Научный журнал

Фундаментальные исследования

ISSN 1812-7339

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 1,674

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Поляков Л.М. 2 Лушникова Е.Л. 1 Непомнящих Л.М. 1 Русских Г.С. 2 Биушкина Н.Г. 2 Клинникова М.Г. 1 Мжельская М.М. 1 Непомнящих Р.Д. 1 Пичигин В.И. 1 Южик Е.И. 1

---

1 ФГБУ НИИ региональной патологии и патоморфологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

2 ФГБУ НИИ биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Изучены показатели липидного обмена у гипотиреоидных и эутиреоидных крыс на модели экспериментальной гиперхолестеринемии. Для подавления функции щитовидной железы на фоне холестериновой диеты животные получали антитиреоидный препарат мерказолил. Показано, что холестериновая диета у гипотиреоидных животных (снижение концентрации тироксина в 2 раза) приводила к развитию выраженной гиперхолестеринемии за счет увеличения холестерина в составе липопротеинов высокой (33 %) и особенно в составе фракции липопротеинов низкой и очень низкой плотности (55 %). При этом концентрация в плазме крови аполипопротеина А-I увеличилась на 22 %, а аполипопротеина В – на 71 %. По данным электрофореза в линейном градиенте ПААГ у животных с гипотиреозом значительно изменился белковый состав фракции липопротеинов низкой и очень низкой плотности. Денситометрический анализ геля выявил увеличение в них содержания аполипопротеинов В-100, В-48, Е и С в 2,5–4,0 раза. Данная экспериментальная модель может быть использована для изучения молекулярно-клеточных механизмов атеросклеротических повреждений сердца и сосудов.

Статья в формате PDF

288 KB

гипотиреоз

гиперхолестеринемия

липидный обмен

липопротеины плазмы крови

аполипопротеины

1. Клинникова М.Г., Пичигин В.И., Южик Е.И., Непомнящих Р.Д., Лушникова Е.Л. Роль дислипидемий в модификациях энергетических и пластических процессов в кардиомиоцитах // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 4 (3). – С. 634–640.

2. Клинникова М.Г., Южик Е.И., Пичигин В.И., Лушникова Е.Л. Ремоделирование миокарда крыс при хронической дислипидемии и введении верапамила // Бюл. экспер. биол. – 2014. – Т. 158, № 7. – С. 108–115.

3. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Л., Поляков Л.М., Молодых О.П., Клинникова М.Г., Русских Г.С., Потеряева О.Н., Непомнящих Р.Д., Пичигин В.И. Структурные реакции миокарда и липидный спектр сыворотки крови при моделировании гиперхолестеринемии и гипотиреоза // Бюл. экспер. биол. – 2013. – Т. 155, № 5. – С. 647–652.

4. Поляков Л.М., Потеряева О.Н., Панин Л.Е. Определение апопротеина A-I методом иммуноферментного анализа // Вопр. мед. химии. – 1991. – Т. 37, № 1. – С. 89–92.

5. Applebaum-Bowden D., Kobayashi J., Kashyap V.S. et al. Hepatic lipase gene therapy in hepatic lipase-deficient mice. Adenovirus-mediated replacement of a lipolytic enzyme to the vascular endothelium // J. Clin. Invest. – 1996. – Vol. 97, № 3. – P. 799–805.

6. Аvogaro P., Bon G.В., Gazzolato G., Quinci G.B. Are apolipoproteins better discriminators than lipids for atherosclerosis? // Lancet. – 1979. – Vol.313, № 8122. – P. 901–903.

7. Drew A.F. Animal models of diet-induced atherosclerosis // Methods Mol. Med. – 2001. – Vol. 52. – P. 1–6.

8. Getz G.S., Reardon C.A. Diet and murine atherosclerosis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. – 2006. – Vol. 26, № 2. – P. 242–249.

9. Gullberg H., Rudling M., Forrest D., Angelin B., Vennström B. Thyroid hormone receptor beta-deficient mice show complete loss of the normal cholesterol 7alpha-hydroxylase (CYP7A) response to thyroid hormone but display enhanced resistance to dietary cholesterol // Mol. Endocrinol. – 2000. – Vol. 14, № 11. – P. 1739–1749.

10. Guyard-Dangremont V., Desrumaux C., Gambert P., Lallemant C., Lagrost L. Phospholipid and cholesteryl ester transfer activities in plasma from 14 vertebrate species. Relation to atherogenesis susceptibility // Comp. Biochem. Physiol. Part B. – 1998. – Vol. 120, № 3. – P. 517–525.

11. Hatch F.T. Practical method for plasma lipoprotein analysis // Adv. Lipid. Res. –1968. – Vol. 6. – P. 1–68.

12. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. – 1970. – Vol. 227, № 5259. – P. 680–685.

13. Pedrelli M., Pramfalk C., Parini P. Thyroid hormones and thyroid hormone receptors: Effects of thyromimetics on reverse cholesterol transport // World. J. Gastroenterol. – 2010. – Vol. 16, № 47. – P. 5958–5964.

14. Salter A.M., Hayashi R., al-Seeni M., Brown N.F., Bruce J., Sorensen O., Atkinson E.A., Middleton B., Bleackley R.C., Brindley D.N. Effects of hypothyroidism and high-fat feeding on mRNA concentrations for the low-density-lipoprotein receptor and on acyl-CoA:cholesterol acyltransferase activities in rat liver // Biochem. J. – 1991. – Vol. 276, Pt 3. – P. 825–832.

15. Tanigawa H., Billheimer J.T., Tohyama J., Zhang Y., Rothblat G., Rader D.J. Expression of cholesteryl ester transfer protein in mice promotes macrophage reverse cholesterol transport // Circulation. – 2007. – Vol. 116, № 11. – P. 1267–1273.

В настоящее время используются различные модели атеросклеротического поражения стенки сосудов. Они могут быть вызваны самыми различными факторами: механическими, химическими, иммунологическими, а также диетой [7]. Модели на животных позволяют изучать не только стадии развития атеросклеротического процесса, начиная от самой ранней, но и возможности управления этим процессом. Наиболее популярной является модель экспериментальной гиперхолестеринемии, вызванной путем скармливания животным диеты с избыточным количеством холестерина и насыщенных жирных кислот [2, 3, 8].

У грызунов (мышей и крыс), в отличие от человека, в плазме крови отсутствует белок, переносящий эфиры холестерина с липопротеинов высокой плотности на липопротеины низкой и очень низкой плотности (cholesteryl ester transfer protein, CETP), и это является одной из главных причин их резистентности к развитию атеросклеротического процесса [15]. Отсутствие белка - передатчика эфиров холестерина не является единственным отличием метаболизма липопротеинов у грызунов по сравнению с человеком, грызуны имеют и другие особенности метаболизма липопротеинов: высокий уровень циркулирующих липаз [5] и специфичного белка - переносчика фосфолипидов (specific phospholipid transfer protein, PLTP) [10], что и объясняет их устойчивость к атеросклерозу. Однако у гипотиреоидных мышей и крыс эта устойчивость резко снижается, что позволяет получать информацию о факторах, способствующих развитию атеросклеротического процесса, а также о возможности разработки новых диагностических и терапевтических стратегий.

Цель исследования – изучение показателей липидного обмена и спектральных характеристик белкового состава липопротеинов плазмы крови у гипотиреоидных и эутиреоидных крыс на модели экспериментальной гиперхолестеринемии.

Материал и методы исследования

Эксперимент продолжительностью 68 сут выполнен на 18 крысах-самцах Вистар массой 390–560 г. Животных содержали в индивидуальных клетках, они имели свободный доступ к воде. Крысы I группы получали атерогенную диету (модель алиментарной гиперхолестеринемии): холестерин (Panreac Quimica SA, Испания) в дозе 25 мг/100 г массы тела, добавленный в стандартный лабораторный рацион. Крысы II группы получали ту же атерогенную диету и антитиреоидный препарат мерказолил («Акрихин», Россия) в дозе 1 мг/100 г массы тела, добавленные в стандартный лабораторный корм. Кормление животных происходило по схеме: один день – атерогенная диета (группа I) или атерогенная диета с добавлением мерказолила (группа II); второй день – голодание; вода ad libitum каждый день. Контрольную группу составили крысы, содержавшиеся в стандартных условиях вивария и получавшие стандартный рацион каждый день. В каждой группе было по 6 крыс, все животные дожили до конца эксперимента. В отношении экспериментальных животных были соблюдены все правила и рекомендации Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах.

Показатели липидного обмена в плазме крови: общий холестерин (ОХС), холестерин липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП), холестерин фракции липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ХС-ЛПНП + ХС-ЛПОНП), триглицериды (ТГ) определяли энзиматическим методом с использованием наборов «Biocon» (Германия) на биохимическом анализаторе «Labsystem» (Финляндия). Оценку тиреоидного статуса – концентрацию тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3), проводили иммунохемилюминесцентным методом с использованием наборов фирмы «Immunotech» (Чехия) на люминометре LM-01A (Bekman Coulter Company). Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА) аполипопротеинов А-I и В (апоА-I и апоВ) выполняли непрямым методом, описанным нами ранее [4]. Индекс атерогенности рассчитывали как отношение (ОХС – ХС-ЛПВП)/ХС-ЛПВП, индекс Авогаро – как отношение концентрации апоА-I к концентрации апоВ (апоА-I/апоВ) [6].

Липопротеины выделяли из плазмы крови методом изоплотностного ультрацентрифугирования в растворах KBr в присутствии 3 мМ ЭДТА-Na2 на центрифуге «Optima L-90K» («Beckman Coulter») с использованием углового ротора 70.1 Ti при 105000 g в течение 24 ч [11]. Получали две основные фракции липопротеинов: ЛПОНП + ЛПНП (0,94 < d < 1,063 г/мл) и ЛПВП (1,063 < d < 1,21 г/мл). Электрофоретический анализ состава белкового компонента суммарной фракции ЛПНП и ЛПОНП проводили после делипидирования липопротеинов в полиакриламидном геле (ПААГ) в линейном градиенте (4–20 %) с DS-Na [12]. Белковые полосы визуализировали 0,1 % Кумасси G-250 в смеси метанола и 10 % уксусной кислоты (1:1). В качестве маркеров использовали наборы низкомолекулярных белков-стандартов: альбумин, 67 кДа; овальбумин, 43 кДа; карбоангидраза, 30 кДа; лизоцим, 14,4 кДа («Pharmacia», Швеция). Денситометрический анализ электрофореграммы проводили с помощью компьютерной программы TotalLab (BioSistematica, New Horizons in gel imaging and analysis).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программы Statistica 6; для оценки значимости различий при нормальном распределении использовали t-критерий Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Холестериновая диета у крыс не влияла на тиреоидный статус, содержание тироксина и трийодтиронина практически не изменялось (таблица). Включение в рацион антитиреоидного препарата мерказолила не оказывало заметного влияния на содержание Т3 в плазме крови у крыс II группы по сравнению с контрольной группой и группой I, однако содержание Т4 под действием мерказолила снизилось почти в 2 раза, что свидетельствует об адекватности модели гипотиреоидного состояния.

К окончанию эксперимента в группе животных, получавших только экзогенный холестерин, наблюдался дефицит массы тела по сравнению с контролем (394 ± 13 против 539 ± 19 г, р < 0,05), т.е. произошло снижение на 27 %. В группе животных с гипотиреозом разница массы тела по сравнению с контролем была не так значительна (456 ± 8, р < 0,05), однако и она была на 16 % ниже контроля. Снижение массы тела животных, находящихся на холестериновой диете, может быть связано с заметным уменьшением количества потребляемой пищи в этих группах.

Атерогенная диета на протяжении всего срока эксперимента практически не оказывала влияния на показатели липидного обмена у животных с нормальной функцией щитовидной железы. В этой группе содержание в плазме крови ОХ, ХС в составе ЛПВП, ХС суммарной фракции ЛПНП + ЛПОНП, а также содержание ТГ имело лишь тенденцию к повышению по сравнению с контролем.

Показатели липидного обмена и тиреоидный статус плазмы крови крыс при экспериментальной гиперхолестеринемии (M ± m)

Примечания: * – p < 0,05, ** – p < 0,01, *** – p < 0,001 при сравнении с контролем; # – p < 0,05, ## – p < 0,01 при сравнении с группой I.

Известно, что гипотиреоз часто сопровождается повышенной концентрацией холестерина в плазме крови. Гиперхолестеринемия, связанная с гипотиреозом, у человека и животных в значительной степени, как правило, происходит за счет увеличения содержания ХС в составе ЛПНП и ЛПОНП, хотя имеются отдельные сообщения и об увеличении концентрации ЛПВП [13]. В нашем эксперименте гипотиреоидное состояние, вызванное включением в атерогенный рацион мерказолила, также сопровождалось значительными изменениями липидного состава плазмы крови (см. таблицу). Увеличение содержания ОХC составило 38 %, ХС-ЛПВП – 33 %, а ХС во фракции ЛПНП и ЛПОНП – 55 %. За счет выраженной гиперхолестеринемии резко повысился и индекс атерогенности по сравнению как с контрольной, так и с эутиреоидной группой животных (p < 0,05).

Соответствующие параллельные изменения обнаружены в содержании апоА-I – основного структурообразующего белкового компонента ЛПВП, а также апоВ – главного белка в составе ЛПНП и ЛПОНП плазмы крови. Так, по данным тИФА (твердофазного иммуноферментного анализа), содержание апоА-I в плазме крови повысилось на 22 %, а содержание апоВ – на 71 %. Достоверно по отношению к обеим группам изменилась и величина такого информативного показателя обмена липопротеинов в организме, как индекс Авогаро.

Значительно более детальное представление об изменении структуры фракции ЛПНП и ЛПОНП плазмы крови при гиперхолестеринемии дал электрофоретический анализ полного состава белковых компонентов. По данным электрофореза, в линейном градиенте ПААГ (4–20 %) холестериновая диета практически не влияла на содержание фракционного состава апоВ в суммарной фракции ЛПНП и ЛПОНП, выделенной с помощью препаративного ультрацентрифугирования. Обращает на себя внимание резкое повышение содержания апоВ (как В-100, так и В-48) в группе животных с гипотиреозом. Однако наиболее выраженное увеличение в составе ЛПНП и ЛПОНП обнаружено для апоЕ. По данным денситометрического анализа, увеличение составляло 3,5–4 раза по сравнению с контролем. Интерес вызывает и повышение в составе суммарной фракции апоС, а также апоА-IV, который в группе эутиреоидного контроля присутствовал лишь в следовых количествах.

Таким образом, по результатам иммуноферментного анализа и электрофореза в ПААГ, полученным в настоящей работе, гиперхолестеринемия у гипотиреоидных крыс приводила к повышению содержания апоВ (B-100 и B-48), апоЕ и апоС в составе фракции ЛПНП и ЛПОНП, что может быть обусловлено повышением синтеза этих белков в печени. Другой механизм такой гиперхолестеринемии, по-видимому, обусловлен снижением скорости элиминации ЛПНП и ЛПОНП и, прежде всего, за счет снижения активности и количества В/Е-рецепторов в печени. Подтверждением этому являются исследования, выполненные на крысиных гепатоцитах, которые свидетельствуют об увеличении рецептор-опосредованного эндоцитоза ЛПНП и ЛПОНП под влиянием тиреоидных гормонов [14]. Точный механизм, посредством которого гормоны щитовидной железы влияют на экспрессию печеночных В/Е-рецепторов, неизвестен, однако на сегодняшний день существуют прямые доказательства их участия в активации ядерных тиреоидных рецепторов класса β1 (TRβ1) [9], повышении селективного поглощения ЛПНП и ЛПОНП в печени и поддержания уровня холестерина в плазме крови [13].

Ранее было показано, что повышенный уровень холестерина в крови в сочетании с подавлением функции щитовидной железы обусловил значительные повреждения мышечных клеток сердца, эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток интрамуральных сосудов, эритроцитов животных I и II групп в отсутствие формирования атеросклеротических бляшек и без развития ишемии миокарда [1, 3]. Совокупность данных о структурных преобразованиях миокарда и изменениях липидного метаболизма у крыс при диетарной гиперхолестеринемии на фоне гипотиреоидного статуса свидетельствует об адекватности применения данной экспериментальной модели для изучения молекулярно-клеточных механизмов атеросклеротических повреждений сердца и сосудов.

Рецензенты:

Горчаков В.Н., д.м.н., профессор, зав. лабораторией функциональной морфологии лимфатической системы, ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» Сибирского отделения РАМН, г. Новосибирск;

Сидорова Л.Д., д.м.н., профессор кафедры внутренних болезней Новосибирского государственного медицинского университета МЗ РФ, г. Новосибирск.

Работа поступила в редакцию 10.09.2014.

Библиографическая ссылка