Под контролем понимали животных, перенесших временную билатеральную окклюзию общих сонных артерий без последующего введения пирацетама, в первой опытной группе производили введение исходной формы пирацетама и второй опытной группе вводили механоактивированный препарат.

Исходный пирацетам кристаллизировали из медицинского препарата «раствор пирацетама для внутривенного и внутримышечного вливания» (ОАО «Фармстандарт-Уфа-ВИТА», г. Уфа). Кристаллизацию проводили путем выпаривания раствора медицинского препарата при температуре 1100 °C вплоть до полного удаления жидкости. Далее порошок измельчали в агатовой ступке и дегидратировали в сушильном шкафу при 1100 °C в течение 2 часов. Исходная форма пирацетама не подвергалась дальнейшей обработке.

Вывод из опыта животных осуществляли через 3, 7, 14, 30, 60 суток после вмешательства. Животных оперировали и осуществляли забой под общим залетиловым наркозом в дозе препарата 50 мг/кг. Послеоперационный уход за животными и их кормление осуществлялось по стандартной методике.

Препараты окрашивали по методу Ниссля, импрегнации по Гольджи-Бюбенет, антитела к ГФКБ, каспаза-3. Морфометрический анализ осуществлялся по компактной зоне ЧС согласно рекомендациям Ю.Г. Васильева, В.М. Чучкова, с соавт. (2003). Статистическая обработка осуществлясь с помощью пакета программ «Microsoft Excel 2003». Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

К 3 суткам после временной окклюзии общих сонных артерий без последующего введения пирацетама изменение морфо-функциональной организации черной субстанции крыс во всех случаях носили умеренно выраженный характер. Так в телах нейронов проявления реактивных ответов были нередко связаны с проявлениями сморщивания нейронов (16,8 + 0,5 %), с гиперхпромностью цитоплазмы и ядер. В других случаях обнаруживались проявления вакуолизации цитоплазмы на фоне гипертрофии ядрышкового аппарата, что предполагает возможное усиление функциональной активности клеток. Основными ответами в данном сроке являлись проявления гиперхромности тел нейронов. Глиоциты в целом проявляли признаки реактивности в виде гипертрофии ядер, повышении их содержания в толще ядерного центра, формировании групп из нескольких прилежащих клеток. Сосудистые реакции проявлялись в умеренно выраженных проявлениях полнокровия, с расширением как приносящих, так и выносящих сосудов, однако проявления набухания эндотелия, периваскулярного отека и иммиграция лейкоцитов проявлялась в единичном случае у животного с наиболее выраженными нарушениями в неврологической сфере. В случае применения исходного пирацетама изменения в морфологических реакциях ядерного центра носили схожий характер. Однако имелась тенденция к незначительному снижению относительного содержания гипертрофированных нейронов (с 13,9 + 0,3 % в контроле к 12,4 + 0,6 % в опыте 1). Применение механоактивированной формы пирацетама при схожести качественных морфологических реакций обнаруживает некоторые количественные различия в редких нейронах. В частности, существенно снижается число вакулолизированных нейронов с проявлениями набухания ядра и распада ядрышка, что рассматривалось нами как показатель активации аутолитических процессов (13,6 + 1,0 % при применении активированного пирацетама к 17,6 + 0,4 % у контрольных животных p < 0,01), чего не обнаруживалось у животных с введением исходной формы пирацетама (18,1 + 1,9 %)

Морфология черной субстанции в контроле на 7 сутки после острой ишемической атаки проявлялась вакуолизацией значительного числа нейронов (15,6 + 3,1 % по отношению к опыту 2 4,8 + 1,1 % p < 0,05), либо их сморщиванием (35,8 + 2,7 % по отношению к опыту 2 24,3 + 1,7 % p < 0,05). В непосредственном окружении нередко выявлялись группы глиоцитов (астроциты, микроглия), что рассматривалось нами как проявление нейронофагии. Изучение каспазы-3 указывает на усиление проявления апоптоза в данном сроке. Так имеются единичные группы по 2–4 клетки с высоким уровнем каспазы-3. Обнаруживаются так же нейроны с умеренной либо слабой экспрессией фермента. Исследование нейроглии на 7 сутки после проведенной транзиторной окклюзии обнаруживает ответы в виде увеличения числа глиоцитов в толще ядерного центра, проявлений нейронофагии. Реактивные изменения сосудистого русла в обоих субъядрах были менее заметны, но наблюдались умеренные проявления венозного застоя и полнокровия без признаков агрегации эритроцитов, сохранение структурной организации ядер эндотелия и перицитов. К 7 суткам в первой опытной группе с введением исходной формы пирацетама наблюдалось увеличение гипертрофированных нейронов (5,5 + 0,5 % p < 0,05 по отношению к контролю 3,7 + 0,2 %). Во второй опытной группе с механоактивированной формой препарата морфологические изменения были более выражены по сравнению с контрольной и первой опытной группами животных. Это проявлялось увеличением числа гипертрофированных нейронов до 9,5 + 1,6 % p < 0,05 и увеличением количества морфологически не измененных форм нейронов с 44,9 + 3,5 % в контроле до 61,7 + 2,8 % p < 0,01. Эти данные подтверждались иммуногистохимическими исследованиями, в частности, экспрессия каспазы- 3. У контрольных и первой опытной группы животных наблюдалась сильно и умеренно выраженная экспрессия белка. Каспаза-3 наблюдалась как в компактной, так и в ретикулярных зонах ЧС небольшими группами, либо один – два нейрона, при этом обнаруживаясь во всех исследуемых полях зрения. Во второй опытной группе их число значимо ниже и преобладают нейроны с умеренно выраженной либо слабо выраженной экспрессией каспазы-3.

Структурная организация ЧС на 14 сутки у контрольных животных характеризуется положительной динамикой распределения популяций нейронов по сравнению с 7 сутками. В частности, существенно снижается число измененных нейронов с проявлениями сморщивания с 29,1 + 2,5 % в контроле до 11,8 + 1,7 % p < 0,01 во второй опытной группе. В то же время несколько возрастает число гипертрофированных нейронов 5,4 + 0,4 % в контроле и до 11,0 + 1,5 % p < 0,05 во второй опытной группе. Однако на этом фоне наблюдается динамическое уменьшение удельной плотности нейронов по отношению к ядру в целом, что является косвенным показателем гибели нервных клеток либо пролиферативно гипертрофических реакций нейроглии, отростков нервных клеток, отека. Это сопровождается неравномерным распределением тел нейронов, более заметное в компактной зоне черной субстанции. Изучение глиальных структур в ЧС на 14 сутки указывают на существенные реактивные изменения в нейроглии. Это проявляется в увеличении плотности ядер глиоцитов, как по сравнению с телами нейронов, так и в абсолютных показателях. Астроциты отличаются существенным разнообразием с увеличением длины и степени ветвления отростков. Эти изменения подтверждаются исследованиями ядер с помощью антител ГФКБ в частности число ГФКБ + клеток существенно возрастает как по отношению к ложнооперированным, так и по отношению к предыдущему сроку. Проявление венозного застоя существенно уменьшается, что сопровождается снижением степени расширения посткапиллярных образований, количественных показателей удельной плотности кровеносных микрососудов компактной зоны ЧС до 24,5 + 2,8 % в контроле. В то же время сосудисто-капиллярные сети отличаются значительным полиморфизмом распределения капиллярных сетей, нередко извитым характером капилляров. На 14 сутки в первой опытной группе распределение нейронов обнаруживает тенденцию к снижению интенсивности реактивных изменений. Происходит уменьшение процента вакуолизированных нервных клеток (11,3 + 1,9 % по отношению к 7 суткам 14,9 + 2,1 %), и соотношения сохранных нейронов по отношению к реактивно измененным популяциям клеток (74,3 + 4,4 % p < 0,05 по отношению к 7 суткам 61,7 + 2,8 % p < 0,01). Как и в контрольной группе с транзиторной артериальной ишемией число нейронов существенно уменьшается, что проявляется уменьшением объемной плотности нейронов по отношению к ядерному центру в целом. Динамика глиальных ответов характеризуется пролиферативно гипертрофическими реакциями глиоцитов с увеличением числа клеток глиального ряда, пролиферация их отростков, повышенная реакция ГФКБ. Состояние сосудисто-трофического обеспечения в первой опытной группе характеризуется несколько более заметным снижением интенсивности сосудистых ответов в виде уменьшения удельного объема сосудов и длины капилляров на единицу объема. Во второй опытной группе сопровождается положительной динамикой, защитно-компенсаторными ответами на повреждающее действие деафферентации в высших центрах нервной регуляции на фоне острой транзиторной ишемии корковых центров. Это проявляется в значительно меньшем числе реактивных нейронов как в контрольной, так и в первой опытной группах. В контрольной и опытной группе выявляются отдельные клетки с высоким уровнем каспазы-3 до 2–5 клеток в поле зрения со значительным числом клеток с умеренной или слабой экспрессией каспазы-3. В целом это указывает на тенденцию к повышенной апоптотической готовности неравных клеток. Применение механоактивированного пирацетама сочеталось со значительным уровнем уменьшения каспазы-3, обнаруживается не более 1–2 клеток с сильной экспрессией и 2–3 с сильной экспрессией белка. Количественные изменения в сосудистых образованиях нервного центра рассматриваемых сроков сопровождается превышением по некоторым количественным характеристикам контроля.

Морфологическое строение ЧС к 30 суткам у контрольных животных характеризуется неравномерным распределением тел нейронов. При этом наблюдается прогрессирующее уменьшение удельной плотности тел нейронов по отношению к ядру в целом, как в контроле (19,1 + 1,1 % по отношению к 14 суткам 24,5 + 2,8 %), так и в опытных группах данного срока. Это может быть следствием пролиферативно-гипертрофических реакций нейропиля (ответами нейроглии, развитием отростков нейронов и т.д.) либо гибелью части нервных клеток и замещением их астроцитарным окружением. Повышается морфологическое разнообразие нейронных ансамблей, выражающееся в значительном числе клеток с более сильным развитием дендритного дерева, шипикового аппарата, нетипичной структурой форм и тел нейронов. Выявлялись пролиферативно-клеточные и гипертрофические реакции нейроглии с изменением нейроглиального отношения в сторону повышения содержания нейроглии как в контрольных (7,8 + 0,4 ед. по отношению к 14 суткам 5,8 + 0,4 ед.), так и опытных группах. Нередко обнаруживались промежуточные формы астроцитов с увеличенной распространенностью отростков, при высокой степени их ветвления. В участках с редким расположением тел нейронов выявлялись группы астроцитов, заполняющие эти пространства, что указывало на умеренное проявление глиоза. Изменения в сосудистом русле носили преимущественно количественный характер и проявлялись в уменьшении плотности распределения сосудов (4,18 + 0,09 % по отношению к 14 суткам 7,18 + 0,19 %), также второй опытной группы 5,94 + 0,10 % p < 0,001 к 6,48 + 0,24 %.

На 30 сутки в первой опытной группе соотношение площади тел нейронов имеет тенденцию к снижению 22,8 + 1,8 по отношению к предыдущим срокам. Ответы нейроглии в первой опытной группе в количественном и качественном отношении близки к контрольным животным. В группе с введением активированной формы препарата наблюдалась высокая степень сохранности нейронных популяций в обоих субъядрах, что проявлялось в более высоком уровне относительного объема тел нейронов, что указывает на их высокую сохранность в ЧС. По сравнению с ложнооперированными животными значительное содержание шипиков, что в целом указывает на высокую напряженность синтетических процессов в ядре. Нейроны с высоким уровнем каспазы-3 встречаются в виде единичных клеток, имеется значительное число клеток со средним или низким уровнем экспрессии рассматриваемого белка. Нейроглиальный индекс существенно ниже 5,7 + 0,4 ед. p < 0,01 по сравнению с животными контрольной 7,8 + 0,4 ед. и первой опытной группы 6,9 + 0,3 ед.

К 60 суткам морфологическое строение ЧС у контрольных животных характеризовалось существенным снижением удельной плотности тел нейронов (17,2 + 0,9 % в контроле и до 27,8 + 1,3 % p < 0,001 во второй опытной группе), что сопровождалось компенсаторным развитием нейроглии и проявлялось в высокой экспрессии ГФКБ, высоком нейро-глиальном отношении (7,9 + 0,3 ед.). Глиоциты образовывали небольшие группы из 3–5 клеток, либо располагались одиночно, окружая тела нейронов микрососудами. Существенно повышалось разнообразие астроцитов в связи с пролиферативно-гипертрофическими ответами их отростков. Изменение ангиоархитектоники носили в основном количественный характер и проявлялись уменьшением удельной плотности сосудов (3,96 + 0,12 % по отношению к 30 суткам 4,18 + 0,09 %). Морфологические реакции проявлялись деформацией сосудисто-капиллярных сетей. Обнаруживалось значительное число закрытых капилляров с суженным просветом. Обнаружились единичные тела нейронов со значительным уровнем экспрессии каспазы-3. К концу 60 суток в группе с введением исходной формы пирацетама морфофункциональные реакции по многим показателям были близки к контрольной группе и проявлялись в существенном уменьшении содержания перикарионов нейронов в обеих зонах ЧС с преимущественными реакциями в компактной зоне. Это сопровождалось проявлениями пролиферативно-гипертрофических ответов нейроглии со смещением нейроглиального индекса в сторону нейроглии. Сосудистые ответы также были близки к контрольным животным рассматриваемого срока и проявлялись в повышении полиморфизма сосудисто-капиллярных сетей за счет формирования участков сгущения и разряжения капилляров, извитой форме капиллярных сетей. Введение активированной формы пирацетама, осуществляемое во второй опытной группе, сопровождалось существенными отличиями по отношению к предыдущим группам животных. Менее заметно повышение числа глиоцитов с менее выраженным смещением нейроглиального индекса в сторону глиоцитов 6,1 + 0,2 ед. p < 0,01. Экспрессия каспазы-3 во всех рассматриваемых группах животных, подвергшихся острой транзиторной артериальной ишемии, на 60 сутки обнаруживает минимальную экспрессию в виде единичных клеток с низким или средним её содержанием.

Выводы

Применение механоактивированного пирацетама существенно снижает степень морфологических изменений в структурах ядра, что особенно заметно в поздние сроки на фоне введения препарата. Эффективность исходной формы пирацетама, сопровождалась тенденциями к уменьшению морфологических изменений, не оказывая значимого влияния на течение патологического процесса по большинству рассмотренных показателей.

Рецензенты:

Селякин С.П., д.м.н., профессор кафедры анатомии человека ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия», г. Ижевск;

Сабельников Н.Е., д.м.н., доцент кафедры анатомии человека ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия», г. Ижевск.

Работа поступила в редакцию 14.08.2014.


Библиографическая ссылка

Васильев Ю.Г., Вольхин И.А., Берестов Д.С., Канунникова О.М. МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ СТРОЕНИЕ ЧЕРНОЙ СУБСТАНЦИИ СРЕДНЕГО МОЗГА КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМ 2-ОКСО-1-ПИРРОЛИДИНАЦЕТАМИДА НА ФОНЕ БИЛАТЕРАЛЬНОЙ ОККЛЮЗИИ ОБЩИХ СОННЫХ АРТЕРИЙ // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 9-8. – С. 1737-1741;
URL: http://www.fundamental-research.ru/ru/article/view?id=35131 (дата обращения: 17.01.2020).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074